慢病毒濃縮超濾柱

1. 超濾和RO反滲透式凈水機有什麼差異

主要差別：過濾精度和凈水效果
反滲透機和超濾機的主要差別在於過濾精度上。
超濾機的過濾精度大多為0.01納米，配合1微米PP棉濾芯、活性炭濾芯，可以濾除粒徑0.01納米以上的鐵銹、泥沙、細菌、病毒、有機物和漂白粉，在水質較好、無重金屬污染的地區可直接飲用，但一般建議您把水燒開後再飲用。

反滲透凈水機的過濾精度可達到0.0001微米，除上述物質外，還可濾除金屬離子、水溶鹽類，濾出的水近乎純水，可以直接飲用，適合污染嚴重的地區以及對水質要求比較高的用戶
主要差別：廢水率
凈水機在制水的時候要排放一定量的廢水，沖洗濾膜也要消耗一部分水。一般來說，超濾機廢水不多，普通的反滲透機廢水多一些，通常是1:3，即製取1份純水要排掉3份廢水。有些品牌號稱廢水比1:3，實際上有1:4或者1:5，再加上沖洗濾膜的水，廢水比甚至達到1:8甚至1:10！

廢水多，瘮的慌！不僅費錢，還浪費國家寶貴的水資源！

面對廢水率過高的行業困境，歐碧源著力研發新技術，突破行業瓶頸，推出了擁有國家發明專利的微廢水技術，廢水比3:1，製取3份純水只排放1份廢水，比普通RO機節水近90%。廢水率降低後，用水的成本也大大下降，每噸水的成本僅為桶裝水的一半，省錢省心。
次要差別
1、出水流量：
超濾機的出水流量較大，每小時出水60-70L左右。
反滲透凈水機過濾結構細密，市面上普及率最高的50G機型每小時出水僅7.8L。但是，一般這樣的凈水機都配置儲水桶，對於飲用而言用戶的體驗感是一樣的。當然，如果想獲得更好的飲用體驗，可以選用400G大通量反滲透凈水機，每小時出水60L，還能節省櫥櫃空間。

2、價格：
反滲透凈水器濾芯成本高，製作工藝復雜，因此價格比超濾機高。
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2. PEG聚乙二醇濃縮的原理

蛋白質濃縮

濃縮

生物大分子在制備過程中由於過柱純化而樣品變得很稀，為了保存和鑒定的目的，往往需要進行濃縮。常用的濃縮方法的：

減壓加溫蒸發濃縮
通過降低液面壓力使液體沸點降低，減壓的真空度愈高，液體沸點降得愈低，蒸發愈快，此法適用於一些不耐熱的生物大分子的濃縮。
空氣流動蒸發濃縮 空氣的流動可使液體加速蒸發,鋪成薄層的溶液，表面不斷通過空氣流；或將生物大分子溶液裝入透析袋內置於冷室，用電扇對准吹風，使透過膜外的溶劑不沁蒸發，而達到濃縮目的，此法濃縮速度慢，不適於大量溶液的濃縮。
冰凍法 生物大分子在低溫結成冰，鹽類及生物大分子不進入冰內而留在液相中，操作時先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體，然後緩慢地融解，利用溶劑與溶質融點介點的差別而達到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質和酶的鹽溶液用此法濃縮時，不含蛋白質和酶的純冰結晶浮於液面，蛋白質和酶則集中於下層溶液中，移去上層冰塊，可得蛋白質和酶的濃縮液。
吸收法 通過吸收劑直接收除去溶液中溶液分子使之濃縮。所用的吸收劑必需與溶液不起化學反應，對生物大分子不吸附，易與溶液分開。常用的吸收劑有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝膠等，使用聚乙二醇吸收劑時，先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋裡，外加聚乙二醇復蓋置於4度下，袋內溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水飽和後要更換新的直至達到所需要的體積。
超濾法 超濾法是使用一種特別的薄膜對溶液中各種溶質分子進行選擇性過濾的方法，不液體在一定壓力下（氮氣壓或真空泵壓）通過膜時，溶劑和小分子透過，大分子受阻保留，這是近年來發展起來的新方法，最適於生物大分子尤其是蛋白質和酶的濃縮或脫鹽，並具有成本低，操作方便，條件溫和，能較好地保持生物大分子的活性，回收率高等優點。應用超濾法關鍵在於膜的選擇，不同類型和規格的膜，水的流速，分子量截止值（即大體上能被膜保留分子最小分子量值）等參數均不同，必須根據工作需要來選用。另外，超濾裝置形式，溶質成份及性質、溶液濃度等都對超濾效果的一定影響。Diaflo 超濾膜的分子量截留值
膜名稱
分子量截留值
孔的大的平均直徑

XM －300
300，000
140

XM－200
100，000
55

XM－50
50，000
30

PM－30
30，000
22

UM－20
20，000
18

PM－10
10，000
15

UM－2
1，000
12

UM05
500
10

用上面的超濾膜製成空心的纖維管，將很多根這樣的管攏成一束，管的兩端與低離子強度的緩沖液相連，使緩沖液不斷地在管中流動。然後將纖維管浸入待透析的蛋白質溶液中。當緩沖液流過纖維管時，則小分子很易透過膜而擴散，大分子則不能。這就是纖維過濾秀析法，由於透析面積增大，因而使透析時間縮短10倍。

3. 只具有蛋白質的亞病毒如何遺傳

十九世紀以來，已經分離得到了多種引起傳染病的細菌，不過也有一些傳染如口蹄疫，煙花葉病等並不能證實是由細菌引起的，1892年俄國學者伊萬諾夫斯基首次發現煙草花葉病的感染因子能通過細菌濾器，病葉葉汁通過濾器後得到的濾液，可感染健康的煙草現而使之發生花葉病。1898年荷蘭生物學家貝哲林克(M.W.Beijerinck)獨立進行了煙草花葉病病原體的研究，證實這種因子可用乙醇沉澱下來不失去其感染力，而且能在瓊脂凝膠中擴散，但用培養細菌的方法培養不出來，他把這種因子命名為「病毒」，此後，許多學者陸續發現了各種植物動物、細菌、病毒。如：口蹄疫病毒、狂犬病毒、雞肉瘤病毒，黃瓜花葉病毒，以及馬鈴薯X病毒體實質屬於亞病毒，還發現了痢疾志賀氏菌的噬菌體。1935年美國生物化學家Stanley從病葉中分離提出了病毒結晶，該病毒結晶具有致病力。這件事成為分子生物學發展中的一個里程碑 ，Stanley因此榮獲諾貝爾獎，接著進一步揭示了病毒的本質並不是糖蛋白，而是核蛋白。
十九世紀30年代初發明了電鏡，德國的kausche 等（1940）首先用電鏡觀察到TMV的桿狀外形，電鏡技術在病毒學中的應用，使病毒研究進入了分子水平：
Kersheg 和Chase於1952年證明噬菌體遺傳物質是DNA。
Franenkel— conrat 於1955年完成 病毒 折開重建實驗。
Anderer於1960年弄清TMV衣殼蛋白亞基的AA排序。
1965年美國科學家Spiegeman首次在細胞外復制E.coli的RNAa噬菌體成功。 Baltimcre Temin(1970)發現反轉錄酶。
以後相繼發現了亞病毒—類病毒、朊病毒、擬病毒、並相繼測出各種病毒 ，亞病毒的核酸一級的研究。
至今，病毒作為遺傳工程中外源基因載體的研究正在擴大和深入。由此將為人類帶來無法預料的經濟效益；此外病毒學對人類保健、畜牧獸醫、植物保護和發酵工業的關系亦日見重要。
通過以上對病毒學簡史的了解，似乎比較清楚了什麼是病毒但隨著有關病毒學知識的日益增多，新的病毒種類不斷發現，現已把非細胞生物分成病毒和亞病毒。

從上可知，由於亞病毒尤其是朊病毒的發現，使病毒的定義更加難下。我們對病毒所下的定義是：病毒是一類超顯微非細胞生物，每一種病毒只含一種核酸，它們只能在活細胞內營專性寄生。靠其宿主代謝補充，協助來復制核酸合成蛋白質等組分，然後再進行裝配增殖，在離體條件下，能以無生命的化學大分子狀態長期存在並保持其侵染活性。

