deae52纖維素離子交換層析純化igg洗脫液用什麼

㈠ 蛋白質提取分離純化鑒定的實驗方案

一.血清ǐ-球蛋白的初步提取
1. 血細胞與血清分離：
取人血液 1000ml,放置10min, 1000rpm離心20min .棄沉澱,留上清備用(沉澱為血細胞，上部為血清).
2. 乳糜粒分離：4000rpm 10°C離心10分鍾,採用密度梯度離心
梯度液配置：離心管下部3/4容積加血漿，上部1/4容積加0.5MnaCl+0.3MEDTA,PH7.4 乳糜粒上浮，將乳糜粒吸出,留其餘液體備用。
3. 血清蛋白分離：除去球蛋白，白蛋白及其它蛋白質。
5000rpm 10°C離心1h,密度梯度離心
梯度.液配置：管容量1/3為血清，2/3為1。31g/ml,NaCl+NaBr,攪拌後終密度為1。21g/ml .管上部1/6容積為血清脂蛋白，下部5/6為其它蛋白。
4.取2ml下部5/6血清於小試管中,加0.9％氯化鈉溶液2.0ml，邊攪拌混勻邊緩慢滴加飽和硫酸銨溶液乙4.0ml，加入PBS洗脫液2ml,混勻後於室溫中放置10min，此步驟可重復1～2次
3000rpm 離心5min.沉澱物即是ǐ-球蛋白.
二.凝膠層析提純血清ǐ-球蛋白(1)裝柱：海綿墊裝入玻璃柱底端,作為柱底支持物,裝入定量的蒸餾水(約為柱體積的1/5),以避免膠粒直接沖擊柱底支持物;用玻璃棒小心排除柱底支持物.將密實洗凈的層析柱保持垂直位置，關閉出口，柱內留下約2.0ml洗脫液。邊攪拌凝膠,邊向柱內緩慢,連續,均勻地加入凝膠,(打開柱底端的螺旋夾)不要中斷,使膠粒均勻沉降,以免膠面一次性將疑膠從塑料介面加入層析柱內，打開柱底部出口，調節流速0.3ml/min。凝腔隨柱內溶液慢慢流下而均勻沉降到層析柱底部傾斜和發生斷層;檢查裝好的凝膠柱用眼觀察有無凝膠分層.溝流和氣泡現象.最後使凝膠床達20厘米高，床面上保持有洗脫液，操作過程中注意不能讓凝膠床表面露出液面並防止層析床內出現「紋路」。用緩沖液平衡凝膠柱,流速控制在3-5s/滴.(2)上樣與洗脫：小心控制凝膠柱下端活塞，使柱上的緩沖液面剛好下降至凝膠床表面，關緊下端出口，用長滴管吸取鹽析法制備的球蛋白混合樣品，將裝有上樣液的滴管頭插入床面以上1-2cm處,小心緩慢地貼壁加到凝膠床表面。柱上樣量控制在柱體積的2%-5%.打開下端出口，將流速控制在0.25ml/min使樣品進入凝膠床內。關閉出口，小心加入少量0.0175mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)洗柱內壁。打開下端出口，待緩沖液進入凝膠床後再加少量緩沖液。如此重復三次，以洗凈內壁上的樣品溶液。然後可加入適量緩沖液開始洗脫。加樣開始應立即收集洗脫液。洗脫時接通蠕動泵，流速為0.5ml/min,用部分收集器收集，每管1ml。(3)洗脫液中NH4+與蛋白質的檢查：取比色板兩個(其中一個為黑色背底)，按洗脫液的順序每管取一滴，分別滴入比色板中，前者加雙縮脲2滴，出現藍色混濁即示有蛋白質析出，由此可估計蛋白質在洗脫各管中的分布及濃度；於另一比色板中，加人奈氏試劑l滴，以觀察NH4+出現的情況。 合並球蛋白含量高的各管，混勻。除留少量作電泳鑒定外，其餘用DEAE纖維素陰離子交換柱進一步純化。三．純化――DEAE纖維素陰離子交換層析用DEAE纖維素裝柱約8-10cm高度，並用0.0175mol／L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)平衡，然後將脫鹽後的球蛋白溶液緩慢加於DEAE纖維素陰離子交換柱上，用同一緩沖液洗脫、分管收集。用20％磺基水楊酸溶液檢查蛋白質分布情況。(裝柱、上樣、洗脫，收集及蛋白質檢查等操作步驟同凝膠層析)。四．濃縮經DEAE纖維素陰離於交換柱純化的γ－球蛋白液往往濃度較低。