凝膠過濾分離范圍

❶ 凝膠色譜原理

凝膠色譜技術是六十年代初發展起來的一種快速而又簡單的分離分析技術，由於設備簡單、操作方便，不需要有機溶劑，對高分子物質有很高的分離效果。凝膠色譜法又稱分子排阻色譜法。凝膠色譜主要用於高聚物的相對分子質量分級分析以及相對分子質量分布測試。目前已經被生物化學、分子生物學、生物工程學、分子免疫學以及醫學等有關領域廣泛採用，不但應用於科學實驗研究，而且已經大規模地用於工業生產。
根據分離的對象是水溶性的化合物還是有機溶劑可溶物，凝膠色譜又可分為凝膠過濾色譜（GFC）和凝膠滲透色譜（GPC）。
分離原理：
一個含有各種分子的樣品溶液緩慢地流經凝膠色譜柱時，各分子在柱內同時進行著兩種不同的運動：垂直向下的移動和無定向的擴散運動。大分子物質由於直徑較大，不易進入凝膠顆粒的微孔，而只能分布顆粒之間，所以在洗脫時向下移動的速度較快。小分子物質除了可在凝膠顆粒間隙中擴散外，還可以進入凝膠顆粒的微孔中，即進入凝膠相內，在向下移動的過程中，從一個凝膠內擴散到顆粒間隙後再進入另一凝膠顆粒，如此不斷地進入和擴散，小分子物質的下移速度落後於大分子物質，從而使樣品中分子大的先流出色譜柱，中等分子的後流出，分子最小的最後流出，這種現象叫分子篩效應。具有多孔的凝膠就是分子篩。
各種分子篩的孔隙大小分布有一定范圍，有最大極限和最小極限。分子直徑比凝膠最大孔隙直徑大的，就會全部被排阻在凝膠顆粒之外，這種情況叫全排阻。兩種全排阻的分子即使大小不同，也不能有分離效果。直徑比凝膠最小孔直徑小的分子能進入凝膠的全部孔隙。如果兩種分子都能全部進入凝膠孔隙，即使它們的大小有差別，也不會有好的分離效果。因此，一定的分子篩有它一定的使用范圍。
一是分子很小，能進入分子篩全部的內孔隙；二是分子很大，完全不能進入凝膠的任何內孔隙；三是分子大小適中，能進入凝膠的內孔隙中孔徑大小相應的部分。大、中、小三類分子彼此間較易分開，但每種凝膠分離范圍之外的分子，在不改變凝膠種類的情況下是很難分離的。對於分子大小不同，但同屬於凝膠分離范圍內各種分子，在凝膠床中的分布情況是不同的：分子較大的只能進入孔徑較大的那一部分凝膠孔隙內，而分子較小的可進入較多的凝膠顆粒內，這樣分子較大的在凝膠床內移動距離較短，分子較小的移動距離較長。於是分子較大的先通過凝膠床而分子較小的後通過凝膠床，這樣就利用分子篩可將分子量不同的物質分離。另外，凝膠本身具有三維網狀結構，大的分子在通過這種網狀結構上的孔隙時阻力較大，小分子通過時阻力較小。分子量大小不同的多種成份在通過凝膠床時，按照分子量大小排隊，凝膠表現分子篩效應。

❷ 凝膠過濾法分離蛋白質時,從層析柱上先被洗脫下來的是什麼

選 A
凝膠過濾，與帶點多少沒關系！因為凝膠過濾是根絕分子大小來工作的！
分子量小的，會經過凝膠珠上的孔隙，路程較長，後洗脫下來；
分子量大的，會直接經過凝膠顆粒之間的縫隙，路程較短，會先先脫下來！