第一節 病毒

以上已討論過病毒定義，隨著病毒學知識的日益增多，不同學者從不同角度對病毒的基本特性進行了概括，現將病毒區別於其他生物的主要特徵歸納如下：
①形體極其微小，必須在電鏡下才能觀察，一般都具濾過性
②沒有細胞構造，故也稱分子生物
③其主要成分是核酸和蛋白質兩種
④每一種病毒只含一種核酸，不是DNA就是RNA
⑤既無產能系統也無蛋白質合成系統
⑥利用宿主細胞設備進行增殖，不存在個體生長和二均分裂等細胞裂殖方式
⑦在宿主活細胞內營專性寄生
⑧在離體條件下，能以無生命的化學大分子狀態存在，並可形成結晶
⑨對一般抗生素不敏感，但對干擾素敏感
病毒數量是一個急劇上升的變數，其宿主對人類有害或是有益可成災或造福。
一、病毒 形態構造和化學組成
（一）病毒的大小
1.研究方法
病毒大小可採用不同的方法進行研究：
（1）電鏡觀察法，可直接測量病毒大小
（2）分級過慮法：根據病毒能通過哪種孔徑的超濾膜以評估其大小
（3）超速離心沉降法：根據病毒粒子的沉降速度可用來推算病毒粒子的大小和分子量
（4）電泳法：根據電泳速度測病毒粒子的大小，一般來說顆粒越小（相對帶靜電荷多）電泳速度越快。
2.病毒大小
研究表明，病毒比細菌小得多 ，但比多數蛋白質分子大，而且病毒大小相差很遠。直徑在10－300nm之間，通常在100nm左右。
（二）病毒的形態
1.典型病毒粒子的構造
病毒粒子（或稱病毒顆粒）是指成熟的結構完整的單個病毒，病毒粒子的主要成分是核酸和蛋白質，核酸位於病毒粒子的中心，構成了它的核心或基因組，蛋白質包圍在核結構和抗原成分，對核酸有保護作用，在電鏡下可看到，衣殼的形態學亞單位是衣殼粒，有些病毒，核衣殼外還有由類脂或脂蛋白組成的包膜，有時，包膜上還長有刺突等附屬物。
2.病毒粒子的對稱體制
研究表明：由於衣殼粒排列組合的方式不同，使病毒粒子往往表現出來不同的構型和形狀，螺旋對稱能使核酸與Pr亞基間的接觸更為緊密，廿面體對稱有利於核酸以高度捲曲的形式包裹在小體積的衣殼中，另外一些結構復雜的病毒，其衣殼的特點無非是螺旋對稱和廿面體對稱相結合而已，故稱復合對稱。
3.病毒的群體形態
病毒粒子無法用光學顯微鏡觀察，但當它們大量聚集在一起並使宿主細胞發生病變時，就可用光學顯微鏡觀察。如動物、植物細胞中的病毒包涵體，有的還可用肉眼看到，例如噬菌體的噬菌細胞。
（1）包涵體：在某些感染病毒的宿主細胞內，出現光學顯微鏡可見的大小，形態和數量不等的個體，稱包涵體，有的在細胞質內，有的在細胞核內，有的在細胞質、細胞核中都存在的類型，根據包涵體的特點，可把它們分成以下四種類型 ①是病毒的聚集體②是病毒的合成部位③是病毒蛋白和與病毒感染有關的蛋白質④非病毒性包涵體。由化學因子或細菌感染形成。
在實踐上，病毒包涵體主要有兩類應用①病毒診斷②用於生物防治。
（2）噬菌斑
將少量噬菌體與大量宿主細胞混合後，將此混合液與45℃左右的瓊脂培養基在培養皿中充分混勻，鋪平後培養，經數小時至10餘小時後，在平板表面布滿宿主細胞的菌苔土，可以用肉眼看到一個個透亮不長菌的小圓斑，這就是噬斑，每一個噬菌斑一般由一個噬菌體粒子形成的，噬菌斑的形成可用於檢出、分離、純化噬菌體和進行噬菌體的計數。
（3）空斑和病斑：在動物細胞培養物上的與噬菌斑類似的空斑，稱為病斑，因為受腫瘤病毒感染。
（4）枯斑：植物葉片上的植物病毒群體。
（三）三類典型形態的病毒
1.螺旋對稱的代表－煙草花葉（TMV）
TMV是發現最早、研究最深和了解最清楚的一種病毒衣殼粒和核酸呈螺旋對稱形排列，其外形呈直桿狀。
長300nm寬15nm中空（內徑4nm）含Pr95％和SSRNA5％，共有2130個蛋白亞基（衣殼粒）每個亞基由158個AA組成，分子量為17500亞基以逆時針方向螺旋排列共130圈（每圈長2.3 nm有16.33個亞基）SSRNA由6390個核苷酸單位組成，分子量為2*106，盤繞於蛋白質外殼內（因此螺距與Pr螺距相等），每3個核苷酸與一個蛋白亞基結合，因此每圈為49個核苷酸。
以上結構意義穩定，有人試驗用滅毒的「工程TMV」作為茄科植物的疫苗，已取得初步結果。
2.廿面體對稱的代表－腺病毒（Adenovirus）
這是一種動物病毒，看起來象球形，經解析度高的電鏡觀察實際是廿面體，於1953年首次從手術切除小兒扁桃體中分離到。目前已分離到近百種腺病毒。其宿主包括人和各種動物。
核衣殼是由不同數量衣殼粒沿著三根互相垂直的軸形成對稱體，直徑為70－80nm的廿面體，具有20個面，30條邊12個頂角，每個面為等邊三角形，衣殼由252個衣殼粒組成，包括12個五鄰體和240個6鄰體，每個五鄰體上實際突出一根末端帶有頂球蛋白纖維，稱為刺突，病毒核心是dsDNA,所有腺病毒，其基因組的大小都約為36500個核苷酸對。
腺病毒只能培養在人的組織細胞上，不能在雞胚上生長，腺病毒在宿主的細胞核中進行增殖和裝配，並能形成包涵體。
3.復合對稱的代表－T偶數噬菌體
大腸桿菌的T偶數噬菌體共有三種，在自然界分布極廣，它們是分子生物學研究中的極好材料，因此對它們了解極其深刻，尤其是T4早已有十分清晰的電鏡照片和最完整的基因組圖。

T4由頭部、頸部和尾部三部分構成，由於頭部呈廿面體對稱尾部呈螺旋對稱，故是一種復合對稱結構。
尾管中空是頭部核酸注入宿主細胞的通道。
6根尾絲：折成2段Pr構成：具吸附專一性
尾部 6個刺突：吸附功能
T偶數噬菌體雖呈蝌蚪狀，但吸附卻是通過尾絲，尾絲吸附後，會使基板受到構型的刺激，接著尾鞘蛋白發生收縮，使尾管插入宿主細胞。
（四）病毒的化學組成
1.病毒的核酸 2.病毒蛋白質 3.其他化學
二、各類病毒及其繁殖方式
病毒的種類很多，它們繁殖方式即有共性又有各自的特點，這是以噬菌體為重點介紹它們獨特的繁殖方式。
（一）原核生物病毒－噬菌體
1.一般介紹
噬菌體廣泛存在於自然界中，至今在絕大多數原核生物中都發現了相應的噬菌體，至今已作過電鏡觀察的噬菌體至少已有2850種。據Bradley(1967)歸納，噬菌體共有6類形態。
在病毒學研究中E.coli是發現噬體最多，研究最深入的一種宿主，現將它的若干種噬菌體特徵列於表。
2.噬菌體的繁殖
（1）吸附 （2）侵入 （3）增殖
增殖過程包括核酸的復制和蛋白質的生物合成。增殖是通過噬菌體基因表達實現的。
烈性噬菌體的增殖方式按其核酸類型的不同主要分成三類①按早期、次早期和晚期基因的順序來進行轉錄，轉譯和復制的雙鏈DNA噬菌體的增殖方式②按「滾環」模型復制單鏈DNA的增殖方式③按「花朵」模式復制A蛋白衣殼蛋白和復制酶蛋白的增殖方式。以下僅以雙鏈DNA噬菌體的增殖方式為典型代表來加以介紹。

（1）增殖（基因表達）特點：雙鏈DNA噬菌體增殖過程中基因表達的特點
①基因表達有先有後，因此將噬菌體基因分為早期基因，次早期基因、晚期基因
②基因表達順序為早期表達、次早期表達、核酸復制、晚期表達。
③前一次表達的產物是後次基因表達的mRNA聚合霉（其中次早期基因表達的產物還分解宿主DNA霉負責本身DNA復制的DNA聚合霉）
④晚期基因表達的結果是合成了各種整配蛋白（另外還有溶菌霉）
以上介紹的是T偶數噬菌體dsDNA的基因表達過程。噬菌體基因型不同，其基因表達（轉錄、轉譯）都各有特點歸納如下。
3.病毒核酸的復制
（1）雙鏈DNA的復制：核酸以半保留方式進行復制（腺病毒）親代DNA也可做模板轉錄mRNA，復制、轉錄、轉譯均按「中心」法則進行±DNA→±DNA
（2）單鏈DNA的復制：所有單鏈DNA＋DNA先合成互補的－DNA組成±DNA然後以新合成的－DNA為模板合成＋mRNA。最後只包含＋DNA

（3）雙鏈RNA病毒的復制：首先通過半保留方式復制利用其中的「－」鏈產生「＋」RNA，再復制－RNA配成±RNA

（4）＋RNA病毒先復制－RNA組成±RNA，最後只包含＋RNA

（5）－RNA病毒的復制（非侵染性）無侵染性，也不起信使作用所以叫－RNA。

（6）逆轉錄病毒單鏈RNA的復制：由於DNA合成霉的作用，合成－DNA通過－DNA合成±RNA最後以（－）DNA為模板製成＋RNA。

4.病毒核酸的轉錄（以遺傳物質為模板合成mRNA）
雖然宿主細胞能為病毒提供大部分合成條件，但畢竟不是全部，而且某些新的酶是用病毒提供的遺傳信息合成，也即利用病毒感染後所合成的mRNA實現的，因此病毒生物合成的第一步是病毒mRNA的合成。
病毒新mRNA如何正確合成，取決於病毒類型，尤其是它的核酸類型，DNA還是RNA，雙鏈還是單鏈。
（1）含±DNA的病毒，可直接以（－）鏈為模板轉錄為mRNA，±DNA→mRNA如天花病毒，脫病毒，T4噬菌體。
（2）＋DNA病毒。先復制－DNA，再轉錄為mRNA如ΨX174。

