㈠ 細胞外泌體是什麼
外泌體——是一類有細胞釋放的細胞外囊泡。外泌體的特點見正文。
細胞外囊泡——簡稱EV，是由細胞釋放的各種具有膜結構的囊泡結構統稱，這些囊泡的直徑可以從30、40nm到8、9um。細胞外囊泡有不同的亞群，而目前研究最火熱的是外泌體這個亞群。
然而由於目前很難純化到非常純的外泌體亞群，人們純化到的通常是直徑小於200nm的囊泡，因此越來越多的人開始稱之為sEV（即 small extracellular vesicle，小細胞外囊泡）。為了嚴謹，所以今天我們也以細胞外囊泡來稱呼這些膜泡結構。本文中沒有特殊說明的情況下，細胞外囊泡主要指外泌體和微囊泡。
今天主要介紹內容包括細胞外囊泡的研究意義、細胞外囊泡的分類、細胞外囊泡含有的成分、細胞培養上清的制備、細胞外囊泡的保存、細胞外囊泡的鑒定實驗要求。所有內容都參考目前已發表的綜述，並非hzangs杜撰。所以請新朋友們放心學習。
細胞外囊泡的研究意義
目前，細胞外囊泡的功能還沒有完全闡明。已有的報道認為它們能夠調節宿主-病原體的相互作用，參與傳染性和炎性疾、神經疾病和癌症等很多種疾病的病理過程，同時在正常的生理過程中也發揮著介導細胞間通訊的重要功能，已有文章報道細胞外囊泡在發育中也發揮著重要作用。細胞外囊泡在臨床醫學中也有十分光明的應用前景，主要是因為它們含有豐富的生物標志物，可用於監測臨床狀態，治療反應，疾病進展等，同時由於它們具有遞送生物分子的功能，因此它們還有發展成臨床葯物遞送載體的潛力。
細胞外囊泡的分類
細胞外囊泡—這個詞是由國際細胞外囊泡學會（ISEV）創造的術語，根據細胞外囊泡的生物合成或釋放途徑可以對囊泡進行分類：外泌體（exosomes）直徑為30-150nm，起源於內吞途徑，其密度約為1.11-1.19g mL-1；微粒/微囊泡（microparticles/microvesicles）直接從質膜釋放，直徑約100-1000nm；凋亡小體（apoptotic body/bleb）直徑約為50nm-2μm，由細胞凋亡產生；腫瘤小泡（large oncosomes）直徑約1-10μm，由腫瘤細胞釋放產生；以及其他各種EV亞群。由於不同EV亞群的大小以及它們的所包含的生物分子存在差異，因此現在已經有幾個小組開始表徵EV亞群的組成。最近的論文聲稱，基於一般表面蛋白質組學分析或個別EV群體的轉錄譜，對細胞外囊泡進行了成功的亞群分類。目前可以通過差速離心、過濾、免疫親和、層析、流式細胞分選、密度梯度離心選取不同密度區域等多種手段大致分離不同的細胞外囊泡亞群，但是這些方法都不能完全純化到特定的亞群，分離到的通常是富集了某一個亞群同時帶有其他細胞外囊泡亞群。
細胞外囊泡含有的成分
細胞外囊泡的組成成分並不是隨機的，每一個細胞外囊泡都會攜帶特定的分子信息。 實際上，這些納米尺寸的細胞外囊泡能夠攜帶蛋白質，脂質，核酸和糖等生物活性分子在細胞間傳遞信號，並且其包裝的獨特分子構成決定了要傳遞給受體細胞的細胞外信號的類型。有一個復雜的分選系統來決定那些分子能夠進入細胞外囊泡。
細胞培養上清的制備