❸ 蛋白質溶液中的鹽分為何能通過凝膠過濾方法被脫除

使用凝膠過濾介質Sephadex G10，G15，G25，G50等去除小分子，效率高，處理量可達床體積30%。只需在進樣後收集首1/3-1/2柱體積的洗脫液，就可以去除該填料分離范圍上限以下的小分子，簡單直接。由於只是去除小分子，柱高10cm以上即可。整個過程一般可於數分鍾至半小時完成。Sephadex G25系列介質專為蛋白質脫鹽而設計，預裝柱HiTrap Desalting（5ml）可用針筒操作。HiPrep Desalting(26ml)可在數分鍾為多至10ml樣品脫鹽。選擇孔徑很小的凝膠，在過濾時，由於蛋白質分子半徑較大，所以不能進入凝膠的孔隙，很容易被洗脫，而粒子則被孔隙所吸附，較難洗脫，所以先出來的是蛋白質

❹ 凝膠過濾法分離蛋白質時,從層析柱上先被洗脫下來的是

答案A
用凝膠過濾柱層析分離蛋白質是根據蛋白質分子大小不同進行分離的方法,與蛋白質分子的帶電狀況無關.在進行凝膠過濾柱層析過程中,比凝膠網眼大的分子不能進入網眼內,被排阻在凝膠顆粒之外.比凝膠網眼小的顆粒可以進入網眼內,分子越小進入網眼的機會越多,因此不同大小的分子通過凝膠層析柱時所經的路程距離不同,大分子物質經過的距離短而先被洗出,小分子物質經過的距離長,後被洗脫,從而使蛋白質得到分離.

❺ 蛋白質純化，凝膠過濾層析填料

首先瓊脂糖凝膠可來以排源除，這是大孔凝膠，用於分子量較大的成分。
我做分子篩用的比較多的柱子都是葡聚糖凝膠凝膠，我的蛋白比你的大，用G50和G100的填料，做的結果都沒什麼問題。
你的蛋白7kD，如果沒有什麼特別的性質（高級結構是球形還是其他的，有無多聚），G50應該可以。如果你不放心，也可以考慮聚丙烯醯胺凝膠，它和葡聚糖凝膠相比更適合於分子量稍小的蛋白，可能更實用於你的實驗。
聚苯乙烯凝膠沒用過，不發表意見。