(3)含±RNA病毒，可直接以－RNA為模板，轉錄 mRNA

（4）含＋RNA病毒 先合成互補的－RNA組成±RNA，以－RNA為模板轉錄 mRNA，如脊髓灰質炎病毒。

（5）合成－RNA病毒，可在RNA聚合E的作用下，直接轉錄為 mRNA

（4）成熟（裝配）
噬菌體的成熟過程實際上是E合成的各部件的裝配過程，病毒核酸的復制與病毒蛋白質的分開進行的。由分別合成好的核酸與蛋白質組合成完整的新的病毒粒子的過程稱成熟。
具體過程：頭部、尾部、先分裝
（1）裂解（釋放）
（2）成熟的病毒粒子從被感染細胞內轉移到外界的過程稱為病毒的釋放（裂解量）
3.噬菌體效價的測定：指噬菌體是液的濃度。
效價指烈性噬菌體（侵染性）數/ml樣品
一般都用噬菌體法測定指數。
由於試樣中一般噬菌體粒子含量較高，故應先對試樣進行梯級稀釋，然後取選用合適的方法測定其效價。
（1）斑點試驗法

這是一種預試驗方法，只能大概地估計待測樣品效價高低，不能得出准確數據。
（2）液體稀釋管法
4.噬菌體增殖規律的描述方法
一步生長曲線
從裂性噬菌體感染宿主細胞，到新復制的噬菌體粒子經宿主細胞裂解釋放出來的整個過程，稱為烈性噬菌體的生長周期，可用一步生長曲線來表示。
將高濃度的敏感菌培養物與適量相應的噬菌體懸液相混一定時間以離心術或抗病毒血清除去游離的噬菌體後，高度稀釋（以免發生二次吸附感染）致使每個菌體都含一個噬菌體，在適宜的條件下培養，定時取樣，用噬菌斑法測定培養物中噬菌體數目，以培養時間為橫坐標，以噬菌斑數為縱坐標繪成的曲線稱為一步生長曲線。
5.溶源性
（1）溫和噬菌體
不裂解宿主細胞的噬菌體稱為溫和噬菌體，如大腸桿菌噬菌體只將其DNA整合到宿主細胞染色體組上，並可長期隨宿主DNA的復制而進行同步復制。
溫和噬菌體特點①都是dsDNA②溶源菌 含有前噬菌體（溫和噬菌體）的細菌也具有溶源性稱為溶源菌。①細菌的溶源性具有遺傳性，產生的子代細胞也具有溶源性，也是溶源菌。②溶源菌對同源噬菌體具有免疫性，在培養基上形成噬菌斑才可覺查③溶源性細菌在培養中一般不易被查覺，只有用非溶源性敏感菌株混合培養在培養基上形成噬菌斑才可被覺查到。④溶源性細菌有時能失去前噬菌體，而變成非溶源細胞使溶源性復愈⑤自發裂解和誘導裂解：有少數噬菌體可自發誘發裂解宿主細胞⑥溶源性細菌可獲得一些新的生理特性，如日喉桿菌只有在含有－噬菌體時才能產生白喉毒素，引起宿主發病。
噬菌體介紹了以上五方面問題，其中重點介紹了噬菌體的增殖過程，同時對動物、植物病毒的增殖過程與噬菌體增殖的不同點作了介紹。所以以後我們就不再動植物病毒的增殖做特別介紹。
（二）植物病毒
1.概述從病毒學的發展史來看，一些開創性的工作和基礎理論研究成果，首先是在植物病毒領域里取得的，最先發現提純、結晶和電鏡觀察的都是植物病毒，已知的植物病毒多達600種（1983）其中多數是單鏈RNA病毒，具體如表。
植物染毒後，症狀主要有三：①因葉綠體不能行使正常功能而引起花葉、黃化或紅化等症狀②植株發生矮化，從枝或畸形等③形成植斑或壞死等症狀。
2.增殖過程
「侵入」方式（1）借昆蟲刺吸式口器進入（2）通過傷口進入通過胞間連絲或輸導組織迅速向其他部位擴散引起普遍感染（3）不釋放
（三）脊椎動物病毒
1.根據病毒在人體與哺乳動物中普遍存在，其他各類動物、禽類、爬行類和魚類等多種脊椎動物中也廣泛存在著相應的病毒家畜中的口蹄疫、豬瘟、牛瘟、馬傳染性貧血、兔的乳頭狀瘤等都是病毒引起的，家禽中的瘟疫病，兩棲類、魚類的腫瘤、魚痘等 病毒引起的。人類傳染病80％由病毒引起如：流行感冒、肝炎、麻診、水痘、腮腺炎、流行性乙型腦炎、脊髓灰質炎、狂犬病受病毒感染而誘發的，這些病毒病至今還缺少有效的對付手段，大量增殖，導致宿主細胞裂解死亡。
另一些病毒感染動物後，並不致死宿主細胞，而是引起腫瘤。
2.病毒與癌
病毒與腫瘤是人們關心問題之一，早在1908年Ellerman和Bang就觀察到雞的白血病可無菌細胞濾液傳播，1911年美國醫生Rous在研究雞的可轉移腫瘤中，證明雞肉瘤，現在已知病毒能引起許多動物形成腫瘤，人的腫瘤特別是惡性腫瘤已證明不是由病毒引起。但病毒可誘導人產生惡性腫瘤。

動物病毒增殖過程與噬菌體的增殖大致相同。
（四）昆蟲病毒（無脊椎動物病毒）
1.概況
無脊椎動物病毒主要在節肢動物的昆蟲綱中發現，國內外也昆蟲病毒的研究做了大量工作，目前從昆蟲體內分離到的病毒有1671 種（1990）其中80％來自鱗翅目昆蟲。
2.寄生
昆蟲病毒主要寄生在昆蟲的真皮、脂肪組織、血細胞、腸道細胞中，有的在宿主的細胞核中，有的在宿主的細胞質里，大量增殖導致宿主組織破壞、死亡。
二、分類
根據是否形成多角體和多角體的形態及形成部位，可把昆蟲病毒分為以下幾類（包涵體在顯微鏡下呈角狀）。
1.核型多角體病毒 2.質型多角體病毒 3.顆粒體病毒 4.昆蟲痘病

詳細不？

4. 凈水器超濾好還是反滲透好

超濾凈水機通過超濾膜高精度物理凈化工藝，能夠去除水中幾乎所有的泥沙、鐵銹、細菌、可見懸浮物、藻類以及大分子有機物，大多數超濾機都採用前置PP濾芯、超濾濾芯、後置活性炭等三層結構，其中PP濾芯大約3-6個月需要更換，超濾濾芯根據使用情況，壽命也大約能維持12-18個月的使用。
RO反滲透凈水器又被一些廠商稱之為純水機，相較超濾凈水機，它在超濾濾芯之後，還會多加一層RO反滲透膜，這是一種孔徑只有0.1nm的反滲透膜，透過對水分子施加壓力，水分子能夠順利通過膜內，而剩餘的廢水則會透過膜外進行排出。最初，反滲透純水的技術是為了宇宙空間中，宇航員能夠重復使用飲用水，而如今它已經成為了最主流的凈水技術。
正是因為過濾的方式有所差異，要區別RO反滲透凈水機和普通超濾凈水機的方法非常簡單：RO反滲透凈水機需要對水進行施壓，因此在使用中會需要電能，並且過濾後還將有一定的廢水排除，而超濾凈水器本身由於採用自來水自身的水壓進行過濾，因此不需要通電，也不會產生廢水。
相對而言，RO反滲透凈水機在凈水效果方面有絕對的優勢，藉助純凈水導電性較差的特點，我們也能對純水機的性能進行一定程度的監控。或許許多人不知道，雖然水會導電，但這並不是水本身的緣故，而是水中包含的雜質造成的，因此通過檢測水的導電性，我們能輕松掌握水中雜質的多少——而這就是TDS檢測的原理，一支十幾元的TDS檢測筆就能反映出純水的干凈程度，通常RO反滲透過濾機能夠將TDS指標降低至30以下，而超濾後的水質指標幾乎與自來水無異。
因此，要根據自己的需求來選擇，這才是最合適的。

5. 超濾膜凈水器好還是反滲透凈水器好

區別一：RO反滲透凈水效果更好

實際上，超濾和反滲透凈水器的結構是相似的。它們在上半部都上配備了PP棉、活性炭和其他粗濾元件，最後的差別是在超濾膜、反滲透的過濾能力。超濾式凈水器的過濾精度約為0.01-0.1微米，反滲透膜的過濾精度可達0.0001微米，這就好比孔徑大小的篩子做對比，明顯孔距更小的篩子過濾精度更高。

