從陽離子交換柱中洗脫蛋白質

Ⅰ 離子交換柱的工作原理

離子交換柱的工作原理：
採用離子交換方法，可以把水中呈離子態的陽、陰離子去除。
以氯化鈉（NaCl）代表水中無機鹽類，水質除鹽的基本反應可以用下列方程式表達：
1、陽離子交換樹脂：R—H+Na+→R-Na+H+
2、陰離子交換樹脂：R—OH+CL-→R-CL+OH+
陽、陰離子交換樹脂總的反應式即可寫成：
RH+ROH+NaCL—RNa+RCL+H2O
由此可看出，水中的Nacl已分別被樹脂上的H+和OH-所取代，而反應生成物只有H2O，故達到了去除水中鹽的作用。
離子交換柱（ion exchange column）是用來進行離子交換反應的柱狀壓力容器。充填有離子交換樹脂的細長管柱。可由玻璃、不銹鋼、有機玻璃等不被所用的流動相腐蝕的材料製成。離子交換柱（混床）的分類：混床按再生方式分可分為體內再生混床、體外再生混床、陰樹脂外移再生混床三種。
離子交換柱的分類：
混床按再生方式分可分為體內再生混床、體外再生混床、陰樹脂外移再生混床三種。
1、體外再生混床適合小流量、對環保有嚴格要求的企業。但由於體外再生式混床配套設備多，操作復雜，現在已很少使用。
2、體內再生混床和陰樹脂外移再生混床適合大流量，有專門的水處理操作人員及廢水處理的場合。體內再生混床在運行及整個再生過程均在混床內進行，再生時樹脂不移出設備以外，且陽、陰樹脂同時再生，因此所需附屬設備少，操作簡便。
3、陰樹脂外移再生混床：陰樹脂外移再生式混合床及其配套的陰樹脂再生柱基本構造與小型逆流再生固定床大致相同，陰樹脂再生柱厚度較混合床小，所需的膨脹高度為樹脂層高度的50%～60%，故再生柱可較低，但一般為統一起見做成與混合床相同。

Ⅱ 蛋白質水解產物陽離子交換柱層析時的洗脫順序

pI 10.76的那個應該帶正電荷。陽離子交換柱本身帶負電荷。

Ⅲ 蛋白質分離提純方法

1、鹽析法：

鹽析法的根據是蛋白質在稀鹽溶液中，溶解度會隨鹽濃度的增高而上升，但當鹽濃度增高到一定數值時，使水活度降低，進而導致蛋白質分子表面電荷逐漸被中和，水化膜逐漸被破壞，最終引起蛋白質分子間互相凝聚並從溶液中析出。

2、有機溶劑沉澱法：

有機溶劑能降低蛋白質溶解度的原因有二：其一、與鹽溶液一樣具有脫水作用；其二、有機溶劑的介電常數比水小，導致溶劑的極性減小。

3、蛋白質沉澱劑：

蛋白質沉澱劑僅對一類或一種蛋白質沉澱起作用，常見的有鹼性蛋白質、凝集素和重金屬等。

4、聚乙二醇沉澱作用：

聚乙二醇和右旋糖酐硫酸鈉等水溶性非離子型聚合物可使蛋白質發生沉澱作用。

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吸附層析

1、吸附柱層析

吸附柱層析是以固體吸附劑為固定相，以有機溶劑或緩沖液為流動相構成柱的一種層析方法。

2、薄層層析

薄層層析是以塗布於玻板或滌綸片等載體上的基質為固定相，以液體為流動相的一種層析方法。這種層析方法是把吸附劑等物質塗布於載體上形成薄層，然後按紙層析操作進行展層。

3、聚醯胺薄膜層析

聚醯胺對極性物質的吸附作用是由於它能和被分離物之間形成氫鍵。這種氫鍵的強弱就決定了被分離物與聚醯胺薄膜之間吸附能力的大小。

層析時，展層劑與被分離物在聚醯胺膜表面競爭形成氫鍵。因此選擇適當的展層劑使分離在聚醯胺膜表面發生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的連續過程，就能導致分離物質達到分離目的。