為便於鑒定，常需濃縮。收集較濃的純化的γ－球蛋白溶液2m1，按每ml加0.2～ 0.25gSephadex G一25干膠，搖動2～3min， 3000r／min 離心5min。上清液即為濃縮的γ-球蛋白溶液。五. 乙酸纖維素薄膜電泳鑒定ǐ-球蛋白(一)儀器與薄膜的准備1.醋酸纖維素薄膜的潤洗與選擇用竹夾子取一片薄膜，小心地平放在盛有緩沖液的平皿中，若漂浮於液面的薄膜在15—30s內迅速潤濕，整條薄膜色澤深淺一致，則此膜均勻可用於電泳；若薄膜潤濕緩慢，色澤深淺不一或有條紋及斑點等，則表示薄膜厚薄不均勻應棄去，以免影響電泳結果。將選好的薄膜用竹子輕壓，使其完全浸泡於緩沖液中約30min後，方可用於電泳。
2.電泳槽的准備根據電泳槽膜支架的寬度，剪裁尺寸合適的濾紙條。在兩個電極槽中，各倒入等體積的電極緩沖液，在電泳槽的兩個膜支架上，各放兩層濾紙條，使濾紙一端的長邊與支架前沿對齊，另一端浸入電極緩沖液內。當濾紙條全部潤濕後，用玻璃棒輕輕擠壓在膜支架上的濾紙以驅趕氣泡，使濾紙的一端能緊貼在膜支架上。濾紙條是兩個電極槽聯系醋酸纖維素薄膜的橋梁，因而稱為濾紙橋。
3.電極槽的平衡用平衡裝置(或自製平衡管)連接兩個電泳槽，使兩個電極槽內的緩沖液彼此處於同一水平狀態，一般需平衡15——20min。注意，取出平衡裝置時應將活塞關緊。
(二)點樣
1.制備點樣模板取一張干凈濾紙(10×10cm)，在距紙邊1.5cm處用鉛筆劃一平行線，此線為點樣標志區。
2.點樣用竹夾子取出浸透的薄膜，夾在兩層濾紙間以吸去多餘的緩沖液。無光澤面向上平放在點樣模板上，使其底邊與模板底邊對齊。點樣區距陰極端1.5cm處。點樣時，先用玻璃棒或血色素吸管取2—3�0�8L血清，均勻塗在加樣器上，再將點樣器輕輕印在點樣區內，使血清完全滲透至薄膜內，形成一定寬度、粗細均勻的直線。此步是實驗的關鍵，點樣前應在濾紙上反復練習，掌握點樣技術後再正式點樣。
(三).電泳用竹夾子將點樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上(點樣面朝下)，另一端平貼在陽極端支架上，要求薄膜緊貼濾紙橋並綳直，中間不能下垂。如一電泳槽中同時安放幾張薄膜，則薄膜之間應相隔幾毫米。蓋上電泳槽蓋，使薄膜平衡10min。用導線將電泳槽的正、負極與電泳儀的正、負極分別連接，注意不要接錯。在室溫下電泳，打開電源開關，用電泳儀上細調節旋扭調到每厘米膜寬電流強度為0.3mA(8片薄膜則為4.8mA)。通電10—15min後，將電流調節到每厘米膜寬電流強度為0.5mA(8片共8 mA)，電泳時間約50—80min。電泳後調節旋扭使電流為零，關閉電泳儀切斷電源。
(四).染色與漂洗
1.血清蛋白染色與漂洗脫色用解剖鑷子取出電泳後的薄膜，放在含0.5%氨基黑10B染色液的培養皿中，浸染5min，取出後再用漂洗液浸洗脫色，每隔10min 換漂洗液一次，連續數次，直至背景藍色脫盡。取出薄膜放在濾紙上，用吹風機的冷風將薄膜吹乾。
(五)透明將脫色吹乾後的薄膜浸入透明甲液中2min，立即放入透明乙液中浸泡1min，取出後立即緊貼於干凈玻璃板上，兩者間不能有氣泡，約2—3min薄膜完全透明。若透明太慢可用滴管取透明乙液少許在薄膜表面淋洗一次，垂直放置待其自然乾燥，或用吹風機冷風吹乾且無酸味。再將玻璃板放在流動的自來水下沖洗，當薄膜完全潤濕後用單面刀片撬開薄膜的一角，用手輕輕將透明的薄膜取下，用濾紙吸干所有的水分，最後將薄膜置液體石蠟中浸泡3min，再用濾紙吸干液體石蠟，壓平。此薄膜透明，區帶著色清晰，可用於光吸收計掃描。長期保存不褪色。
(六)結果判斷與定量血清蛋白電泳經蛋白染色後，可顯示出區帶，未經透明處理的電泳圖譜可直接用於定量測定。可採用洗脫法或光吸收掃描法，測定各蛋白組分相對百分含