在過濾效果方面，超濾凈水器可去除水中的鐵銹、沉澱物、細菌、病毒、殘余氯、異色氣味，而反滲透凈水器可進一步濾除重金屬物質（如：汞、鉛、銅、鋅、無機砷），但人體所需的鈣和鎂離子也隨廢水一起排出。所以 RO反滲透凈水器的輸出幾乎是純凈水。但是現在RO膜後端可增加弱鹼濾芯，可向水中添加有益人體健康的微量元素，從而解決了這個問題。

區別二：RO反滲透凈水器需要用電

反滲透凈水器通過增加滲透壓來實現純水逆著自然滲透方向的反向運動。它需要高水壓才能「推動」，因為中國自來水水壓較小，所以RO反滲透凈水器要用增壓泵正常工作，因此許多反滲透凈水器需要連接到主電源使用。但是不用擔心，增壓泵只在凈水器工作時工作，功率也較低。

超濾凈水器是物理類型的過濾。超濾凈水器可以在水壓達到標準的區域內通常無壓力地過濾凈化水。此外，一些超濾凈水器採用單濾芯過濾濾器，其在空間佔用和安裝條件方面較低。

區別三：超濾凈水器的出水流量較大

如果沒有加壓，RO反滲透凈水器甚至不會為您生產純凈水，其精細的過濾結構將大大降低水流量。RO膜過水量越大，產水值也越高。例如，一般500G 的RO機出水量是1.3升/每分鍾。而超濾不需要擔心流動問題。它們的水輸出一般為1.5升/每分鍾。如果用水量大，水流量應該是樂觀的。

區別四：RO反滲透凈水器有廢水率

因為RO膜的外表一些殘留物質（如碳酸鈣、硫酸鈣、硅）就會在反滲透膜表面沉積下來，為了防止RO膜堵塞，就需要用水不斷沖洗RO膜。因此你想獲得純凈的健康水，你必須犧牲一定比例的廢水。通常，超濾凈水器的廢水很少，但要記得定期更換凈水器濾芯。

相反，反滲透凈水器為了確保反滲透膜的壽命，增加廢水比可以防止反滲透膜的結垢。通常，反滲透凈水器的廢水率從最早的5：1增長到2：1或甚至1：1，隨著科學技術的不斷發展，廢水率將越來越低。同時，被稱為「廢水」的水也很乾凈，它的純度高於原水，但低於純水，可以用來洗衣服、拖地或沖廁所。

區別五：兩種凈水器的不同適用范圍

如果您的家在惡劣的環境、水污染嚴重，請務必選擇RO反滲透凈水器（凈水器）。凈化效果非常好，非常徹底，其過濾精度非常高，只允許水分子通過，可以有效去除水中的鐵銹、沉積物、大分子有機物、重金屬、細菌、病毒等，出水是純凈水。然而，由於RO凈水器需要使用電力並使用更多的水，因此成本會更高一些。

如果水質不是太差，食品級超濾凈水器就行了。超濾凈水器可去除水中的鐵銹、沉積物、大分子有機物、細菌、病毒等，純物理過濾、無電，只需要自來水壓足夠即可。

無論是RO反滲透凈水器還是超濾凈水器，它們都有優點和缺點。現在水資源受到污染的時代，安全才是我們首選需要考慮的問題。當然，如果您想購買適合自己的凈水器，最重要的是根據您所在地的水質獲得正確的凈水效果。

6. 打狂犬疫苗會不會傳染艾滋病

1983年美國巴斯德研究首次分離到引起艾滋病的病原體HIV，隨後便有人預言對付這種病的疫苗將在兩年之內問世，然而到1987年8月，美國NIAIDS才在巴斯德美國國立衛生院進行了首次HIV候選疫苗的人體試驗。過去的二十幾年，各類抗HIV葯物相繼進入Ⅲ期臨床試驗，並且不斷有新葯上市，而艾滋病疫苗的臨床試驗卻是舉步維艱，進入臨床試驗的候選疫苗研究進展十分緩慢[13]是多方面的。
4.1 艾滋病疫苗研製的一個很大的障礙是艾滋病疫苗相關的免疫機制尚未明了。
對於多數疫苗可預防的疾病，自然發生或疫苗誘生的免疫應答都與抗感染或疾病的保護作用相關。然而，即使多數HIV感染者能產生廣泛的抗病毒免疫應答，這些應答也不能消除感染。就目前所知，HIV特異性免疫應答與低病毒載量有關。低病毒載量不僅能削弱免疫應答，具有逃避免疫應答的特性，還能整合入宿主細胞基因組並在機體的中央神經系統或骨髓神經系統中長期存在，使得機體無法徹底清楚病毒。此外，由於沒有一個人能夠自然清楚HIV病毒或從AIDS痊癒，這使保護人體免受HIV攻擊的有關免疫參數的鑒定和研究變得更加困難[14][15]。
4.2 HIV基因的高度變異性。
HIV病毒基因具有極高的遺傳變異性，並且進化速度相當驚人。首先，HIV-1和HIV-2在基因序列上至少存在25%的差異，兩種HIV又可以根據基因序列的差異分別分為9個和6個亞型，世界各地的主要流行株不同，雖然目前仍缺乏科學證據證實HIV基因遺傳變異性與HIV特異性免疫應答是否有關以及對每個亞型是否需要設計特定的疫苗，但是在設計疫苗時這也是不可忽視的因素。其次，HIV在宿主機體的免疫壓力環境以及葯物選擇壓力下具有高度變異性。HIV的基因片段中鹼基替換的積累、插入、缺失以及核殼蛋白糖基化位點的增加和減少都會導致HIV基因的變異。不同亞型的病毒間也會發生基因重組，產生獨特的循環重組型（CRV），更容易逃避已有的免疫保護。最後，HIV的自身某些機制能逃避宿主免疫系統的攻擊。此外，HIV外膜糖蛋白gp120上的高度變異性V3環和聚糖殘基掩蓋了協同受體結合位點，使得gp120中和抗體和難以結合位點為靶點；同時，具有高度變異性的V3環可發生突變作用，使V3環的構象明顯改變，從而使病毒逃避中和作用，至使單一的gp120疫苗無法保護人體，避免HIV感染[15]。HIV以上的這些特性給疫苗的設計帶來了巨大的挑戰。
4.3 缺乏良好的動物模型。
一個好的動物模型對於病毒的研究和疫苗的研製至關重要，現在還沒有確定的HIV感染的動物模型用於預測HIV疫苗對人體的安全有效性。非洲猴是各種猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus,SIV）的天然宿主，但是非洲猴感染這些病毒後不能發展為臨床疾病。相比之下，印度猴，尤其是印度恆河猴對SIV高度敏感，感染後逐漸發展為人類艾滋病類似的免疫缺陷綜合症。目前疫苗誘導的保護性反應評價都以SIV或SIV與HIV的嵌和病毒（SHIV）感染的印度恆河猴為模型的實驗來評價疫苗效能需要在猴子體內接種大劑量的病毒，相當於5X107SIV RNAcopies/ml，與之相比人體自然感染HIV病毒的濃度要低的多，一般低於103-105HIV RNAcopies/ml。種種跡象表明，設計出的疫苗在動物中的試驗效果與臨床試驗的效果仍有很大差別，尚不清楚是否能通過動物試驗結果預測疫苗在人類中的保護作用，人體保護作用和資料只能來自人臨床試驗。此外，由於一些宗教和政治方面的原因，印度在1978年中止了恆河猴的出口，這也不利於全球對HIV的研究以及對疫苗的開發。
4.4 不能激發免疫記憶。
現在的大多數候選疫苗不能激發機體產生持久的免疫記憶。只要HIV在人體內存在，就能夠緩慢地復制、積累，而沒有免疫記憶的話，針對HIV的特意性CTL和中和抗體會慢慢消失，導致病毒在體內再度爆發。
4.5 HIV感染機體的特點。
HIV感染機體本身的一些特點也使疫苗的研製難度增大：1 HIV侵入人體的主要部位是黏膜，黏膜局部必須有足夠的免疫應答；2 HIV能進入中樞神經，而相應抗體受血腦屏障的阻隔，所以免疫應答不容易建立；3 HIV不同於其他前病毒，它可以前病毒的形式整合進入宿主染色體DNA中，但受整合的細胞表面不表達或僅表達少量的HIV抗原成分，因此採用刺激機體產生抗體的疫苗對此無能為力；4 HIV能通過多核巨細胞的形成而在細胞之間直接擴散，不需接觸血液，所以抗體雖能中和游離病毒，但不能阻止HIV通過細胞-細胞間蔓延[16,17]。
4.6 其他原因。
首先，疫苗必須經過人體臨床試驗，而找到足夠數量的符合條件的志願者很難，並且由於受人權、道德方面的限制，使艾滋病疫苗的人體試驗的進行更加困難；其次，疫苗的開發需要足夠的資金由於開發艾滋病疫苗的艱巨性與不確定性，使很多公司不願意承擔風險來投資疫苗的研發。