❻ 凝膠過濾層析里為了完全分開兩種組分,樣品為什麼一定不能大於洗脫體積之差

凝膠層析操作中應注意的一些具體問題。 (1)層析柱的選擇層析柱大小主要是根據樣品量的多少以及對解析度的要求來進行選擇。一般來講，主要是層析柱的長度對解析度影響較大，長的層析柱解析度要比短的高；但層析柱長度不能過長，否則會引起柱子不均一、流速過慢等實驗上的一些困難。一般柱長度不超過100cm，為得到高解析度，可以將柱子串聯使用。層析柱的直徑和長度比一般在1:25－1:100之間。用於分組分離的凝膠柱，如脫鹽柱由於對解析度要求較低，所以一般比較短。 (2)凝膠柱的鑒定凝膠柱的填裝情況將直接影響分離效果，關於填裝的方法前面已有介紹，這里主要介紹對填裝好的凝膠柱的鑒定。凝膠柱填裝後用肉眼觀察應均勻、無紋路、無氣泡。另外通常可以採用一種有色的物質，如藍色葡聚糖-2000、血紅蛋白等上柱，觀察有色區帶在柱中的洗脫行為以檢測凝膠柱的均勻程度。如果色帶狹窄、平整、均勻下降，則表明柱中的凝膠填裝情況較好，可以使用；如果色帶彌散、歪曲，則需重新裝柱。另外值得一提的是，有時為了防止新凝膠柱對樣品的吸附，可以用一些物質預先過柱，以消除吸附。 (3)洗脫液的選擇由於凝膠層析的分離原理是分子篩作用，它不象其它層析分離方式主要依賴於溶劑強度和選擇性的改變來進行分離，在凝膠層析中流動相只是起運載工具的作用，一般不依賴於流動相性質和組成的改變來提高解析度，改變洗脫液的主要目的是為了消除組分與固定相的吸附等相互作用，所以和其它層析方法相比，凝膠層析洗脫液的選擇不那麼嚴格。由於凝膠層析的分離機理簡單以及凝膠穩定工作的pH 范圍較廣，所以洗脫液的選擇主要取決於待分離樣品，一般來說只要能溶解被洗脫物質並不使其變性的緩沖液都可以用於凝膠層析。為了防止凝膠可能有吸附作用，一般洗脫液都含有一定濃度的鹽。 (4)加樣量關於加樣前面已經有所介紹，要盡量快速、均勻。另外加樣量對實驗結果也可能造成較大的影響，加樣過多，會造成洗脫峰的重疊，影響分離效果；加樣過少，提純後各組分量少、濃度較低，實驗效率低。加樣量的多少要根據具體的實驗要求而定：凝膠柱較大，當然加樣量就可以較大；樣品中各組分分子量差異較大，加樣量也可以較大；一般分級分離時加樣體積約為凝膠柱床體積的1％－5％左右，而分組分離時加樣體積可以較大，一般約為凝膠柱床體積的10％－25％。如果有條件可以首先以較小的加樣量先進行一次分析，根據洗脫峰的情況來選擇合適的加樣量。設要分離的兩個組分的洗脫體積分別為Ve1和Ve2，那麼加樣量不能超過(Ve1－Ve2)。實際由於樣品擴散，所以加樣量應小於這個值。從洗脫峰上看，如果所要的各個組分的洗脫峰分得很開，為了提高效率，可以適當增加加樣量；如果各個組分的洗脫峰只是剛好分開或沒有完全分開，則不能再加大加樣量，甚至要減小加樣量。另外加樣前要注意，樣品中的不溶物必須在上樣前去掉，以免污染凝膠柱。樣品的粘度不能過大，否則會影響分離效果。 (5)洗脫速度洗脫速度也會影響凝膠層析的分離效果，一般洗脫速度要恆定而且合適。保持洗脫速度恆定通常有兩種方法，一種是使用恆流泵，另一種是恆壓重力洗脫。洗脫速度取決於很多因素，包括柱長、凝膠種類、顆粒大小等，一般來講，洗脫速度慢一些樣品可以與凝膠基質充分平衡，分離效果好。但洗脫速度過慢會造成樣品擴散加劇、區帶變寬，反而會降低解析度，而且實驗時間會大大延長；所以實驗中應根據實際情況來選擇合適的洗脫速度，可以通過進行預備實驗來選擇洗脫速度。一般凝膠的流速是2－10 cm/hr，市售的凝膠一般會提供一個建議流速，可供參考。總之，凝膠層析的各種條件，包括凝膠類型、層析柱大小、洗脫液、上樣量、洗脫速度等等，都要根據具體的實驗要求來選擇。例如樣品中各個組分差異較小，則實驗要求凝膠層析要有較高的解析度，提高解析度的選擇應主要包括：選擇包括各個待分離組分但分離范圍盡量小一些的凝膠，選擇顆粒小的凝膠，選擇解析度高的凝膠類型，選擇較長、直徑較大的層析柱、減少加樣量、降低洗脫速度等等。

❼ 凝膠過濾層析常用介質有哪些凝膠過濾層析技術有何優點與用途

1.凝膠層析操作簡便，所需設備簡單。有時只要有一根層析柱便可進行工作。分離介質—凝膠完全不需要像離子交換劑那樣復雜的再生過程便可重復使用。
2.分離效果較好，重復性高。最突出的是樣品回收率高，接近100%。
3.分離條件緩和。凝膠骨架親水，分離過程又不涉及化學鍵的變化，所以對分離物的活性沒有不良影響。
4.應用廣泛。適用於各種生化物質，如肽類、激素、蛋白質、多糖、核酸的分離純化、脫鹽、濃縮以及分析測定等。分離的分子量范圍也很寬，如SephadexG類為102～105d；Sepharose類為105～108d。
5.解析度不高，分離操作較慢。由於凝膠層析是以物質分子量的不同作為分離依據的，分子量的差異僅表現在流速的差異上，所以分離時流速必須嚴格把握。因而分離操作一般較慢。而且對於分子量相差不多的物質難以達到很好的分離。此外，凝膠層析要求樣品粘度不宜太高。凝膠顆粒有時還有非特異吸附現象。