Ⅳ 蛋白掛在陽離子交換柱上洗脫不下來，怎麼辦

疏水層析目的蛋白結合太緊，一般需要降低疏水作用，可以考慮降低結合時中性鹽的濃度。使用疏水力較弱的層析填料，比如丁基疏水、辛基疏水的填料。 洗脫時可以用蒸餾水直接洗脫，如果還是那以洗脫的話可以嘗試添加低濃度乙醇

Ⅳ 離子交換柱的工作原理是什麼

離子復交換柱的原理制

採用離子交換方法，可以把水中呈離子態的陽、陰離子去除，以氯化鈉（NaCl）代表水中無機鹽類，水質除鹽的基本反應可以用下列方程式表達：

1、陽離子交換樹脂：R—H+Na+→R-Na+H+

2、陰離子交換樹脂：R—OH+CL-→R-CL+OH+

陽、陰離子交換樹脂總的反應式即可寫成：

RH+ROH+NaCL—RNa+RCL+H2O

由此可看出，水中的Nacl已分別被樹脂上的H+和OH-所取代，而反應生成物只有H2O，故達到了去除水中鹽的作用。

3、混合離子交換柱（混床）：混床是裝陽、陰樹脂按一定比例（一般為1:2,以便陽、陰樹脂同時達到交換終點而同時再生）裝入混合柱而成，實際上它組合成了水中的H+和OH-立即生成電離度很小的水分子（H2O）,幾乎不存在陽床或陰床交換時產生的逆交換現象，故可以使交換反應進行得十分徹底，因而混合床的出水水質優於陽、陰床串聯組成的復床所能達到的水質，能製取純度相當高的成品水。

Ⅵ 蛋白質分離純化的四種方法

1、鹽析法：

鹽析法的根據是蛋白質在稀鹽溶液中，溶解度會隨鹽濃度的增高而上升，但當鹽濃度增高到一定數值時，使水活度降低，進而導致蛋白質分子表面電荷逐漸被中和，水化膜逐漸被破壞，最終引起蛋白質分子間互相凝聚並從溶液中析出。

2、有機溶劑沉澱法：

有機溶劑能降低蛋白質溶解度的原因有二：其一、與鹽溶液一樣具有脫水作用；其二、有機溶劑的介電常數比水小，導致溶劑的極性減小。

3、蛋白質沉澱劑：

蛋白質沉澱劑僅對一類或一種蛋白質沉澱起作用，常見的有鹼性蛋白質、凝集素和重金屬等。

4、聚乙二醇沉澱作用：

聚乙二醇和右旋糖酐硫酸鈉等水溶性非離子型聚合物可使蛋白質發生沉澱作用。

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蛋白質是生命的物質基礎，是有機大分子，是構成細胞的基本有機物，是生命活動的主要承擔者。沒有蛋白質就沒有生命。氨基酸是蛋白質的基本組成單位。它是與生命及與各種形式的生命活動緊密聯系在一起的物質。

機體中的每一個細胞和所有重要組成部分都有蛋白質參與。蛋白質占人體重量的16%~20% ，即一個60kg重的成年人其體內約有蛋白質9.6~12kg。

人體內蛋白質的種類很多，性質、功能各異，但都是由20多種氨基酸（Amino acid）按不同比例組合而成的，並在體內不斷進行代謝與更新。

Ⅶ 離子交換層析中流出物質順序是什麼

若用離子交換層析分離物質，以蛋白質為例，離子交換層析中，基質是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱之陰離子交換樹脂；而帶有負電荷的稱之陽離子樹脂。離子交換層析同樣可以用於蛋白質的分離純化。

由於蛋白質也有等電點，當蛋白質處於不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質，所以這類蛋白質被留在柱子上，然後通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質洗脫下來。結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來。

反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質，結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。

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對於離子交換纖維素要用流水洗去少量碎的不易沉澱的顆粒，以保證有較好的均勻度，對於已溶脹好的產品則不必經這一步驟。

溶脹的交換劑使用前要用稀酸或稀鹼處理，使之成為帶H+或OH-的交換劑型。陰離子交換劑常用「鹼-酸-鹼」處理，使最終轉為-OH-型或鹽型交換劑；對於陽離子交換劑則用「酸-鹼-酸」處理，使最終轉為-H-型交換劑。