7. 本人想搞尿激酶的生產，請求幫助,謝謝！

尿激酶是從男性尿中提取的一種生化葯物，廣泛應用於治療新鮮血栓性閉塞性疾病、肺栓塞、急性腦血栓形成，腦血管栓塞以及視網膜中央靜脈血栓形成。我國由於人口眾多，資源豐富，勞動力價格低廉，因而尿激酶粗品的生產遍及全國各地。在生產的尿激酶粗品中，僅有一部分經過精製成精品出口，不少粗品直接出口，讓外商賺取了大量的利潤。研究純化尿激酶的技術與方法以及提高純化過程中各道工序尿激酶的收率，提高尿激酶產品的高附加值，利用再生資源，出口創匯，利國利民，具有顯著的經濟與社會效益和重要意義。
一、主要材料
尿激酶粗品(硅膠法生產)，甘氨酸(C·P)、硫酸(A·R)、氫氧化鈉(A·R)、鹽酸
(A·R)、磷酸二氫鈉(C·P)、磷酸氫二鈉，疊氮化鈉(A·R)，714樹脂，CM一S。

二、試驗過程與技術條件
(一)解析
1.取尿激酶粗品200克(經測定，比活為325iu/mgP)，懸浮於8倍量的。.SM甘氨酸緩沖液中，尿激酶濃度在45ooiu/ml，維持低溫，攪拌75分鍾，靜置45分鍾，上清液經虹吸與底部沉澱分開。
2.虹吸上清液後的沉澱加入1倍量的甘氨酸緩沖液，處理同上，取上清液.
3.合並兩次上清液，在低溫下緩慢加入SNH:50.調PHlo.。士。.1(取樣測定價).
(二)714樹脂脫色
1.按解析液效價每億單位用1.4kg樹脂上柱，樹脂用蒸餾水洗幾個床體積後備用。
2.將PH10·。的解析液上柱，流速控制在1.8~2.oml/cmZ分，收集流出液，上柱完畢後，，柱用一個床體積的低溫蒸餾水洗滌.
3.合並柱流出液用sNHZSO『調PH為10.0士0.1.
(三)超濾處理
1.將PH為10.。的脫色液用超濾器超濾脫鹽，超濾濃縮至原體積的六分之一左右。
2.濃縮液中加入低溫蒸餾水，稀釋至電導4.smV(10℃)。
3.再次濃縮至六分之一體積。
4.二次濃縮液中加人低溫。.18M、PH6.8磷酸緩沖液及蒸餾水稀釋至原體積，二者加入的比例應使稀釋液電導為4.8士0.lmV(10℃時)。
5.再用SNHZSO.調PH為6.8士0.1。
6.再次校正電導為4.8士。.lmV(10℃)。
(四)CM一S交換凝膠純化(在低溫下進行)
1.CM一S預處理:CM一S用燕餾水浸泡後，分別用Na0H和HCL處理，然後用0.18M、
PH6.8磷酸緩沖液平衡，過濾;平衡過的CM一S懸浮於含0.08%NaN:，0.18M、PH6.8磷酸緩沖液中，低溫冷藏。
2.CM一S吸附
(1)經超濾PH6.8電導4.smV的尿激酸溶液，按skg/億單位加入經平衡的CM一S，攪
拌兩小時，防止起泡，靜置一小時，虹吸去除上清液。
(2)吸附尿激酶的CM一S上有機玻璃柱，防止柱內起泡，柱面平整.
3.洗滌去除雜蛋白
(1)CM一S上柱後用含0.3%NaN3，PH6.8、0.18M磷酸緩沖液洗滌，流速為1.8~
2.。而/cmZ分左右，流至流出液效價低於10oiu/耐，28onm光吸收峰低於。.04E/已。
(2)改用1.SMPH6.8磷酸緩沖液洗滌一個半床體積，流速不變，流出液280nm吸收峰應降至0.03以下。
4.尿激酸洗脫
(1)洗滌完畢後用0.08MP、H8.8磷酸氫二鈉、0.95M氛化鈉緩沖液洗脫，流速。.4ml/cmZ分，測定流出液效價及280nm吸收峰，將有活力流出液合並，使混合液濃度在S000in/ml以上。
(2)混合液調PH6.。~7.0.抽取試樣化驗後，裝於二升的塑料瓶內，乾冰速凍，一22℃以下低溫保存。
(五)尿激酸〔UK)效價和比活的測定
1.測試原理
(1)主要試劑與器材
恆溫水浴鍋、刻度鬧鍾、熒光燈、UK效價坐標紙、牛凝血酶(T)、牛纖維蛋白溶酶原(PG)、牛纖維蛋白(FG)、UK標准品、Barbiton一Na，Tri。，NaZEDTA，Nael
(2)試劑配製
T:牛凝血酶40BP(衛生部葯品生物製品檢驗所)，每支加6.6mlBarbiton一Na緩沖液。
PG:牛纖維蛋白溶酶原22BP(衛生部葯品生物製品檢驗所)，每支加24mlTris緩沖液。
PG一T:取PG6.6nil與配好的6.耐T等體積混勻，放入50血三角燒瓶中，扎口備用。
FG:片纖維蛋白原，12sBP(衛生部葯品生物製品檢驗所)，每支加18mlBarbiton一Na
緩沖液。
(3)標准UK稀釋
將標准品(loooiu/支)用巴比妥溶液稀釋成60in/ml。
(4)繪制標准曲線
①取5時試管4支，作記號並分別加入FGO.3耐;
②分別加入稀釋標准UK溶液0.4、0.3、0.2、0.lm卜
③分別加巴比妥溶液0.6、0.7、0.3、0.9回;
④分別加入0.4mlPG一T，搖勻，立即放入37℃恆溫水溶鍋，記時;
⑤觀察氣泡上升情況，體積一半時記終止時間;
⑥以單位效價為橫坐標，時間為縱坐標，繪制標准曲線，要求至少有三點在一條直線上。
(5)樣品檢測
①繼標准曲線後，在同一條件下，同一試劑情況下，進行樣品檢測;
②分別加FGO.3ml，巴比妥緩沖液0.gml，PG一TO.4mh
③其餘步驟同前。
(6)測O.D值
將加酸後的樣品稀釋10倍，然後測其O·D值。
(7)計算效價與比活
①根據測試樣品的氣泡上升時間，在標准曲線上找出相應的點的效價，乘以20得出樣品
實際效價。
②總效價~單位效價(iu/mDx總體積(ml)
③比活~平均效價xl.75/0·D
2.對產品收率和比活的測定
①對解析液進行總效價和比活測定，結果如下:
總效價:2489萬單位，比活:325iu/mgP
②精製後總效價和比活
總效價:1082萬單位;比活:」660iu/mgP
③精製收率:41%
三、討論
1.尿激酶通常以兩種分子形式存在，即分子量36。。。和54000，大分子量的尿激酶活性
較小分子量尿激酶活性強得多，提高比活，一是要去除雜蛋白，二是要除去小分子量尿激酶。
分離出的小分子量尿激酶可以另作回收純化處理。
2.尿激酶作為一種活性物質，在純化過程中要注意防止失活。我們在研究過程中，先是
熟練地掌握尿激酶效價和比活的測定步驟，然後不斷改變操作條件，通過對每一道工序中影
響尿激酶收率、比活提高因素的研究，逐步摸索出最佳技術條件。
3.對CM一S吸附後的母液及CM一S洗脫液中效價大於200iu/ml的部分要進行超濾鹽
析回收，可用作粗品投料。

用於提取尿激酶的男性尿液，其pH值<6.5，電導為20~3OMO一』，細菌總數<1000
個/ml，用3N氫氧化鈉調pH~8·5一9.加入硅藻土吸附並沉澱後，濾取硅藻土，用清水攪拌洗滌，甩干裝入交換柱，用氨水淋洗，在洗脫液中加入飽和磷酸二鈉,調pH=8.0，再加氯化鈉調電導至22Mn，通過季錢乙基，交聯聚糖凝膠層析柱，再用磷酸緩沖液洗脫，合並流出液與洗脫液，加醋酸調pH一4.2，調電導至16~17Mn一』，通過甲基纖維素層析柱，用氨水洗脫，收集洗脫液，加水透析，經離心分機冷凍乾燥得到尿激酶成品。上述得到的僅為尿激酶粗品，還可用右旋糖配、肝素、人血清白蛋白等加以修飾精製，以增強其生化穩定性，延長在人體內的作用時間。除用上述分離法製取尿激酶外，還可以採用中性蛋白酶降解的辦法製取尿激酶。國外還有採用DNA重組的辦法，在大腸桿菌中培植尿激酶原。在提取尿激酶的同時還可利用剩餘尿液提取人尿白蛋白.

尿激酶屬鹼性蛋白酶無抗原性，無毒性和其它副作用，可臨床用於肺栓塞、冠心病、腦血栓、心肌梗塞、玻璃體混濁、眼底出血、顱內血腫、靜脈栓塞以及急
(慢)性腎小球腎炎等疾病的治療，還可用於治療纖維蛋白沉著引起的疾病，並可用作抗癌輔助葯物。此外，尿激酶還可用來開發保健飲料、太空飲料及化妝品等。作為鄉鎮企業，開發尿激酶產品，不僅投資少，效益高，能耗低，且原料易得，工藝簡單，無毒無害無污染，值得大力提倡.