㈡ 用過的sephadex G-25層析柱和DEAE纖維素離子交換柱再生的方法為什麼不一樣

飛秒檢測發現sephadex G-25層析柱填料是葡聚糖交聯的凝膠柱，G-X, X：（1）交聯度。X越小，交聯度越大，網孔越小，適用於分離低分子量產品，反之亦然。（2）吸水量。為凝膠得水值的10倍.例如,G-25為每克凝膠膨脹時吸水2.5克.凝膠柱使用一次後，必須反沖疏鬆一次，平衡後再使用。若使用數次，就需要再生處理。用0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液浸泡，然後用蒸餾水洗至中性備用。若實驗完畢，將再生後的凝膠在布氏漏鬥上用蒸餾水洗滌抽干，再用95%乙醇洗兩次，在60℃烘箱中烘乾，回收保存。
DEAE-纖維素為二乙氨乙基纖維素，是陰離子交換劑。基質是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。離子交換層析中，基質是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱之陰離子交換樹脂；而帶有負電荷的稱之陽離子樹脂。離子交換層析同樣可以用於蛋白質的分離純化。由於蛋白質也有等電點，當蛋白質處於不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質，所以這類蛋白質被留在柱子上，然後通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質洗脫下來。結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質，結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。離子交換劑的再生與保存離子交換劑可在柱上再生。如離子交換纖維素可用2mol/：NaCl淋洗柱，若有強吸附物則可用0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性物質則可用非離子型去污劑洗柱後再生，也可用乙醇洗滌，其順序為：0.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20%NaOH-水。保存離子交換劑時要加防腐劑。對陰離子交換劑宜用0.002%氯已定（洗必泰），陽離子交換劑可用乙基硫柳汞（0.005%）。有些產品建議用0.02%疊氮鈉。
兩種填料的抗酸鹼性和抗腐蝕性能不同。

㈢ 纖維素DE-52的提取方法

纖維素DE-52提取法純化多克隆抗體
該法提取IgG簡便，既可小量提取，也可大量制備。
1．批量提取法 稱取DEAE-纖維素(DE52)50g，置於1000ml燒杯中，先以蒸餾水漂浮除去細顆粒，再經酸鹼處理後，用0.01～0.05mol/L，pH8.0左右的磷酸鹽緩沖液(PB)平衡。將水分抽干，或用布氏濾斗(內放兩層濾紙)過濾，收集濕纖維素，以降低其離子強度。按1ml血清加濕重5g DE52，經過充分攪拌，置4℃吸附1h。上清液可再如此處理一次，即獲得較純的IgG。該法提取IgG簡便，既可小量提取，也可大量制備。
2．Tris-Cl離子交換層析法(Ion-exchange chromatography)
【材料和試劑】
（1）DE52纖維素。
（2）HCl；NaOH；0.01～0.05mol/L，pH8.0 PB；0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl；0.5mol/L NaCl。
（3）待純化標本：雜交瘤腹水或培養上清，免疫血清或飽和硫酸銨粗提品。
（4）1.5×50cm 層析柱；透析袋；紫外分光光度計及其他透析和層析所需的試劑和器材。
【操作步驟】
（1）DE52纖維素的處理：DE52經酸、鹼處理，0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl平衡。
（2）裝柱：將層析柱固定於滴定架上，柱底墊一圓形尼龍紗，出口接一細塑料管並關閉出水。將浸泡於0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl中的DE52沿玻璃棒倒入柱中，待DE52自然沉降3～5cm高時，吸除0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl，或松開出水口螺旋夾，控制流速1～2ml/min，同時連續加入DE52至所需高度。待DE52完全沉降後，柱面放一圓形濾紙片。
（3）平衡：松開出水口螺旋夾，以0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl平衡，控制流速為15滴/min，待流出液與洗脫液之pH值達到一致時，停止平衡。
（4）待提取樣品的准備：將蛋白裝入透析袋裡，置4℃冰箱，對0.01mol/L pH8.6 Tris-Cl透析過夜。
（5）加樣、洗脫與收集：用吸管吸去柱面液體，以毛細吸管沿柱壁加入樣品，樣品體積相當於柱床體積的1%～2%，蛋白濃度為50～70mg。啟開出水口螺旋夾使樣品緩慢進入柱床內，並用少量洗脫液清洗柱壁；待液體進入柱床後，以0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl洗脫，控制流速為14～16滴/min。分部收集器收集，紫外監測，或人工收集，以紫外分光光度計分別測定每管280nm OD值，描繪洗脫液峰。
（6）濃縮：將洗脫液的280nm OD上峰段與下峰段各管分別合並，裝入透析袋，以PEG濃縮至所需體積。
Tris-PO4離子交換層析法
該法在上述方法的基礎上稍加改良，即通過梯度洗脫，可用於血清中IgG和IgM的提取。
【材料和試劑】
（1）DE52纖維素。
（2）待純化標本：雜交瘤腹水或培養上清，免疫血清或飽和硫酸銨粗提品。
（3）1.5×50cm 層析柱；透析袋及其他透析和層析所需的試劑和器材。
（4）梯度洗脫液包括：0.005 mol/L，pH8.6 Tris-PO4；0.055mol/L，pH6.0 Tris-PO4；.5mol/L，pH5.1 Tris-PO4。
【操作步驟】
（1）蛋白標本對0.005mol/L，pH8.6 Tris-PO4透析。
（2）DE52裝柱，並以0.005mol/L，pH8.6 Tris-PO4平衡。
（3）加樣，以0.005mol/L，pH8.6 Tris-PO4洗脫，紫外監測直至洗脫液280nm OD回到基線。這一步驟可除去血清中其他蛋白。
（4）以350ml 0.055mol/L，pH6.0 Tris-PO4洗脫，這一步驟可用於純化血清IgG和IgM。
（5）以125ml 0.055mol/L，pH6.0 Tris-PO4和125ml 0.5mol/L，pH5.1 Tris-PO4梯度洗脫，總量收集250ml；重復步驟（5）。
（6）根據280nm峰值合並蛋白峰，透析濃縮和保存同上。
用過的DE52可用0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl和0.5mol/L NaCl、0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl梯度洗脫回收。再用蒸餾水洗至中性，加入0.02%疊氮鈉於4℃保存備用。