梯度不要上升太快，要恰好使移動的區帶在快到柱末端時達到解吸狀態。目的物的過早解吸，會引起區帶擴散；而目的物的過晚解吸會使峰形過寬。

Ⅷ 求離子交換色譜法分離蛋白質試驗步驟

離線pH梯度復-強陽離子交換色譜法制分離肽段混合物 這篇文獻能否幫助您？
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緩沖液和洗脫液最好一致。你自己查文獻看看選吧。

Ⅸ 怎樣利用離子交換柱層析法分離不同的蛋白質

離子交換柱層析法的核心在於不同的蛋白質的等電點不同
所以說，利用版離子交換柱層析法分離不同的權蛋白質其實就是利用不同蛋白質不同的等電點來分離。比如目的蛋白等電點是5，那麼在環境pH為8.0的情況下，目的蛋白可以結合陰離子交換層析，而雜蛋白可能不能結合或者結合能力比目的蛋白弱。通過不同的鹽濃度的洗脫讓結合能力不同的蛋白在不同的組分被洗脫出來，最終完成對目的蛋白和雜蛋白的分離。

Ⅹ 如何除去溶液中的蛋白質

（一）水溶液提取法

稀鹽和緩沖系統的水溶液對蛋白質穩定性好、溶解度大、是提取蛋白質最常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1-5倍，提取時需要均勻的攪拌，以利於蛋白質的溶解。提取的溫度要視有效成份性質而定。一方面，多數蛋白質的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利於溶解，縮短提取時間。但另一方面，溫度升高會使蛋白質變性失活，因此，基於這一點考慮提取蛋白質和酶時一般採用低溫（5度以下）操作。為了避免蛋白質提以過程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
下面著重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇。
1、pH值
蛋白質，酶是具有等電點的兩性電解質，提取液的pH值應選擇在偏離等電點兩側的pH
范圍內。用稀酸或稀鹼提取時，應防止過酸或過鹼而引起蛋白質可解離基團發生變化，從而導致蛋白質構象的不可逆變化，一般來說，鹼性蛋白質用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質用偏鹼性的提取液。
2、鹽濃度
稀濃度可促進蛋白質的溶，稱為鹽溶作用。同時稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質部分結合，具有保護蛋白質不易變性的優點，因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽，一般以0.15摩爾。升濃度為宜。緩沖液常採用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。
（二）有機溶劑提取法
一些和脂質結合比較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質和酶，不溶於水、稀鹽溶液、稀酸或稀鹼中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑，它們具的一定的親水性，還有較強的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必須在低溫下操作。丁醇提取法對提取一些與脂質結合緊密的蛋白質和酶特別優越，一是因為丁醇親脂性強，特別是溶解磷脂的能力強；二是丁醇兼具親水性，在溶解度范圍內（度為10%，40度為6.6%）不會引起酶的變性失活。另外，丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣，也適用於動植物及微生物材料。
二、蛋白質的分離純化
蛋白質的分離純化方法很多，主要有：
（一）根據蛋白質溶解度不同的分離方法
1、蛋白質的鹽析
中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質的溶解度增加，此稱鹽溶；當鹽濃度繼續升高時，蛋白質的溶解度不同程度下降並先後析出，這種現象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO4和NH4)有很強的水化力，可奪取蛋白質分子的水化層，使之「失水」，於是蛋白質膠粒凝結並沉澱析出。鹽析時若溶液pH在蛋白質等電點則效果更好。由於各種蛋白質分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調節混合蛋白質溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質分段沉澱。
影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對溫度敏感的蛋白質在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進行。一般溫度低蛋白質溶介度降低。但有的蛋白質（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時溶解度低，更容易鹽析。（2）pH值：大多數蛋白質在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低。（3）蛋白質濃度：蛋白質濃度高時，欲分離的蛋白質常常夾雜著其他蛋白質地一起沉澱出來（共沉現象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質含量在2.5-3.0%。
蛋白質鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。