8. 肝腹水可以治好嗎

肝腹水是肝硬化晚期的典型並發症，一旦出現肝腹水往往代表肝硬化步入了晚期。肝腹水治療情況主要看患者身體情況和治療措施，大多數早發現早治療的肝腹水患者病情可以得到控制，使肝腹水消退，身體達到基本康復。但是，如果出現肝腹水後仍然不積極治療，或者治療方法不恰當，就有可能使病情迅速惡化，甚至導致死亡。
事實證明多數經過專業治療的肝腹水能有效控制，肝腹水治好後只要注意生活細節，保持樂觀的精神狀態，遵循醫囑，防止肝腹水的復發。

9. 凈水器能夠過濾掉水中的病菌嗎

凈水器能夠過濾掉水中的病菌，在家庭使用凈水機對於濾除雜質、有毒物、細菌、病毒、余氯版、化學權物質（苯、有機磷、丙酮、乙醚等）、重金屬（鎘、鉛、汞、鉻、砷等）確實會發揮重要的作用。

對於城市供水而言，凈水器還能有效解決自來水出廠後因為管道輸送原因導致的「最後一公里」污染，以及因為家庭裝修中使用的管道（水具）等「最後一米」污染。

(9)慢病毒濃縮超濾柱擴展閱讀：

在購買凈水器時最好選購「智能多級濾芯更換提示」功能的凈水機。可帶來更長效的優質飲水和安全保障。作為凈水機最核心的部件，反滲透濾芯狀態直接影響出水的品質，所以定期更換是必不可少的。

為保證凈水效果及防止二次污染，凈水機要根據額定出水總凈水量按時更換濾芯。以往人工計算凈水量不準確，目前市場上已有MAX3.0長效技術類型的產品，反滲透核心濾芯壽命延長至3年，高於傳統反滲透濾芯1.5倍。