目前有兩個策略來制備細胞培養上清用於提取細胞外囊泡。使用去除細胞外囊泡的胎牛血清（FBS）培養基培養細胞和使用不含FBS的培養基培養細胞（血清飢餓細胞）。但是目前一些高水平的文章報道使用的方法通常是前者。另外，有些文章開始關注去除細胞外囊泡的胎牛血清中游離RNA對實驗結果的影響，但是目前並沒有形成共識。如果需要先儲存培養上清，一定量後再用於細胞外囊泡分離，那需要預先去除體系中的死細胞和細胞碎片。
細胞外囊泡的保存
Lőrincz等人曾對中性粒細胞來源的細胞外囊泡做了不同條件的儲存，之後再去分析這些囊泡的特性，他們發現雖然細胞外囊泡樣品中囊泡數量和形態沒有明顯變化，但即使是儲存在-20或-80攝氏度情況下的細胞外囊泡也存在磷酯醯絲氨酸外翻明顯增多的情況；但他們同時也發現，尿液來源的細胞外囊泡並沒有這些變化。Kalra等人分離了來自結直腸癌細胞的細胞外囊泡，不同條件保存一定時間後進行PKH67染色跟蹤細胞外囊泡的攝取，分析發現這些囊泡依舊可以被細胞攝取。就目前的情況，學者們並未就儲存條件對細胞外囊泡是否有影響達成共識。因此建議大家實驗時分離細胞外囊泡後盡快用於實驗，盡量減少儲存過程。
細胞外囊泡的鑒定及實驗要求
根據國際細胞外囊泡協會於2014年發表的一個指導手冊（MISEV），鑒定外泌體首先需要通過WB來鑒定細胞外囊泡的標志蛋白是否存在於樣品中，通過電子顯微鏡來觀察樣品中細胞外囊泡的形態特徵，通過NTA等手段來分析樣品中細胞外囊泡的群體特徵（粒子濃度、直徑分布等）。
今天就先介紹到這里。細胞外囊泡領域作為生物學研究中的一個新興領域越來越受到學者和生物公司的關注，也有越來越多的研究報道出現。但是我們也要清楚的認識到該領域的研究技術依舊不完善，對細胞外囊泡的認識依舊不充分，細胞外囊泡研究依舊處於一個起始階段，要走的路還很長。
㈡ 外泌體保存液是什麼
外泌體(exosomes)是一種由活細胞分泌，直徑在30-150nm，具有雙層脂質膜結構的小囊泡，它在機體內廣泛存在，如外周血、腹水、尿液、唾液、腦脊液等各種體液中，內含豐富的蛋白質、脂質以及核酸等生物活性成分。外泌體參與物質運輸，還攜帶和傳遞重要的生物信息，在介導免疫抗原遞呈、樹突狀細胞的活化、神經退行性疾病發生、腫瘤細胞抗原的轉移及腫瘤診斷治療中發揮重要作用，吸引了很多科研人員的關注，在深入研究外泌體前，外泌體的提取純化、鑒定及合理保存是首要的步驟，也是一切後續實驗的基礎，只有高活性、高穩定性的外泌體才能確保後續實驗的質量和可信度。
目前外泌體只能在2～8℃穩定保存3天，-20℃穩定保存1個月。長期保存需要-80℃低溫，並且不能凍融，存儲條件要求高，這些缺點影響了外泌體的深入研究。
由此，有效保持外泌體的完整性、生物活性和內含物穩定性的外泌體保存液仍有待開發。
㈢ 用血清超速離心法提取外泌體，能提取到多少
絕大多數培養基是建立在平衡鹽溶液(BSS)基礎上，添加了氨基酸、維生素和其它與血清中濃度相似的營養物質。最廣泛應用的培養基是Eearle`s MEM 的混合物，其中含有13種必須氨基酸、8種維生素。而Ham`s F12 也包括非必須氨基酸，維生素的范圍亦很廣，另外常規含有無機鹽和代謝添加劑（例如核苷酸）。MEM/F12 這兩種培養基各取1/2，形成神經生物學最通用的培養基。Dulbecco`s改良培養基——DMEM，現應用於快速生長的細胞，同MEM含有相同的營養成分，但濃度高出2~4倍