其中應用最多的硫酸銨，它的優點是溫度系數小而溶解度大（25度時飽和溶液為4.1M，即767克/升；0度時飽和溶解度為3.9M，即676克/升），在這一溶解度范圍內，許多蛋白質和酶都可以鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質變性。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間，當用其他pH值進行鹽析時，需用硫酸或氨水調節。
蛋白質在用鹽析沉澱分離後，需要將蛋白質中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質溶液裝入秀析袋內（常用的是玻璃紙），用緩沖液進行透析，並不斷的更換緩沖液，因透析所需時間較長，所以最好在低溫中進行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽，所用的時間就比較短。
2、等電點沉澱法
蛋白質在靜電狀態時顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質的等電點有差別，可利用調節溶液的pH達到某一蛋白質的等電點使之沉澱，但此法很少單獨使用，可與鹽析法結合用。
3、低溫有機溶劑沉澱法
用與水可混溶的有機溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數蛋白質溶解度降低並析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質較易變性，應在低溫下進行。
（二）根據蛋白質分子大小的差別的分離方法
1、透析與超濾
透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質分開。
超濾法是利用高壓力或離心力，強使水和其他小的溶質分子通過半透膜，而蛋白質留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質。
2、凝膠過濾法
也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadex
ged）和瓊脂糖凝膠（agarose gel）。
（三）根據蛋白質帶電性質進行分離
蛋白質在不同pH環境中帶電性質和電荷數量不同，可將其分開。
1、電泳法
各種蛋白質在同一pH條件下，因分子量和電荷數量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質作為載體，電泳時兩性電解質形成一個由正極到負極逐漸增加的pH梯度，當帶一定電荷的蛋白質在其中泳動時，到達各自等電點的pH位置就停止，此法可用於分析和制備各種蛋白質。
2、離子交換層析法
離子交換劑有陽離子交換劑（如：羧甲基纖維素；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素；DEAE?FONT
FACE="宋體"
LANG="ZH-CN">纖維素），當被分離的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上，隨後用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質洗脫下來。（詳見層析技術章）
（四）根據配體特異性的分離方法－親和色譜法
親和層析法（aflinity
chromatography）是分離蛋白質的一種極為有效的方法，它經常只需經過一步處理即可使某種待提純的蛋白質從很復雜的蛋白質混合物中分離出來，而且純度很高。這種方法是根據某些蛋白質與另一種稱為配體(Ligand）的分子能特異而非共價地結合。其基本原理：蛋白質在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在，每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質，因此蛋白質的分離（Separation），提純（Purification）
和鑒定（Characterization）是生物化學中的重要的一部分，至今還沒的單獨或一套現成的方法能移把任何一種蛋白質從復雜的混合蛋白質中提取出來，因此往往採取幾種方法聯合使用。
細胞的破碎
1、高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置於筒內約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調速器先撥至最慢處，開動開關後，逐步加速至所需速度。此法適用於動物內臟組織、植物肉質種子等。
2、玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置於管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細胞研碎，此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高，適用於量少和動物臟器組織。
3、超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震盪破裂，此法多適用於微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，在1KG至10KG頻率下處理10-15分鍾，此法的缺點是在處理過程會產生大量的熱，應採取相應降溫措施。對超聲波敏感和核酸應慎用。
4、反復凍融法：將細胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復幾次，由於細胞內冰粒形成和剩餘細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結構破碎。
5、化學處理法：有些動物細胞，例如腫瘤細胞可採用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細胞膜破壞，細菌細胞壁較厚，可採用溶菌酶處理效果更好。