10. 與化學產品的分離制備相比較，生物大分子的制備有什麼特點

2.1 概述 ? 在自然科學,尤其是生命科學高度發展的今天,蛋白質、酶和核酸等生物大分子的結構與功能的研究是探求生命奧秘的中心課題,而生物大分子結構與功能的研究,必須首先解決生物大分子的制備問題,有能夠達到足夠純度的生物大分子的制備工作為前題,結構與功能的研究就無從談起.然而生物大分子的分離純化與制備是一件十分細致而困難的工作. ? 與化學產品的分離制備相比較,生物大分子的制備有以下主要特點： ? ⑴生物材料的組成極其復雜,常常包含有數百種乃至幾千種化合物. ? ⑵許多生物大分子在生物材料中的含量極微,分離純化的步驟繁多,流程長. ? ⑶許多生物大分子一旦離開了生物體內的環境時就極易失活,因此分離過程中如何防止其失活,就是生物大分子提取制備最困難之處. ? ⑷生物大分子的制備幾乎都是在溶液中進行的,溫度、pH值、離子強度等各種參數對溶液中各種組成的綜合影響,很難准確估計和判斷. ? 生物大分子的制備通常可按以下步驟進行： ? ①確定要制備的生物大分子的目的和要求,是進行科研、開發還是要發現新的物質. ? ②建立相應的可靠的分析測定方法,這是制備生物大分子的關鍵. ? ③通過文獻調研和預備性實驗,掌握生物大分子目的產物的物理化學性質. ? ④生物材料的破碎和預處理. ? ⑤分離純化方案的選擇和探索,這是最困難的過程. ? ⑥生物大分子制備物的均一性（即純度）的鑒定,要求達到一維電泳一條帶,二維電泳一個點,或HPLC和毛細管電泳都是一個峰. ? ⑦產物的濃縮,乾燥和保存. ? ? 分析測定的方法主要有兩類： ? 即生物學和物理、化學的測定方法. ? 生物學的測定法主要有：酶的各種測活方法、蛋白質含量的各種測定法、免疫化學方法、放射性同位素示蹤法等； ? 物理、化學方法主要有：比色法、氣相色譜和液相色譜法、光譜法（紫外／可見、紅外和熒光等分光光度法）、電泳法、以及核磁共振等. ? 實際操作中盡可能多用儀器分析方法,以使分析測定更加快速、簡便. 要了解的生物大分子的物理、化學性質主要有： ? ①在水和各種有機溶劑中的溶解性. ? ②在不同溫度、pH 值和各種緩沖液中生物大分子的穩定性. ? ③固態時對溫度、含水量和凍干時的穩定性. ? ④各種物理性質：如分子的大小、穿膜的能力、帶電的情況、在電場中的行為、離心沉降的表現、在各種凝膠、樹脂等填料中的分配系數. ? ⑤其他化學性質：如對各種蛋白酶、水解酶的穩定性和對各種化學試劑的穩定性. ? ⑥對其他生物分子的特殊親和力. ? 制備生物大分子的分離純化方法多種多樣,主要是利用它們之間特異性的差異,如分子的大小、形狀、酸鹼性、溶解性、溶解度、極性、電荷和與其他分子的親和性等. ? 各種方法的基本原理可以歸納為兩個方面： ? ①利用混合物中幾個組分分配系數的差異,把它們分配到兩個或幾個相中,如鹽析、有機溶劑沉澱、層析和結晶等； ? ②將混合物置於某一物相（大多數是液相）中,通過物理力場的作用,使各組分分配於不同的區域,從而達到分離的目的,如電泳、離心、超濾等. ? 目前純化蛋白質等生物大分子的關鍵技術是電泳、層析和高速與超速離心. ? 2.2 生物大分子制備的前處理 ? 2.2.1 生物材料的選擇 ? 制備生物大分子,首先要選擇適當的生物材料.材料的來源無非是動物、植物和微生物及其代謝產物. ? 選擇的材料應含量高、來源豐富、制備工藝簡單、成本低,盡可能保持新鮮,盡快加工處理. ? 動物組織要先除去結締組織、脂肪等非活性部分,絞碎後在適當的溶劑中提取,如果所要求的成分在細胞內,則要先破碎細胞. ? 植物要先去殼、除脂. ? 微生物材料要及時將菌體與發酵液分開. ? 生物材料如暫不提取,應冰凍保存.動物材料則需深度冷凍保存. ? 2.2.2 細胞的破碎 ? 不同的生物體或同一生物體的不同部位的組織,其細胞破碎的難易不一,使用的方法也不相同,如動物臟器的細胞膜較脆弱,容易破碎,植物和微生物由於具有較堅固的纖維素、半纖維素組成的細胞壁,要採取專門的細胞破碎方法. ? (1)機械法： ? 1) 研磨：將剪碎的動物組織置於研缽或勻漿器中,加入少量石英砂研磨或勻漿. ? 2) 組織搗碎器：這是一種較劇烈的破碎細胞的方法,通常可先用家用食品加工機將組織打碎,然後再用10000r/min～20000r/min的內刀式組織搗碎機(即高速分散器)將組織的細胞打碎. ? (2)物理法： ? 1) 反復凍融法：將待破碎的細胞冷至－15℃到－20℃,然後放於室溫(或40℃)迅速融化,如此反復凍融多次,由於細胞內形成冰粒使剩餘胞液的鹽濃度增高而引起細胞溶脹破碎. ? 2) 超聲波處理法：此法是藉助超聲波的振動力破碎細胞壁和細胞器.破碎微生物細菌和酵母菌時,時間要長一些. ? 3) 壓榨法：這是一種溫和的、徹底破碎細胞的方法.在1000×105Pa～2000×105Pa 的高壓下使細胞懸液通過一個小孔突然釋放至常壓,細胞將徹底破碎. ? 4) 冷熱交替法：從細菌或病毒中提取蛋白質和核酸時可用此法.在90℃左右維持數分鍾,立即放入冰浴中使之冷卻,如此反復多次,絕大部分細胞可以被破碎. ? (3)化學與生物化學方法： ? 1) 自溶法：將新鮮的生物材料存放於一定的pH和適當的溫度下,細胞結構在自身所具有的各種水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下發生溶解,使細胞內含物釋放出來. ? 2) 溶脹法：細胞膜為天然的半透膜,在低滲溶液和低濃度的稀鹽溶液中,由於存在滲透壓差,溶劑分子大量進入細胞,將細胞膜脹破釋放出細胞內含物. ? 3) 酶解法：利用各種水解酶,如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶和酯酶等,於37℃,pH8,處理15分鍾,可以專一性地將細胞壁分解. ? 4) 有機溶劑處理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶劑或SDS（十二烷基硫酸鈉）等表面活性劑處理細胞,可將細胞膜溶解,從而使細胞破裂,此法也可以與研磨法聯合使用. ? ? 2.2.3 生物大分子的提取 ? 「提取」是在分離純化之前將經過預處理或破碎的細胞置於溶劑中,使被分離的生物大分子充分地釋放到溶劑中,並盡可能保持原來的天然狀態不丟失生物活性的過程. ? 影響提取的因素主要有： ? 目的產物在提取的溶劑中溶解度的大小； ? 由固相擴散到液相的難易； ? 溶劑的pH值和提取時間等. ? 通常： ? 極性物質易溶於極性溶劑,非極性物質易溶於非極性溶劑； ? 鹼性物質易溶於酸性溶劑,酸性物質易溶於鹼性溶劑； ? 溫度升高,溶解度加大； ? 遠離等電點的pH值,溶解度增加. ? 提取時所選擇的條件應有利於目的產物溶解度的增加和保持其生物活性. ? ⑴ 水溶液提取： ? 蛋白質和酶的提取一般以水溶液為主.稀鹽溶液和緩沖液對蛋白質的穩定性好,溶解度大,是提取蛋白質和酶最常用的溶劑.用水溶液提取生物大分子應注意的幾個主要影響因素是： ? 1) 鹽濃度（即離子強度）： ? 離子強度對生物大分子的溶解度有極大的影響,有些物質,如DNA-蛋白復合物,在高離子強度下溶解度增加. ? 絕大多數蛋白質和酶,在低離子強度的溶液中都有較大的溶解度,如在純水中加入少量中性鹽,蛋白質的溶解度比在純水時大大增加,稱為「鹽溶」現象.鹽溶現象的產生主要是少量離子的活動,減少了偶極分子之間極性基團的靜電吸引力,增加了溶質和溶劑分子間相互作用力的結果. ? 為了提高提取效率,有時需要降低或提高溶劑的極性.向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其極性降低,增加離子強度（如加入KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4）可以增加溶液的極性. ? ? 2) pH值：蛋白質、酶與核酸的溶解度和穩定性與pH值有關.過酸、過鹼均應盡量避免,一般控制在pH=6～8范圍內,提取溶劑的pH應在蛋白質和酶的穩定范圍內,通常選擇偏離等電點的兩側. ? 3) 溫度：為防止變性和降解,制備具有活性的蛋白質和酶,提取時一般在0℃～5℃的低溫操作. ? 4) 防止蛋白酶或核酸酶的降解作用：加入抑制劑或調節提取液的pH、離子強度或極性等方法使相應的水解酶失去活性,防止它們對欲提純的蛋白質、酶及核酸的降解作用. ? 5) 攪拌與氧化：攪拌能促使被提取物的溶解,一般採用溫和攪拌為宜,速度太快容易產生大量泡沫,增大了與空氣的接觸面,會引起酶等物質的變性失活.因為一般蛋白質都含有相當數量的巰基,有些巰基常常是活性部位的必需基團,若提取液中有氧化劑或與空氣中的氧氣接觸過多都會使巰基氧化為分子內或分子間的二硫鍵,導致酶活性的喪失.在提取液中加入少量巰基乙醇或半胱氨酸以防止巰基氧化. ? ⑵ 有機溶劑提取 ? 一些和脂類結合比較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質和酶難溶於水、稀鹽、稀酸、或稀鹼中,常用不同比例的有機溶劑提取. ? 常用的有機溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、正丁酮等,這些溶劑可以與水互溶或部分互溶,同時具有親水性和親脂性. ? 有些蛋白質和酶既溶於稀酸、稀鹼,又能溶於含有一定比例的有機溶劑的水溶液中,在這種情況下,採用稀的有機溶液提取常常可以防止水解酶的破壞,並兼有除去雜質提高純化效果的作用. 例如,胰島素（見講義p36）. ? 2.3 生物大分子的分離純化 ? 由於生物體的組成成分是如此復雜,數千種乃至上萬種生物分子又處於同一體系中,因此不可能有一個適合於各類分子的固定的分離程序,但多數分離工作關鍵部分的基本手段是相同的. ? 為了避免盲目性,節省實驗探索時間,要認真參考和借鑒前人的經驗,少走彎路.常用的分離純化方法和技術有： ? 沉澱法（包括：鹽析、有機溶劑沉澱、選擇性沉澱等）、離心、吸附層析、凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析、快速制備型液相色譜以及等電聚焦制備電泳等.本章以介紹沉澱法為主. ? 2.3.1 沉澱法 ? 沉澱是溶液中的溶質由液相變成固相析出的過程.沉澱法（即溶解度法）操作簡便,成本低廉,不僅用於實驗室中,也用於某些生產目的的制備過程,是分離純化生物大分子,特別是制備蛋白質和酶時最常用的方法.通過沉澱,將目的生物大分子轉入固相沉澱或留在液相,而與雜質得到初步的分離. ? 其基本原理是根據不同物質在溶劑中的溶解度不同而達到分離的目的,不同溶解度的產生是由於溶質分子之間及溶質與溶劑分子之間親和力的差異而引起的,溶解度的大小與溶質和溶劑的化學性質及結構有關,溶劑組分的改變或加入某些沉澱劑以及改變溶液的pH值、離子強度和極性都會使溶質的溶解度產生明顯的改變. ? 在生物大分子制備中最常用的幾種沉澱方法是： ? ⑴中性鹽沉澱（鹽析法）：多用於各種蛋白質和酶的分離純化. ? ⑵有機溶劑沉澱：多用於蛋白質和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分離純化. ? ⑶選擇性沉澱（熱變性沉澱和酸鹼變性沉澱）：多用於除去某些不耐熱的和在一定pH值下易變性的雜蛋白. ? ⑷等電點沉澱：用於氨基酸、蛋白質及其他兩性物質的沉澱,但此法單獨應用較少,多與其他方法結合使用. ? ⑸有機聚合物沉澱： 是發展較快的一種新方法, 主要使用PEG聚乙二醇（Polyethyene glycol）作為沉澱劑. ? 