㈣ 樣品直接提取microrna和通過外泌體提取microrna有什麼區別
首先要了解microRNA的分布，例如在血漿中microRNA有三種分布形式：游離狀態、與蛋白結合形成復合體、包涵在囊泡中（外泌體是囊泡的一種）。
這樣就清楚了，直接提是提全部，外泌體提取只針對一部分。
㈤ 什麼是外泌體保存液
Exosome樣本是進行有關外泌體的實驗的基礎，很多童靴認為這是最簡單的。如果你真的這么認為，那麼就大錯特錯了。收集樣本有不同的要求，一個比一個重要。那該如何去選擇我們的實驗樣本？取樣的時候又該注意些什麼？分離好後的外泌體又如何保存呢？
一、外泌體樣本的選擇和注意事項
實驗樣本不同在收集的時候需要注意的點不同。你研究的是哪種樣本，需要特別注意哪些方面呢？看以下闡述：
1、細胞上清
選用細胞培養上清作為分離外泌體的實驗材料不會像血樣等存在樣本量限制的問題，而且操作簡單，直接離心即可。但在細胞培養過程中需注意污染、培養時間、細胞死亡率及FBS的問題。和所有的細胞實驗一樣，培養過程中不允許有污染，但有些培養細胞本身帶有病毒基因組，在培養過程中會釋放出病毒顆粒，這就要衡量病毒顆粒是否會影響後續實驗。
一般培養24-48h後細胞即可分離外泌體，在特殊情況下，如在培養基中添加特殊的化學物質，培養15-60min即可收集。因細胞死亡會分泌小體，所以在研究外泌體時細胞的死亡率一定要控制 5% 之內。未經處理的FBS中含有大量的外源外泌體，所以細胞培養一定要用經過處理不含外泌體的FBS。
2、唾液
唾液的成分會因取樣的位置和時間不同而不同，所以同血樣一樣需定點定時。唾液主要由舌下腺，頜下腺及腮腺3個腺體分泌，所以不同位置的唾液成分不同，在收集的時候需固定位置或是收集所有的唾液。不同時間段的唾液成分也會不一樣，所以也需定時取。其他如吸煙進食都是禁止的，一般建議采樣1h之內不能有進食行為，包括飲料，且不要劇烈運動，在平息狀態下取樣。最後一點，不能刷牙。
3、血液
在第一次外泌體課程的時候，就有許多同學問到關於血清和血漿選擇的問題，那到底應該選哪個呢?血漿=血液-血細胞 血清=血漿-纖維蛋白原-凝血因子
分不清楚兩者的弄清血清的來源就能牢牢記住啦。血清是血液凝固之後收集的液體，所以其中少了纖維蛋白原，凝血因子，以及多了很多凝血產物。纖維蛋白原可轉化為纖維蛋白，具有凝血功能。在凝血過程中血小板會分泌大量的外泌體，有研究發現血清中有接近50%的外泌體來自額外的分泌。所以一般實驗選擇血漿，在特殊情況下，如研究與血小板相關的疾病的時候，當然是血清更適合。
受限於樣本，血樣一般取2ml。那取血樣的時候有什麼注意的地方呢？在外泌體的血樣研究中，經常被忽略的一個問題就是針頭的大小。在抽血過程中，血液流經針頭的時候會產生剪切力，若針頭太細，剪切力較大，會使細胞破碎或刺激血小板分泌外泌體，從而影響後續的實驗。有些文獻報道21號針頭的大小比較合適作為外泌體研究的血樣收集。其他諸如采血的位置，人的生理周期，飲食周期及時間周期（24h）等都會影響樣品中的外泌體。所以取樣的時候盡量定點定時。最後還需注意，盡量在采血30min內處理樣本，因血液收集在收集管中時，血細胞和血小板還會分泌外泌體。
4、鼻涕