㈣ DE-52纖維素再生中，使用 NaOH洗脫吸附的球蛋白，洗下來的球蛋白是原來的結構還是已經變性

DEAE-纖維素 DEAE cellulose DEAE-纖維素 DEAE cellulose 為二乙氨乙基纖維素。是陰離子交換纖維素之一。 DEAE—纖維素的活化：稱取IgDEAE32或52，放入5ml量筒中，加蒸餾水浸泡過夜，觀察溶脹後DEAE的體積。根據所需層析柱的柱床體積計算所需DEAE的用量，稱取所需DEAE用蒸餾水浸泡過夜，其間換幾次水，每次除去細小顆粒。抽干，改用0.5ml/LNaOH溶液浸泡1h以上，抽干（可用布氏漏斗），用無離子水漂洗，使pH至8左右（用pH試紙檢查）。再改用0.5ml/LHCl溶液浸泡1h以上，去酸溶液，用無離子水洗至pH6左右。本實驗中在用前應以0.0175mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液，浸泡平衡後使用。 用過的離子交換劑可以反復使用，使其恢復原狀的方法俗稱「再生」。再生並非每次用酸、鹼反復處理，通常只要「轉型」處理即可。所謂轉型就是使交換劑帶上所希望的某種離子，如希望陽離子交換劑帶上NH+4則可用NH4OH浸泡，如希望陰離子交換劑帶上Cl—則用NaCl溶液處理。本實驗中DEAE—纖維素在酸鹼處理後，用0.0175mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖溶液浸泡即可轉型，以HPO4取代DEAE中的OH—。一般由於DEAE—纖維素使用後因帶有大量雜蛋白，所以再生時，先用0.5ml/L NaOH浸洗，用無離子洗至pH8左右，再轉型，即可再使用。

㈤ 請以deae-c為例說明離子交換纖維素分離純化蛋白質時的洗脫方法有哪些

源/目標IP地址（來第三層路自由），而且依據TCP/UDP(第四層) 應用埠號。第四層交換功能就象是虛IP，指向物理伺服器。它所傳輸的業務服從各種各樣的協議，有HTTP、FTP、NFS、Telnet或其他協議。這些業務在物理伺服器基礎上，需要復雜的載量平衡演算法。

在IP世界，業務類型由終端TCP或UDP埠地址來決定，在第四層交換中的應用區間則由源端和終端IP地址、TCP和UDP

㈥ 求分離，純化,鑒定γ球蛋白的具體方法（包括原理，步驟，預期結果，注意事項）謝謝

[原理]

血清中蛋白質按電泳法一般可分為五類：清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白，其中γ-球蛋白含量約佔16％，100ml血清中約含1.2g左右。

首先利用清蛋白和球蛋白在高濃度中性鹽溶液中(常用硫酸銨)溶解度的差異而進行沉澱分離，此為鹽析法。半飽和硫酸銨溶液可使球蛋白沉澱析出，清蛋白則仍溶解在溶液中，經離心分離,沉澱部分即為含有γ-球蛋白的粗製品。

用鹽析法分離而得的蛋白質中含有大量的中性鹽，會妨礙蛋白質進一步純化，因此首先必須去除。常用的方法有透析法、凝膠層析法等。本實驗採用凝膠層析法，其目的是利用蛋白質與無機鹽類之間分子量的差異。當溶液通過SephadexG--25凝膠柱時，溶液中分子直徑大的蛋白質不能進入凝膠顆粒的網孔，而分子直徑小的無機鹽能進入凝膠顆粒的網孔之中．因此在洗脫過程中，小分子的鹽會被阻滯而後洗脫出來，從而可達到去鹽的目的。