❽ 凝膠色譜的分類

根據分離的對象是水溶性的化合物還是有機溶劑可溶物，凝膠色譜又可分為凝膠過濾色譜（GFC）和凝膠滲透色譜（GPC）。
凝膠過濾色譜
凝膠過濾色譜一般用於分離水溶性的大分子，
如多糖類化合物。凝膠的代表是葡萄糖系列，洗脫溶劑主要是水。
凝膠滲透色譜法
凝膠滲透色譜法主要用於有機溶劑中可溶的高聚物 (聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等)相對分子質量分布分析及分離，常用的凝膠為交聯聚苯乙烯凝膠，洗脫溶劑為四氫呋喃等有機溶劑。
凝膠色譜不但可以用於分離測定高聚物的相對分子質量和相對分子質量分布，同時根據所用凝膠填料不同，可分離油溶性和水溶性物質，分離相對分子質量的范圍從幾百萬到100以下。
凝膠色譜也廣泛用於分離小分子化合物。化學結構不同但相對分子質量相近的物質，不可能通過凝膠色譜法達到完全的分離純化的目的。

❾ 凝膠過濾層析的原理是什麼

基本原理：凝膠過濾層析也稱分子篩層析、排阻層析。是利用具有網狀結構的凝膠的分子篩作用，根據被分離物質的分子大小不同來進行分離。

層析柱中的填料是某些惰性的多孔網狀結構物質，多是交聯的聚糖（如葡聚糖或瓊脂糖）類物質，小分子物質能進入其內部，流下時路程較長，而大分子物質卻被排除在外部，下來的路程短，當一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時，溶液中的物質就按不同分子量篩分開了。

凝膠層析的特點：

1）凝膠層析操作簡便，所需設備簡單。有時只要有一根層析柱便可進行工作。分離介質——凝膠完全不需要像離子交換劑那樣復雜的再生過程便可重復使用。

2）分離效果較好，重復性高。最突出的是樣品回收率高，接近100%。

3）分離條件緩和。凝膠骨架親水，分離過程又不涉及化學鍵的變化，所以對分離物的活性沒有不良影響。

4）應用廣泛。適用於各種生化物質，如肽類、激素、蛋白質、多糖、核酸的分離純化、脫鹽、濃縮以及分析測定等。分離的分子量范圍也很寬，如Sephadex G類為102-105 D；Sepharose類為105-108 D。

以上內容參考：網路-凝膠過濾層析

❿ 影響凝膠過濾分離效果的有哪些因素，為什麼

(1)層析柱的選擇
層析柱大小主要是根據樣品量的多少以及對解析度的要求來進行選擇。一般來講，主要是層析柱的長度對解析度影響較大，長的層析柱解析度要比短的高；但層析柱長度不能過長，否則會引起柱子不均一、流速過慢等實驗上的一些困難。一般柱長度不超過100cm，為得到高解析度，可以將柱子串聯使用。層析柱的直徑和長度比一般在1:25－1:100之間。用於分組分離的凝膠柱，如脫鹽柱由於對解析度要求較低，所以一般比較短。