研究鼻涕有一個特殊的價值，其可以探索治療性外泌體。啥是治療性外泌體？在腦部的疾病治療中，葯物可以外泌體的方式注射到鼻腔，這樣葯物就可以避開血腦屏障。鼻涕的收集與許多環境因素相關，如年齡、季節、性別 、城市、過敏史及職業風險。鼻涕的收集方法沒有統一標准，只需保證所有樣本取樣方法一致即可。
5、尿液
在尿液的取樣中，除性別、年齡、進食等影響外，還有一個特殊的點即是尿液的新鮮程度，這個新鮮度指的是尿液在膀胱中存在的時間。
6、乳汁
乳汁中存在的外泌體、抗體等會影響新生兒的發育，具有較大的研究價值。泌乳的階段、 胎次、膳食、泌乳量、是否是母乳喂養、母親的健康狀態、精神狀態等都會影響外泌體的分泌。需要注意的是乳汁中含有大量的脂蛋白，會對後面分離外泌體產生影響。
7、腦脊液
腦脊液研究面臨的困難主要在樣本的獲取及樣本中外泌體豐度少，有木有一種雪上加霜的感覺。那這個問題如何解決？國外可購買商業正常樣本或者使用其他疾病樣本作為對照。
二、外泌體的保存
對於外泌體的保存，和其他分子樣品一樣，提取的外泌體低溫保存即可，短時間（一周之內）可放4度，長時間放-20或-80。也有人認為放4度更好，怕低溫凍融會影響外泌體的完整性，但目前還沒有一個定論，而且大部分文獻認為沒有影響。那到底放幾度呢？有一招，分裝放-20或-80，是不是妥妥的。
㈥ 什麼是外泌體保存液，外泌體保存液介紹
外泌體(exosomes)是一種由活細胞分泌，直徑在30-150nm，具有雙層脂質膜結構的小囊泡，它在機體內廣泛存在，如外周血、腹水、尿液、唾液、腦脊液等各種體液中，內含豐富的蛋白質、脂質以及核酸等生物活性成分。外泌體參與物質運輸，還攜帶和傳遞重要的生物信息，在介導免疫抗原遞呈、樹突狀細胞的活化、神經退行性疾病發生、腫瘤細胞抗原的轉移及腫瘤診斷治療中發揮重要作用，吸引了很多科研人員的關注，在深入研究外泌體前，外泌體的提取純化、鑒定及合理保存是首要的步驟，也是一切後續實驗的基礎，只有高活性、高穩定性的外泌體才能確保後續實驗的質量和可信度。
目前外泌體只能在2～8℃穩定保存3天，-20℃穩定保存1個月。長期保存需要-80℃低溫，並且不能凍融，存儲條件要求高，這些缺點影響了外泌體的深入研究。
由此，有效保持外泌體的完整性、生物活性和內含物穩定性的外泌體保存液仍有待開發。
㈦ 提取組織中的rna，會把外泌體中的rna也提出來了嗎
細胞外的RNA 通常是miRNA了，血漿可做，培養上清也可以，但RNA的提取需要特殊試劑盒，細胞外RNA通常在外泌體，不過看你要做哪方面的實驗，一般來說檢測培養上清中的RNA沒有太大意義
㈧ 一般從血中能提取到多少ug的外泌體
看書
㈨ 外泌體添加化妝品里是多少單位
ml是體積單位，g是重量單位。
重量單位和體積單位的關系式為：質量=體積×密度。在不知道化妝品的密度的情況下，無法准確計算出質量。
以水的密度來看，1ml=1g，而大多液體護膚品以ml來計算，乳液、霜用g來計算，這是根據不同狀態來區分的，所以化妝品會有ml和g兩種單位。
9月21日下午，國家葯監局於官網發布《化妝品標簽管理辦法（徵求意見稿）》，消息甫出，業界嘩然。其中爭論的核心問題仍在於成分標注引發的功效宣稱問題，這也是新《化妝品監督管理條例》（下稱新《條例》）頒布帶來的後遺症。
更多人認為，法規「意見稿」才是真正需要行業媒體表達聲音的時候。《化妝品報》綜合多位業內專家意見，幫助行業更好的理解法規最新動向。