脫鹽後的蛋白質溶液尚含有各種球蛋白，利用它們等電點的不同可進行分離。α－球蛋白、β-球蛋白的PI<6.0；γ－球蛋白的PI為7.2左右。因此在PH6.3的緩沖溶液中，各類球蛋白所帶電荷不同。經DEAE(二乙基氨基乙基)纖維素陰離子交換層析柱進行層析時，帶負電荷的α－球蛋白和β-球蛋白能與DEAE纖維素進行陰離子交換而被結合；帶正電荷的γ－球蛋白則不能與DEAE纖維素進行交換結合而直接從層析柱流出。因此隨洗脫液流出的只有γ－球蛋白，從而使γ－球蛋白粗製品被純化。其反應式如下：

用上述方法分離得到γ－球蛋白是否純凈，單一？可將純化前後的γ－球蛋白進行電泳比較而鑒定之。

[操作]

(1)鹽析――中性鹽沉澱：取正常人血清2.0ml於小試管中，加0.9％氯化鈉溶液2.0ml，邊攪拌混勻邊緩慢滴加飽和硫酸銨溶液乙4.0ml，混勻後於室溫中放置10min，3000r／min離心10min。小心傾去含有清蛋白的上清液，重復洗滌一次，於沉澱中加入0.0175mol／L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)0.5～1.Oml使之溶解。此液即為粗提的γ－球蛋白溶液。

(2)脫鹽――凝膠柱層析

①裝柱

洗凈的層析柱保持垂直位置，關閉出口，柱內留下約2.0ml洗脫液。一次性將疑膠從塑料介面加入層析柱內，打開柱底部出口，調節流速0.3ml/min。凝腔隨柱內溶液慢慢流下而均勻沉降到層析柱底部，最後使凝膠床達20厘米高，床面上保持有洗脫液，操作過程中注意不能讓凝膠床表面露出液面並防止層析床內出現「紋路」。在凝膠表面可蓋一園形濾紙，以免加入液體時沖起膠粒。

②上樣與洗脫：可以在凝膠表面上加圓形尼龍濾布或濾紙使表面平整，小心控制凝膠柱下端活塞，使柱上的緩沖液面剛好下降至凝膠床表面，關緊下端出口，用長滴管吸取鹽析球蛋白溶液，小心緩慢加到凝膠床表面。打開下端出口，將流速控制在0.25ml/min使樣品進入凝膠床內。關閉出口，小心加入少量0.0175mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)洗柱內壁。打開下端出口，待緩沖液進入凝膠床後再加少量緩沖液。如此重復三次，以洗凈內壁上的樣品溶液。然後可加入適量緩沖液開始洗脫。

加樣開始應立即收集洗脫液。洗脫時接通蠕動泵，流速為0.5ml/min,用部分收集器收集，每管1ml。

③洗脫液中NH4+與蛋白質的檢查：取比色板兩個(其中一個為黑色背底)，按洗脫液的順序每管取一滴，分別滴入比色板中，前者加20％磺基水楊酸溶液2滴，出現白色混濁或沉澱即示有蛋白質析出，由此可估計蛋白質在洗脫各管中的分布及濃度；於另一比色板中，加人奈氏試劑應用液l滴，以觀察NH4+出現的情況。

合並球蛋白含量高的各管，混勻。除留少量作電泳鑒定外，其餘用DEAE纖維素陰離子交換柱進一步純化。

(3)純化――DEAE纖維素陰離子交換層析：用DEAE纖維素裝柱約8-10cm高度，並用0.0175mol／L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)平衡，然後將脫鹽後的球蛋白溶液緩慢加於DEAE纖維素陰離子交換柱上，用同一緩沖液洗脫、分管收集。用20％磺基水楊酸溶液檢查蛋白質分布情況。(裝柱、上樣、洗脫，收集及蛋白質檢查等操作步驟同凝膠層析)。

(4)濃縮――經DEAE纖維素陰離於交換柱純化的γ－球蛋白液往往濃度較低。為便於鑒定，常需濃縮。收集較濃的純化的γ－球蛋白溶液2m1，按每ml加0.2～ 0.25gSephadex G一25干膠，搖動2～3min， 3000r／min 離心5min。上清液即為濃縮的γ-球蛋白溶液。

(5)鑒定――乙酸纖維素薄膜電泳 取乙酸纖維素薄膜2條，分別將血清、脫鹽後的球蛋白、DEAE纖維素陰離子交換柱純化的γ-球蛋白液等樣品點上。然後參閱實驗二十四：乙酸纖維薄膜電泳法進行電泳分離、染色。比較電泳結果。

[注意事項]

(1)凝膠及DEAE纖維處理期間，必須小心用傾瀉法除去細小顆粒。這樣可使凝膠及纖維素顆粒大小均勻，流速穩定，分離效果好。

(2)裝柱是層析操作中最重要的一步。為使柱床裝得均勻，務必做到凝膠懸液或DEAE纖維素混懸液不稀不厚，一般濃度為l：l，進樣及洗脫時切勿使床面暴露在空氣中，不然柱床會出現氣泡或分層現象；加樣時必須均勻，切勿攪動床面，否則均會影響分離效果。

