㈠ 离子交换层析具体操作
离子交换层析操作详解
1. 预处理和装柱是离子交换层析的关键步骤。首先，对于离子交换纤维素，需要流水冲洗去除碎屑，以确保均匀度。若产品已溶胀，可跳过这步，但需确保其成为带H+或OH-的交换剂型。阴离子交换剂通常采用“碱-酸-碱”处理，转变成-OH-或盐型，阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，变为-H-型。装柱前，平衡至所需的pH和离子强度，并减压排除气泡。为了防止颗粒分层，装柱时需适当加压，确保柱床紧实，以提高分辨率。装好后，需用起始缓冲液淋洗，直至达到平衡状态方可使用。
2. 加样与洗脱阶段，样品应与起始缓冲液保持相同的pH和离子强度，选择的pH值应在交换剂与结合物相反电荷的范围内，同时离子强度要低，可通过透析、凝胶过滤或稀释来调整。不溶物需预先除去。合适的上样量是关键，一般不超过柱子的负荷能力，上样量通常为交换剂总量的1%-5%。洗脱样品时，可通过改变pH或离子强度，或采用阶段洗脱或连续梯度洗脱法，后者通过控制两个容器中缓冲液浓度的梯度变化来达到最佳分离效果。在洗脱过程中，需确保洗脱液体积充足，梯度上限足够高且上升速度适中，以防止目的物过早或过晚解吸。
3. 洗脱后的分析，以5-10毫升/管收集洗脱液，通过检测方法（如生物活性测定或免疫学测定）确定目的物位置，然后进行回收。对于离子交换剂的再生，如纤维素可用NaCl和NaOH溶液处理，脂溶性物质则需非离子型去污剂或乙醇清洗。保存时，需添加防腐剂，阴离子交换剂通常使用氯已定，阳离子交换剂则使用乙基硫柳汞，有些产品可添加叠氮钠。
离子交换层析操作需严格把控各个步骤，确保样品处理得当，洗脱过程有效，以实现理想的分离效果。
离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。1
㈡ 离子交换层析法分离单核苷酸 求一份实验结果
氨基酸的分离鉴定——纸层析法
一,实验目的
掌握氨基酸纸层析的方法和原理,学会分析待
测样品的氨基酸成分.
二,实验原理
纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析.滤纸纤维上的羟基具有亲水性,吸附一层水作为固定相,有机溶剂为流动相.当有机相流经固定相时,物质在两相间不断分配而得到分离.
溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示:
Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离
在一定的条件下某种物质的Rf值是常数.Rf值的大小与物质的结构,性质,溶剂系统,层析滤纸的质量和层析温度等因素有关.本实验利用纸层析法分离氨基酸.
三,实验器材
(1)大烧杯(5000mL):1只/组
(2)微量注射器(100 L):1只/ 组.
(3)喷雾器:公用.
(4)培养皿:1只/组.
(5)层析滤纸(长22cm,宽14cm的新华一号滤纸):1张/组.
(6)直尺,铅笔:自备.
(7)电吹风:1只/组.
(8)托盘,针,白线:1套/组.
(9)手套:1双/组.
(10)塑料薄膜:公用.
(11)小烧杯:50mL,1只/组.
四,实验试剂
(1)扩展剂:将4体积正丁醇和1体积冰醋酸放入分液漏斗中,与5体积水混合,充分振荡,静置后分层,弃去下层水层.
(2)氨基酸溶液:0.5%的已知氨基酸溶液3种(赖氨酸,苯丙氨酸,缬氨酸),0.5%的待测氨基酸液1种.
(3)显色剂:0.1%水合茚三酮正丁醇溶液.
实验试剂
五,实验操作
检查培养皿是否干燥,洁净;若否,将其洗净并置于干燥箱内120℃烘干.
(1)平衡:剪一大块塑料薄膜铺在桌面上,将层析缸或大烧杯到置于塑料薄膜上,再把盛有约20mL展层溶液的小烧杯置于倒置的层析缸或大烧杯中,用塑料薄膜密封起来,平衡20min.
(2)规划:带上手套,取宽约14cm,高约22cm的层析滤纸一张.在纸的下端距边缘2cm处轻轻用铅笔划一条平行于底边的直线A,在直线上做4个记号,记号之间间隔2cm,这就是原点的位置.另在距左边缘1cm处画一条平行于左边缘的直线B,在B线上以A,B两线的交点为原点标明刻度(以厘米为单位),参见左图.
(3)点样:用微量注射器分别取10mL左右的氨基酸样品(每取一个样之前都要用蒸馏水洗涤微量注射器,以免交叉污染),点在这四个位置上.挤一滴点一次,同一位置上需点2～3次,2～3mL/次,每点完一点,立刻用电吹风热风吹干后再点,以保证每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm.每人须点4个样,其中3个是已知样,1个是待测样品.