1、微量添加等於概念性添加？
《辦法》引發爭議最多的是第12條關於微量成分標注的規定。
按照《辦法》，「化妝品配方中存在含量不超過0.1%（w/w）的成分的，所有不超過0.1%（w/w）的成分應當以「其他微量成分」作為引導語引出另行進行標注，可不按照配方含量的降序列出。」
立刻就有人問，添加低於0.1%的成分就能起作用的化妝品怎麼辦？起到功效的成分還被列入了其他微量成分，這讓品牌怎麼宣傳？
某原料公司的工程師告訴記者，從葯品來講，0.1%就能表達功效的成分是存在的，但在化妝品領域，對一般的美白、抗衰等功效而言，低於0.1%的含量就能起效的成分幾乎沒有。低於0.1%的添加還能發揮功效的，就只有防腐劑，它在低於0.1%的劑量下就可以起到防腐功效，但沒有化妝品會去宣稱自己的防腐功效。
對於業內盛傳的 ppm級別（百萬分之一）就能發揮化妝品功效的成分，該工程師告訴記者，他找不到這樣的成分。但復配是個個例。他舉例，化妝品的防曬或美白等功效通常需要通過多種防曬劑的組合添加方能奏效。以防曬為例，每個防曬劑都只有0.05%的含量，但這些成分復配起來，其總含量就超過了0.1%的可能性，但這些依然要被列在其他微量成分里。
除了復配的功效成分，被業界熱議的主要是活性成分——在化妝品中，添加微量即能起到功效的成分主要是活性成分提取物。不過，在活性成分的添加含量之外，還有一個活性物的純度問題。換言之，純度和活性都會影響產品的功效。譬如許多日本的廠商將原料買回去後，都會進行二次處理，目的就是提純，利用高純度的活性成分提高產品功效。
有人認為，《辦法》看起來更像是在鼓勵企業購買低成本低純度的活性成分。而那些添加了高純度活性物的化妝品，卻要被當做概念性化妝品加以打擊。新《辦法》似乎只強調了含量而未提及純度，這一看法顯然不夠全面。實際上，今年8月推出的《化妝品注冊與備案資料規范》（徵求意見稿）和《化妝品新原料注冊與備案資料規范》（徵求意見稿），已經對化妝品原料和成分做出了詳細的說明規定——要求化妝品企業在備案的時候，提交每個原料和成分的質量規格，也就是說，純度問題在產品上市之前的注冊和備案環節，就已經被「關照」到位。
對於一開始就奔著鑽法規空子，利用低成本低純度的成分，存心虛假宣傳的品牌和企業來說，概念性添加的這扇門是嚴嚴實實地關上了，而對於真正想要認真做好品牌，拿真材實料嚴謹宣稱的企業和品牌來說，新《辦法》實際上是保護了他們。換言之，新《辦法》對越規范的廠商越友好，尤其是本來就很注重法規不越界的品牌方。
更多人的理解是正面的——《辦法》的主要作用是換種方式告訴大家不要亂來。拜爾斯道夫中國區企業事務及法務總經理雷開霆認為，為了一點點宣稱，添加一點點的含量，其實難以保證功效，新的規定對於正規的企業是個好事情。「我想這也是監管部門從規范化妝品市場，讓消費者擁有更多知情權、讓品牌方真正做好產品的角度出發的吧。」
恩特科技總經理賈逸丹在接受記者采訪時表示，「這需要行業上下共同對消費者進行教育，久而久之，消費者會明白，功效不取決於是否添加了某個成分，而是依據產品真實的功效驗證。」賈逸丹認為，這將引導消費者去關注國家網站上公布的各個產品功效評價。
2、沒有「偏向」進口品
反而增加了包材成本