(3)本法是利用γ-球蛋白的等電點與α-、β-球蛋白不同，用離子交換層析法進行分離的。因此層析過程中用的緩沖液pH要求精確。

(4)電泳注意事項見實驗二十四。

(5)凝膠貯存：凝膠使用後如短期不用，為防止凝膠發霉可加防腐劑如0.02％疊氮鈉。保存於4℃冰箱內。若長期不用，應脫水乾燥保存。脫水方法：將膨脹凝膠用水洗凈。用多孔漏斗抽干後，逐次更換由稀到濃的乙醇溶液浸泡若干時間，最後一次用95％乙醇溶液浸泡脫水，然後用多孔漏斗抽干後，於60～80℃烘乾貯存。

(6)離子交換劑的再生和保存；離子交換劑的價格較貴，每次用後只需再生處理便能反復使用多次。處理方法是：交替用酸、鹼處理，最後用水洗至接近中性。陽離子交換劑最後為Na型，陰離子以Cl型是最穩定型，故陰離子交換劑處理順序為鹼一水一酸一水。由於上述交換劑都是糖鏈結構。容易水解破壞，因此須避免強酸、強鹼長時間浸泡和高溫處理，一般纖維素浸泡時間為3-4h。

離子交換劑容易長霉引起變質，不用時，需洗滌干凈，加防腐劑置冰箱內保存。常用0.02％疊氮鈉防腐。疊氮鈉遇酸放出有毒氣體，也是劇毒與易爆的危險品。使用時要加倍小心。

除用凝膠層析法去除無機鹽類外，最常用的去鹽法就是透析。細的透析袋效率高，所需時間短。將透析袋一端折疊，用橡皮筋結扎，試驗是否逸漏，然後倒入待透析的蛋白質溶液。勿裝太滿，將袋的上端也結紮好，即可進行透析。開始可用流動的自來水，待大部分鹽被透析出後，再改為生理鹽水、緩沖液或蒸餾水。透析最好在較低的溫度下，並在磁力攪拌器上進行。此法簡單，易操作，儀器及試劑要求不高，但不如凝膠層析法效率高。

濃縮γ-球蛋白粗提液除上述方法外還可用透析袋濃縮。將待濃縮的蛋白質溶液放入較細的透析袋中，置入搪瓷盤內。透析袋周圍可撒上聚乙二醇6000(PEG6000)，或聚乙烯吡咯酮，或蔗糖。以上物質在使用後(吸了大量水)都可以通過加溫及吹風而回收；將裝有蛋白質溶液的透析袋懸掛起來，用電風扇高速吹風(10℃以下)，也可達到濃縮目的，以上兩法雖不如 SephadexG一25干膠快，但價格較便宜，方法也不煩瑣。

[試劑]

(1)飽和硫酸銨溶液：稱固體硫酸銨(分析純)850g，置於1000ml蒸餾水中，在70一80℃水溫中攪拌溶解。將酸度調節至pH7.2，室溫中放置過夜，瓶底析出白色結晶，上清液即為飽和硫酸銨溶液。

(2)葡聚糖凝膠G一25的處理：按每100ml凝膠床體積需要葡聚糖凝膠G一25干膠 25g。稱取所需量置於錐形瓶中。每克干膠加入蒸餾水約30ml，用玻璃棒輕輕混勻，置於90～100℃水溫中時時攪動，使氣泡逸出。1h後取出，稍靜置，傾去上清液細粒。也可於室溫中浸泡24h，攪拌後稍靜置，傾去上清液細粒，用蒸餾水洗滌2～3次，然後加0.017mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)平衡，備用。

(3)DEAE一32(二乙基氨基乙基一32)纖維素的處理：按100ml柱床體積需DEAE纖維素14g稱取，每克加0.5mol／L鹽酸溶液15ml，攪拌。放置30min(鹽酸處理時間不可太長，否則DEAE纖維素變質)。加約l0倍量的蒸餾水攪拌，放置片刻，待纖維素下沉後，傾棄含細微懸浮物的上層液。如此反復數次。靜置30min，虹吸去除上清液(也可用布氏漏斗抽干)，直至上清液pH>4為止。加等體積lmol/L氫氧化鈉溶液，使最終濃度約為0.5mol/L氫氧化鈉，攪拌後放置30min，以虹吸除去上層液體。同上用蒸餾水反復洗至pH<7為止。虹吸去除上層液體，然後加入0.0175mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)平衡，備用。

(4)0.0175mol／L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)

A液：稱取磷酸二氫鈉(NaH2PO4.2H20)2.730g溶於蒸餾水中，加蒸餾水稀釋至1000ml。

B液：稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO4.12H20)6.269g，溶於蒸餾水中，加蒸餾水稀釋至 1000mL。