2.3.1.1 中性鹽沉澱（鹽析法） ? 在溶液中加入中性鹽使生物大分子沉澱析出的過程稱為「鹽析」.除了蛋白質和酶以外,多肽、多糖和核酸等都可以用鹽析法進行沉澱分離. ? 鹽析法應用最廣的還是在蛋白質領域,已有八十多年的歷史,其突出的優點是： ? ①成本低,不需要特別昂貴的設備. ? ②操作簡單、安全. ? ③對許多生物活性物質具有穩定作用. ? ⑴ 中性鹽沉澱蛋白質的基本原理 ? 蛋白質和酶均易溶於水,因為該分子的－COOH、－NH2和－OH都是親水基團,這些基團與極性水分子相互作用形成水化層,包圍於蛋白質分子周圍形成1nm～100nm顆粒的親水膠體,削弱了蛋白質分子之間的作用力,蛋白質分子表面極性基團越多,水化層越厚,蛋白質分子與溶劑分子之間的親和力越大,因而溶解度也越大.親水膠體在水中的穩定因素有兩個：即電荷和水膜.因為中性鹽的親水性大於蛋白質和酶分子的親水性,所以加入大量中性鹽後,奪走了水分子,破壞了水膜,暴露出疏水區域,同時又中和了電荷,破壞了親水膠體,蛋白質分子即形成沉澱.鹽析示意圖如下頁「圖 4」所示. ? ⑵ 中性鹽的選擇 ? 常用的中性鹽中最重要的是（NH4）2SO4,因為它與其他常用鹽類相比有十分突出的優點： ? 1) 溶解度大：尤其是在低溫時仍有相當高的溶解度,這是其他鹽類所不具備的.由於酶和各種蛋白質通常是在低溫下穩定,因而鹽析操作也要求在低溫下（0～4℃）進行.由下表可以看到, 硫銨在0℃時的溶解度,遠遠高於其它鹽類： ? 表2-1 幾種鹽在不同溫度下的溶解度（克/100毫升水） ? 0℃ 20℃ 80℃ 100 ℃ （NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103 ? Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2 ? NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 101 ? ? ? ? ? 2) 分離效果好：有的提取液加入適量硫酸銨 鹽析,一步就可以除去75％的雜蛋白,純 度提高了四倍. ? 3) 不易引起變性,有穩定酶與蛋白質結構的 作用.有的酶或蛋白質用2～3mol/L濃度的 （NH4）2SO4保存可達數年之久. ? 4) 價格便宜,廢液不污染環境. ? ⑶ 鹽析的操作方法 ? 最常用的是固體硫酸銨加入法.將其研成細粉,在攪拌下緩慢均勻少量多次地加入,接近計劃飽和度時,加鹽的速度更要慢一些,盡量避免局部硫酸銨濃度過大而造成不應有的蛋白質沉澱.鹽析後要在冰浴中放置一段時間,待沉澱完全後再離心與過濾. ? 在低濃度硫酸銨中鹽析可採用離心分離,高濃度硫酸銨常用過濾方法. ? 各種飽和度下需加固體硫酸銨的量可由附錄中查出. ? ⑷ 鹽析曲線的製作 ? 如果要分離一種新的蛋白質和酶,沒有文獻數據可以借鑒,則應先確定沉澱該物質的硫酸銨飽和度.具體操作方法如下(講義p39)： 蛋白質量(mg)或酶活力 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫銨飽 和度％ ? ⑸鹽析的影響因素 ? 1) 蛋白質的濃度：高濃度的蛋白質用稍低的硫酸銨飽和度沉澱,若蛋白質濃度過高,易產生各種蛋白質的共沉澱作用.低濃度的蛋白質,共沉澱作用小,但回收率降低.較適中的蛋白質濃度是2.5％～3.0％,相當於25 mg/mL～30mg/mL. ? 2) pH值對鹽析的影響：在等電點處溶解度小,pH值常選在該蛋白質的等電點附近. ? 3) 溫度的影響：對於蛋白質、酶和多肽等生物大分子,在高離子強度溶液中,溫度升高,它們的溶解度反而減小.在低離子強度溶液或純水中蛋白質的溶解度大多數還是隨濃度升高而增加的.一般情況下,可在室溫下進行.但對於某些對溫度敏感的酶,要求在0℃～4℃下操作,以避免活力喪失. ? ? 2.3.1.2 有機溶劑沉澱法 ? ⑴基本原理 ? 有機溶劑對於許多蛋白質（酶）、核酸、多糖和小分子生化物質都能發生沉澱作用,是較早使用的沉澱方法之一.其原理主要是： ? ①降低水溶液的介電常數,向溶液中加入有機溶劑能降低溶液的介電常數,減小溶劑的極性,從而削弱了溶劑分子與蛋白質分子間的相互作用力,導致蛋白質溶解度降低而沉澱. ? ②由於使用的有機溶劑與水互溶,它們在溶解於水的同時從蛋白質分子周圍的水化層中奪走了水分子,破壞了蛋白質分子的水膜,因而發生沉澱作用. ? ? 有機溶劑沉澱法的優點是： ? ①分辨能力比鹽析法高,即一種蛋白質或其他溶質只在一個比較窄的有機溶劑濃度范圍內沉澱. ? ②沉澱不用脫鹽,過濾比較容易（如有必要,可用透析袋脫有機溶劑）.因而在生化制備中有廣泛的應用. ? 其缺點是對某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活,操作需在低溫下進行. ? ⑵有機溶劑的選擇和濃度的計算 ? 用於生化制備的有機溶劑的選擇首先是要能與水互溶.沉澱蛋白質和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮. ? 為了獲得沉澱而不著重於進行分離,可用溶液體積的倍數：如加入一倍、二倍、三倍原溶液體積的有機溶劑,來進行有機溶劑沉澱. ? ⑶有機溶劑沉澱的影響因素 ? 1) 溫度：多數生物大分子如蛋白質、酶和核酸在有機溶劑中對溫度特別敏感,溫度稍高就會引起變性,且有機溶劑與水混合時產生放熱反應,因此必須預冷,操作要在冰鹽浴中進行,加入有機溶劑時必須緩慢且不斷攪拌以免局部過濃. ? 一般規律是溫度越低,得到的蛋白質活性越高. ? 2) 樣品濃度：低濃度樣品回收率低,要使用比例更大的有機溶劑進行沉澱.高濃度樣品,可以節省有機溶劑,減少變性的危險,但雜蛋白的共沉澱作用大. ? 通常使用5mg/mL～20mg/mL的蛋白質初濃度為宜. ? ? 3) pH值：選擇在樣品穩定的pH值范圍內,通常是選在等電點附近,從而提高此沉澱法的分辨能力. ? 4) 離子強度：鹽濃度太大或太小都有不利影響,通常鹽濃度以不超過5％為宜,使用乙醇的量也以不超過原蛋白質水溶液的2倍體積為宜,少量的中性鹽對蛋白質變性有良好的保護作用,但鹽濃度過高會增加蛋白質在水中的溶解度,降低了沉澱效果,通常是在低濃度緩沖液中沉澱蛋白質. ? 沉澱所得的固體樣品,如果不是立即溶解進行下一步的分離,則應盡可能抽干沉澱,減少其中有機溶劑的含量,如若必要可以裝透析袋透析脫有機溶劑,以免影響樣品的生物活性. ? 2.3.1.3 選擇性變性沉澱法 ? 這一方法是利用生物大分子與非目的生物大分子在物理化學性質等方面的差異,選擇一定的條件使雜蛋白等非目的物變性沉澱而得到分離提純. ? ⑴ 熱變性 ? 利用生物大分子對熱的穩定性不同,加熱升高溫度使非目的生物大分子變性沉澱而保留目的物在溶液中. ? ⑵ 表面活性劑和有機溶劑變性 ? 使那些對表面活性劑和有機溶劑敏感性強的雜蛋白變性沉澱.通常在冰浴或冷室中進行. ? ⑶ 選擇性酸鹼變性 ? 利用對pH值的穩定性不同而使雜蛋白變性沉澱.通常是在分離純化流程中附帶進行的分離純化步驟. ? 2.3.1.4 等電點沉澱法 ? 利用具有不同等電點的兩性電解質,在達到電中性時溶解度最低,易發生沉澱,從而實現分離的方法.氨基酸、蛋白質、酶和核酸都是兩性電解質,可以利用此法進行初步的沉澱分離. ? 由於許多蛋白質的等電點十分接近,而且帶有水膜的蛋白質等生物大分子仍有一定的溶解度,不能完全沉澱析出,因此,單獨使用此法解析度較低,因而此法常與鹽析法、有機溶劑沉澱法或其他沉澱劑一起配合使用,以提高沉澱能力和分離效果. ? 此法主要用於在分離純化流程中去除雜蛋白,而不用於沉澱目的物. ? 2.3.1.5 有機聚合物沉澱法 ? 有機聚合物是六十年代發展起來的一類重要的沉澱劑,最早應用於提純免疫球蛋白和沉澱一些細菌和病毒.近年來廣泛用於核酸和酶的純化.其中應用最多的是 「聚乙二醇」【HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH (n ＞4)】( Polyethylene Glycol 簡寫為 PEG ),它的親水性強,溶干水和許多有機溶劑,對熱穩定,有廣泛圍的分子量,在生物大分子制備中,用的較多的是分子量為6000～20000的 PEG. ? 本方法的優點是： ? ①操作條件溫和,不易引起生物大分子變性. ? ②沉澱效能高,使用很少量的P「EG即可以沉澱相當多 的生物大分子. ? ③沉澱後有機聚合物容易去除. ? 2.3.2 透析 ? 自Thomas Graham 1861年發明透析方法至今已有一百多年.透析已成為生物化學實驗室最簡便最常用的分離純化技術之一.在生物大分子的制備過程中,除鹽、除少量有機溶劑、除去生物小分子雜質和濃縮樣品等都要用到透析的技術. ? 透析只需要使用專用的半透膜即可完成.保留在透析袋內未透析出的樣品溶液稱為「保留液」,袋（膜）外的溶液稱為「滲出液」或「透析液」.截留分子量MwCO通常為1萬左右. ? 用1％ BaCl2檢查(NH4)2SO4,用1％ AgNO3 檢查NaCl、KCl等. ? 2.3.3 超濾 ? 超過濾即超濾,自20年代問世後,直至60年代以來發展迅速,很快由實驗室規模的分離手段發展成重要的工業單元操作技術.超濾現已成為一種重要的生化實驗技術,廣泛用於含有各種小分子溶質的各種生物大分子（如蛋白質、酶、核酸等）的濃縮、分離和純化. ? 超濾是一種加壓膜分離技術,即在一定的壓力下,使小分子溶質和溶劑穿過一定孔徑的特製的薄膜,而使大分子溶質不能透過,留在膜的一邊,從而使大分子物質得到了部分的純化. ? 超濾根據所加的操作壓力和所用膜的平均孔徑的不同,可分為微孔過濾、超濾和反滲透三種. ? 微孔過濾所用的操作壓通常小於4×104Pa,膜的平均孔徑為500埃～14微米（1微米＝104埃）,用於分離較大的微粒、細菌和污染物等. ? 超濾所用操作壓為4×104Pa～7×105Pa,膜的平均孔徑為10—100埃,用於分離大分子溶質. ? 反滲透所用的操作壓比超濾更大,常達到35×105Pa～140×105Pa,膜的平均孔徑最小,一般為10埃以下,用於分離小分子溶質,如海水脫鹽,制高純水等. ? 超濾技術的優點是操作簡便,成本低廉,不需增加任何化學試劑,尤其是超濾技術的實驗條件溫和,與蒸發、冰凍乾燥相比沒有相的變化,而且不引起溫度、pH的變化,因而可以防止生物大分子的變性、失活和自溶. ? 在生物大分子的制備技術中,超濾主要用於生物大分子的脫鹽、脫水和濃縮等. ? 超濾法也有一定的局限性,它不能直接得到乾粉制劑.對於蛋白質溶液,一般只能得到10～50％的濃度. ? 超濾技術的關鍵是膜. ? 常用的膜是由乙酸纖維或硝酸纖維或此二者的混合物製成.近年來發展了非纖維型的各向異性膜,例如聚碸膜、聚碸醯胺膜和聚丙烯腈膜等.這種膜在pH 1～14都是穩定的,且能在90℃下正常工作.超濾膜通常是比較穩定的,能連續用1～2年. ? 超濾膜的基本性能指標：水通量（cm3/(cm2?h)）；截留率（以百分率％表示）；化學物理穩定性（包括機械強度）等. ? 超濾裝置由若干超濾組件構成.分為板框式、管式、螺旋卷式和中空纖維式四種主要類型. ? 由於超濾法處理的液體多數是含有水溶性生物大分子、有機膠體、多糖及微生物等.這些物質極易粘附和沉積於膜表面上,造成嚴重的濃差極化和堵塞,這是超濾法最關鍵的問題,要克服濃差極化,通常可加大液體流量,加強湍流和加強攪拌. ? 2.3.4 冰凍乾燥 ? 冰凍乾燥機是生化與分子生物學實驗室必備的儀器之一,因為大多數生物大分子分離純化後的最終產品多數是水溶液,要從水溶液中得到固體產品,最好的辦法就是冰凍乾燥