(2)凝膠柱的鑒定
凝膠柱的填裝情況將直接影響分離效果，關於填裝的方法前面已有介紹，這里主要介紹對填裝好的凝膠柱的鑒定。凝膠柱填裝後用肉眼觀察應均勻、無紋路、無氣泡。另外通常可以採用一種有色的物質，如藍色葡聚糖-2000、血紅蛋白等上柱，觀察有色區帶在柱中的洗脫行為以檢測凝膠柱的均勻程度。如果色帶狹窄、平整、均勻下降，則表明柱中的凝膠填裝情況較好，可以使用；如果色帶彌散、歪曲，則需重新裝柱。另外值得一提的是，有時為了防止新凝膠柱對樣品的吸附，可以用一些物質預先過柱，以消除吸附。

(3)洗脫液的選擇
由於凝膠層析的分離原理是分子篩作用，它不象其它層析分離方式主要依賴於溶劑強度和選擇性的改變來進行分離，在凝膠層析中流動相只是起運載工具的作用，一般不依賴於流動相性質和組成的改變來提高解析度，改變洗脫液的主要目的是為了消除組分與固定相的吸附等相互作用，所以和其它層析方法相比，凝膠層析洗脫液的選擇不那麼嚴格。由於凝膠層析的分離機理簡單以及凝膠穩定工作的pH 范圍較廣，所以洗脫液的選擇主要取決於待分離樣品，一般來說只要能溶解被洗脫物質並不使其變性的緩沖液都可以用於凝膠層析。為了防止凝膠可能有吸附作用，一般洗脫液都含有一定濃度的鹽。

(4)加樣量
關於加樣前面已經有所介紹，要盡量快速、均勻。另外加樣量對實驗結果也可能造成較大的影響，加樣過多，會造成洗脫峰的重疊，影響分離效果；加樣過少，提純後各組分量少、濃度較低，實驗效率低。加樣量的多少要根據具體的實驗要求而定：凝膠柱較大，當然加樣量就可以較大；樣品中各組分分子量差異較大，加樣量也可以較大；一般分級分離時加樣體積約為凝膠柱床體積的1％－5％左右，而分組分離時加樣體積可以較大，一般約為凝膠柱床體積的10％－25％。如果有條件可以首先以較小的加樣量先進行一次分析，根據洗脫峰的情況來選擇合適的加樣量。設要分離的兩個組分的洗脫體積分別為Ve1和Ve2，那麼加樣量不能超過(Ve1－Ve2)。實際由於樣品擴散，所以加樣量應小於這個值。
從洗脫峰上看，如果所要的各個組分的洗脫峰分得很開，為了提高效率，可以適當增加加樣量；如果各個組分的洗脫峰只是剛好分開或沒有完全分開，則不能再加大加樣量，甚至要減小加樣量。另外加樣前要注意，樣品中的不溶物必須在上樣前去掉，以免污染凝膠柱。樣品的粘度不能過大，否則會影響分離效果。

(5)洗脫速度
洗脫速度也會影響凝膠層析的分離效果，一般洗脫速度要恆定而且合適。保持洗脫速度恆定通常有兩種方法，一種是使用恆流泵，另一種是恆壓重力洗脫。洗脫速度取決於很多因素，包括柱長、凝膠種類、顆粒大小等，一般來講，洗脫速度慢一些樣品可以與凝膠基質充分平衡，分離效果好。但洗脫速度過慢會造成樣品擴散加劇、區帶變寬，反而會降低解析度，而且實驗時間會大大延長；所以實驗中應根據實際情況來選擇合適的洗脫速度，可以通過進行預備實驗來選擇洗脫速度。一般凝膠的流速是2－10 cm/hr，市售的凝膠一般會提供一個建議流速，可供參考。總之，凝膠層析的各種條件，包括凝膠類型、層析柱大小、洗脫液、上樣量、洗脫速度等等，都要根據具體的實驗要求來選擇。例如樣品中各個組分差異較小，則實驗要求凝膠層析要有較高的解析度，提高解析度的選擇應主要包括：選擇包括各個待分離組分但分離范圍盡量小一些的凝膠，選擇顆粒小的凝膠，選擇解析度高的凝膠類型，選擇較長、直徑較大的層析柱、減少加樣量、降低洗脫速度等等。