取A液77.5ml，加於B液22.5ml，混勻後即成。

(5)20%磺基水楊酸溶液

(6)奈氏(Nessler)試劑應用液

①貯存液；稱取碘化鉀(KI)7.58於250ml三角燒瓶中，用蒸餾水5ml溶解，再加入碘（I2） 5.5g溶解，加7～7.5gHg用力振搖10min(此時產生高熱，須冷卻)，直至棕紅色的碘轉變成帶綠色的碘化汞鉀液為止，過濾上清液傾入100ml容量瓶，洗滌沉澱，洗滌液一並倒入容量瓶內，用蒸餾水稀釋至100ml。

②應用液：取貯存液75ml加10％NaOH 350ml，加水至500mL。

(7)0.9％氯化鈉溶液

(8)乙酸纖維素薄膜電泳有關試劑(見實驗二十四)

(四)親和層析

生物體中許多高分子化合物之間具有專—性可逆結合的特徵，例如：酶蛋白和輔酶，抗原和抗體，激素與受體，核糖核酸與互補的脫氧核糖核酸等。生物分子間的這種專一性結合能力稱為親和力，根據生物分子間親和力大小產生吸附和解吸作用而建立的層析方法稱為親和層析。

親和層析的基本過程如下：具有親和力的一對分子，其中一種分子作為配基，固定化結合在不溶性載體上裝入層析柱成親和柱，當含有另—種分子的混合液作為流動相流入親和柱時，能與配基親和結合的分子被吸附，其它雜質直接流出，再改變流動相的溶液，使配基與其親和物解離從而解吸出待分離的分子來。

親和層析中最常用的具有親和力的生物體系有：

酶：底物、抑制劑、輔酶

抗體：抗原、病毒、細胞

外源凝集素：受體、載體蛋白

細胞：細胞表面特異蛋白，外源性凝集素

㈦ 用不同濃度洗脫DEAE纖維素出來的多糖是什麼性質

最常見的交換劑為DEAE-纖維素(硼酸型或鹼型),洗脫劑可用不同濃度的鹼溶液、硼砂溶液、鹽溶液等

㈧ 蛋白質的提取方法有哪些

眾所周知，人的生命活動不能缺少蛋白質，很多食物裡面都含有蛋白質成分，正常的飲食可以為身體補充蛋白質。實際上，在生物化學研究領域，蛋白質的分離提取技術具有廣泛的應用，想要把蛋白質提取出來非常不容易，需要經過很多工序，並且要找到專業的操作技術，現在有下列這些方法可以提取蛋白質。
1、超速離心法
此法分離和純化抗原的原理是利用各顆粒在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的顆粒處於不同密度梯度層內，達到彼此分離的目的。常用的密度梯度介質有蔗糖、甘油、CsCl等。
用超速離心或梯度密度離心分離和純化抗原時，除個別成分外，極難將某一抗原成分分離出來，故只用於少數大分子抗原的分離，如IgM、C1q，甲狀腺球蛋白等，以及一些比重較輕的抗原物質如載脂蛋白A、B等。多數的中、小分子量蛋白質採用此種方法很難純化。
2、選擇性沉澱法
其原理多根據各蛋白質理化特性的差異，採用各種沉澱劑或改變某些條件促使蛋白質抗原成分沉澱，從而達到純化的目的。最常用的方法是鹽析沉澱法。
鹽析法的原理
蛋白質在水溶液中的溶解度取決於蛋白質分子表面離子周圍的水分子數目，亦即主要是由蛋白質分子外周親水基團與水形成水化膜的程度以及蛋白質分子帶有電荷的情況決定的。蛋白質溶液中加入中性鹽後，由於中性鹽與水分子的親和力大於蛋白質，致使蛋白質分子周圍的水化層減弱乃至消失。同時，中性鹽加入蛋白質溶液後由於離子強度發生改變，蛋白質表面的電荷大量被中和，更加導致蛋白質溶解度降低，使蛋白質分子之間聚集而沉澱。由於各種蛋白質在不同鹽濃度中的溶解度不同，不同飽和度的鹽溶液沉澱的蛋白質不同，從而使之從其他蛋白分離出來。最常用的鹽溶液是33%～50%飽和度的硫酸銨。鹽析法簡單方便，可用於蛋白質抗原的粗提，丙種球蛋白的提取，蛋白質的濃縮等。鹽析法提純的抗原純度不高，只適用抗原的初步純化。
3、凝膠層析法
凝膠層析是利用分子篩作用對蛋白質進行分離。凝膠是具有三維空間多孔網狀結構的物質，經過適當的溶液平衡後，裝入層析柱。一種含有各種分子的樣品溶液緩慢地流經凝膠層析柱時，大分子物質不易進入凝膠顆粒的微孔，只能分布於顆粒之間，因此在洗脫時向下移動的速度較快，最先被洗脫。小分子物質除了可在凝膠顆粒間隙中擴散外，還可以進入凝膠顆粒的微孔中，洗脫時向下移動的速度較慢，隨後被洗脫。因此，蛋白質分子按分子大小被分離。
4、離子交換層析法
離子交換層析的原理是利用一些帶離子基團的纖維素或凝膠，吸附交換帶相反電荷的蛋白質抗原。由於各種蛋白質的等電點不同，所帶的電荷量不同，與纖維素（或凝膠）結合的能力有差別。當梯度洗脫時，逐步增加流動相的離子強度，使加入的離子與蛋白質競爭纖維素上的電荷位置，從而使吸附的蛋白與離子交換劑解離。
在離子交換色譜技術中常用的離子交換劑有以下幾種
①具有離子交換基團的纖維素，如羧甲基（CM）纖維素、DEAE-纖維素
②具有離子交換基團的交聯葡聚糖、瓊脂糖和聚丙烯醯胺
③凝膠合成的高度交聯樹脂。
5、親和層析
親和層析是利用生物大分子的生物特異性，即生物大分子間所具有專一親和力而設計的層析技術。例如抗原和抗體、酶和酶抑制劑（或配體）、酶蛋白和輔酶、激素和受體、IgG和葡萄球菌蛋白A（SPA）等物質間具有一種特殊的親和力。例如提純IgG時，可將SPA吸附在一個惰性的固相基質（如Speharose2B、4B、6B等）上，並制備成層析柱。當樣品流經層析柱時，待分離的IgG可與SPA發生特異性結合，其餘成分不能與之結合。將層析柱充分洗脫後，改變洗脫液的離子強度或pH值，IgG與固相基質上的SPA解離，收集洗脫液便可得到欲純化的IgG。