無論用哪一種方法破碎組織細胞，都會使細胞內蛋白質或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導致天然物質量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺醯氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，還可通過選擇pH、溫度或離子強度等，使這些條件都要適合於目的物質的提取。
濃縮、乾燥及保存
一、樣品的濃縮
生物大分子在制備過程中由於過柱純化而樣品變得很稀，為了保存和鑒定的目的，往往需要進行濃縮。常用的濃縮方法的：
1、減壓加溫蒸發濃縮
通過降低液面壓力使液體沸點降低，減壓的真空度愈高，液體沸點降得愈低，蒸發愈快，此法適用於一些不耐熱的生物大分子的濃縮。
2、空氣流動蒸發濃縮
空氣的流動可使液體加速蒸發,鋪成薄層的溶液，表面不斷通過空氣流；或將生物大分子溶液裝入透析袋內置於冷室，用電扇對准吹風，使透過膜外的溶劑不沁蒸發，而達到濃縮目的，此法濃縮速度慢，不適於大量溶液的濃縮。
3、冰凍法
生物大分子在低溫結成冰，鹽類及生物大分子不進入冰內而留在液相中，操作時先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體，然後緩慢地融解，利用溶劑與溶質融點介點的差別而達到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質和酶的鹽溶液用此法濃縮時，不含蛋白質和酶的純冰結晶浮於液面，蛋白質和酶則集中於下層溶液中，移去上層冰塊，可得蛋白質和酶的濃縮液。
4、吸收法
通過吸收劑直接收除去溶液中溶液分子使之濃縮。所用的吸收劑必需與溶液不起化學反應，對生物大分子不吸附，易與溶液分開。常用的吸收劑有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝膠等，使用聚乙二醇吸收劑時，先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋裡，外加聚乙二醇復蓋置於4度下，袋內溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水飽和後要更換新的直至達到所需要的體積。
5、超濾法
超濾法是使用一種特別的薄膜對溶液中各種溶質分子進行選擇性過濾的方法，不液體在一定壓力下（氮氣壓或真空泵壓）通過膜時，溶劑和小分子透過，大分子受阻保留，這是近年來發展起來的新方法，最適於生物大分子尤其是蛋白質和酶的濃縮或脫鹽，並具有成本低，操作方便，條件溫和，能較好地保持生物大分子的活性，回收率高等優點。應用超濾法關鍵在於膜的選擇，不同類型和規格的膜，水的流速，分子量截止值（即大體上能被膜保留分子最小分子量值）等參數均不同，必須根據工作需要來選用。另外，超濾裝置形式，溶質成份及性質、溶液濃度等都對超濾效果的一定影響。Diaflo
超濾膜的分子量截留值：
膜名稱分子量截留值孔的大的平均直徑
XM－300300，000140
XM－200100，00055
XM－5050，00030
PM－30 30，00022
UM－2020，00018
PM－1010，00015
UM－21，00012
UM05500 10

用上面的超濾膜製成空心的纖維管，將很多根這樣的管攏成一束，管的兩端與低離子強度的緩沖液相連，使緩沖液不斷地在管中流動。然後將纖維管浸入待透析的蛋白質溶液中。當緩沖液流過纖維管時，則小分子很易透過膜而擴散，大分子則不能。這就是纖維過濾秀析法，由於透析面積增大，因而使透析時間縮短10倍。
二、乾燥
生物大分子制備得到產品，為防止變質，易於保存，常需要乾燥處理，最常用的方法是冷凍乾燥和真空乾燥。真空乾燥適用於不耐高溫，易於氧化物質的乾燥和保存，整個裝置包括乾燥器、冷凝器及真空乾燥原理外，同時增加了溫度因素。在相同壓力下，水蒸汽壓隨溫度下降而下降，故在低溫低壓下，冰很易升華為氣體。操作時一般先將待乾燥的液體冷凍到冰點以下使之變成固體，然後在低溫低壓下將溶劑變成氣體而除去。此法干後的產品具有疏鬆、溶解度好、保持天然結構等優點，適用於各類生物大分子的乾燥保存。
三、貯存
生物大分子的穩定性與保存方法的很大關系。乾燥的製品一般比較穩定，在低溫情況下其活性可在數日甚至數年無明顯變化，貯藏要求簡單，只要將乾燥的樣品置於乾燥器內（內裝有乾燥劑）密封，保持0－4度冰箱即可，液態貯藏時應注意以下幾點。
1、樣品不能太稀，必須濃縮到一定濃度才能封裝貯藏，樣品太稀易使生物大分子變性。
2、一般需加入防腐劑和穩定劑，常用的防腐劑有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白質和酶常用的穩定劑有硫酸銨糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和輔酶以提高其穩定性。此外，鈣、鋅、硼酸等溶液對某些酶也有一定保護作用。核酸大分子一般保存在氯化鈉或檸檬酸鈉的標准緩沖液中。
3、貯藏溫度要求低，大多數在0度左右冰箱保存，有的則要求更低，應視不同物質而定。