有人說《辦法》對進口品更友好，但也有人認為，《辦法》實際上增加了進口品進入中國市場的成本。「標簽的管理規定本身對國產和進口就是基本一致的，特別是中文體現的部分，不存在偏袒哪一方。如果一定要說的話，反而進口品的外文原包裝也在一定程度上受到了監管，相當於是要按照中國的標准來了，要求是變嚴了，這在『起草說明』 里也有提到。」
比如，《辦法》規定，直接接觸內容物的產品包裝容器上必須有中文名及保質期限的相關規定，也會對進口產品在原包裝方面提出要求。眾所周知，許多進口化妝品並未在接觸內容物的產品包裝上印有中文名和保質期限，特別是歐洲的產品，瓶身上很對只有產品批號，既沒有中文標簽，也沒有保質期限。如果按照新《辦法》，許多進口化妝品的包裝都得更換，而這對企業來說無疑增加了很多成本。
此外，《辦法》對產品原包裝提出的要求，預計會引發一定的貿易關注，但考慮到《辦法》只是對上位法《條例》相關內容的細化，且國外也有類似的管理規定，在繼續堅持的同時，需要進一步做好溝通解釋工作。
實際上，2014年《標簽管理辦法》對外徵求意見時，引發最多貿易關注的部分就是借鑒葯品的規定，必須專為中國設計中文包裝。新《條例》在起草的過程中，對此條款進行了修訂，規定可以加貼中文，但外文原包裝的內容必須與加貼的中文標簽一致，此做法較過去比相對寬松，但中文與外文一致，也強制了國外原包裝必須符合中國的法規要求。也就是說，從《條例》到《辦法》，法規對進口產品的監管也是同步趨嚴的，甚至可以說，對進口產品提出了更大的挑戰。
3、冰點監管之下
化妝品行業或迎「跨境」潮
洗牌是必然的。「你去看新法規裡面有多少規定，光是備案資料規范就有81頁，我都還沒看完，更不用說所謂的化妝品不良反應監管機制將跟接下來的續證掛鉤，對質量負責人也有明文的專業及從業年資要求。」王楠預測，《辦法》推出後，很多隻會營銷而不是真正專注做產品的品牌，尤其是現在一堆所謂互聯網品牌，會在新一波法規實施後遇到很大的麻煩，甚至被洗牌。
《辦法》意見稿推出的第二天，一家電子商務公司的則招聘啟事引發了法規專業人士王楠（化名）的注意。在這個護膚產品經理的招聘上，明確要求產品經理要熟悉歐美系或日系產品開發動向。王楠說，這家企業對風向把控的很准——標準的電子商務公司要做跨境的節奏。
「跨境電商屬於個人自用，民眾自行負擔風險，化妝品法規再嚴跟我（跨境電商）沒有關系。」王楠說，未來一到兩年內，大批的化妝品互聯網公司將轉向海外代工、加入跨境電商大軍。
他還向記者透露，從2021年1月1日起，新的《化妝品監督管理條例》正式實施之際，各項配套法規或將逐條分批實施。
㈩ 外泌體提取用trizol可以嗎
如何用癌細胞的細胞分泌外液中提取外泌體
小膠質細胞(microglia)是神經膠質細胞的一種，相當於腦和脊髓中的巨噬細胞，是中樞神經系統(CNS)中的第一道也是最主要的一道免疫防線。小膠質細胞大約佔大腦中的神經膠質細胞的20%。小膠質細胞不停地清除著中樞神經系統中的損壞的神經，斑塊及感染性物質。無數臨床上和神經病理學研究表明激活的小膠質細胞在神經退化類疾病的發病機理中起到十分重要的作用，如帕金森病，多發性硬化和阿茲海默症等。但是過多激活或失控的小膠質細胞會引起神經毒性。他們是促炎因子和氧化應激的重要來源，如腫瘤壞死因子（TNF），一氧化氮，白介素等有神經毒性的物質