㈨ DEAE纖維素柱的原理

DEAE纖維素柱原理，基於離子交換層析：離子交換層析中，基質是由帶有電荷的樹脂或纖回維素組成。

陰離子答交換基質結合，帶有負電荷的蛋白質，然後這類蛋白質被留在柱子上，然後通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質從而洗脫下來。

(9)deae52纖維素離子交換層析純化igg洗脫液用什麼擴展閱讀：

基本信息：

性狀：乾燥纖維狀。

用途：用於柱色譜分析，用以分離提純多糖、肽、核苷酸、酶、血清組分和病毒等，陰離子交換填料。

保存：常溫乾燥封袋保存。

DEAE—纖維素的使用方法：

稱取IgDEAE32或52，放入5ml量筒中，加蒸餾水浸泡過夜，觀察溶脹後DEAE的體積。根據所需層析柱的柱床體積計算所需DEAE的用量，稱取所需DEAE用蒸餾水浸泡過夜，其間換幾次水，每次除去細小顆粒。

抽干，改用0.5mol/LNaOH溶液浸泡1h以上，抽干（可用布氏漏斗），用無離子水漂洗，使pH至8左右（用pH試紙檢查）。再改用0.5mol/LHCl溶液浸泡1h以上，去酸溶液，用無離子水洗至pH6左右。本實驗中在用前應以0.0175mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液，浸泡平衡後使用。

㈩ deae-陰離子纖維素的使用方法

DEAE－纖維素的處理及裝柱
（1）處理
本實驗採用的是DEAE－纖維素DE 52 是弱酸型陰離子交換劑，具體處理方法為：先將DE52陰離子交換劑乾粉浸泡於蒸餾水中，去除雜質；再在0.5N的HCL溶液中浸泡1－2h,再用無離子水或蒸餾水洗至pH值中性或PH4以上，並將其在抽濾漏斗中抽干；將抽乾的離子交換劑浸泡在0.5N的NaOH溶液中1－2h，再用無離子水或蒸餾水將其洗至中性。
（2）裝柱
將層析柱清洗干凈垂直固定到層析架上，加1/3體積的無離子水，打開下出液口，水流暢通，即刻將小燒杯中裝有適宜濃度的柱材，輕輕倒入層析柱中，凝膠自然慢慢沉降再層析柱底部，凝膠沉積直到離層析柱上端1.5－2cm處，停止裝柱。層析柱上端進液口連接恆流泵，下出口連接蛋白質監測儀，待層析柱的平衡。
（3）平衡
在柱層析上樣前必須對層析柱進行平衡，所謂平衡就是將層析柱中的溶液用層析過程的緩沖液（洗脫液）置換出來，使層析柱中的緩沖系統與柱層析過程中的系統一致。其方法是：利用層析柱上端的恆流泵將平衡緩沖液泵入到層析柱內，打開層析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，當下出口流出液的PH值與平衡緩沖液的PH值一致時，層析柱達到了平衡。在本實驗中，用0.002M Tris-HCL緩沖液PH7.4(內含0.0001M EDTA)，預先將DE-52柱進行平衡。