(4)层析:用针,线将滤纸缝成筒状,纸的两侧
边缘不能接触且要保持平行,参见图3-3.向培养皿中加入扩展剂,使其液面高度达到1cm左右,将点好样的滤纸筒直立于培养皿中(点样的一端在下,扩展剂的液面在A线下约1cm),罩上大烧杯,仍用塑料薄膜密封.当扩展剂上升到A线时开始计时,每隔一定时间测定一下扩展剂上升的高度,填入表3-1中.当上升到15～18cm,取出滤纸,剪断连线,立即用铅笔描出溶剂前沿线,迅速用电吹风热风吹干.
(5)显色:用喷雾器在通风厨中向滤纸上均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液,然后立即用热风吹干,即可显出各层析斑点,参见左图.
(6)计算各种氨基酸的Rf值,并判断混合样品中都有哪些氨基酸,各人将自己的实验结果贴在实验报告上,见表3-2.
(7)以层析时间为横坐标,扩展剂上升高度为纵坐标画图,求出扩展剂上升到18cm时所需要的时间.
(8)将微量注射器内外用蒸馏水清洗干净,倒掉用过的展层液和平衡液,将培养皿洗净,整理好桌面上的仪器和试剂
㈢ 求问怎么用离子交换树脂层析分离混合氨基酸
离子交换树脂作为一种合成高聚物，不溶于水，能吸水膨胀。高聚物分子由能电离的极性基团及非极性的树脂组成。极性基团上的离子能与溶液中的离子起交换作用，而非极性的树脂本身物性不变。通常离子交换树脂根据所带基团可分为强酸（＝R＝SO3H）、弱（＝COOH）、强碱（＝N+＝R：）和弱碱（＝NH2＝NHR＝NR2）。离子交换树脂适用于分离小分子物质，如氨基酸、腺苷、腺苷酸等。然而，对于生物大分子如蛋白质，则不太适宜，因为它们不能扩散到树脂的链状结构中。因此，如果需要分离生物大分子，可以选择多糖聚合物如纤维素、葡聚糖为载体的离子交换剂。
本次实验利用磺酸阳离子交换树脂（Dowex 50）分离混合氨基酸，包括酸性氨基酸（天冬氨酸）、中性氨基酸（丙氨酸）和碱性氨基酸（赖氨酸）。在特定的pH条件下，这些氨基酸解离程度不同，通过调整脱液pH或离子强度可以实现分离。实验中所用到的材料包括层析柱、恒流泵、梯度混合器、试管及试管架、紫外分光光度计、2mol/L HCl、2mol/L NaOH、0.1mol/L HCl、0.1mol/L NaOH、pH4.2的柠檬酸缓冲液、pH5的醋酸缓冲液、0.2％中性茚三酮溶液以及氨基酸混合液。
树脂处理步骤为：首先将树脂置于100ml烧杯中，加入25ml 12mol/L HCl搅拌2小时，倾弃酸液后用蒸馏水洗涤至中性。随后，再加入25ml 12mol/L NaOH搅拌2小时，倾弃碱液后用蒸馏水洗涤至中性。最后，将树脂悬浮于50ml pH4.2柠檬酸缓冲液中备用。
装柱步骤包括：取直径0.8cm～1.2cm、长度10cm～12cm的层析柱，底部垫玻璃棉或海绵圆垫，自顶部注入经处理的树脂悬浮液。关闭层柱出口，待树脂沉降后，放出过量溶液，再加入一些树脂，使树脂沉积至8cm～10cm高度即可。于柱子顶部继续加入pH4.2柠檬酸缓冲液洗涤，确保流出液pH为4.2，关闭柱子出口，保持液面高出树脂表面1cm左右。
加样、洗脱及洗脱液收集步骤为：打开山口使缓冲液流出，待液面几乎平齐树脂表面时关闭出口。用长滴管将15滴氨基酸混合液直接加到树脂顶部，打开出口使其缓慢流入柱内。当液面刚平树脂表面时，加入0.1mol/L HCl 3ml，以10滴/分钟～12滴/分钟的流速洗脱，收集洗脱液，每管20滴，逐管收存。当HCl液面刚平树脂表面时，用1ml pH4.2柠檬酸缓冲液冲洗柱壁一次，接着用2ml pH4.2柠檬酸缓冲液洗脱，保持流速10滴/分钟～12滴/分钟并注意勿使树脂表面干燥。
在收集洗脱液的过程中，逐管用茚三酮检验氨基酸的洗脱情况，方法是：于各管洗脱液中加10滴pH5醋酸缓冲液和10滴中性茚三酮溶液，沸水浴中煮10分钟，如溶液呈紫蓝色，表示已有氨基酸洗脱下来。显色的深度可代表洗脱的氨基酸浓度，可比色测。在用pH4.2柠檬酸缓冲液把第二个氨基酸洗脱出来之后，再收集两管茚三酮反应阴性部分，关闭层析柱出口，将树脂顶部剩余的pH4.2柠檬酸缓冲液移去。于树脂顶部加入2ml 0.1mol/L NaOH，打开出口使其缓慢流入柱内，按上面步骤续用0.1mol/L NaOH洗脱并逐管收集，注意保持流速10滴/分钟～12滴/分钟，每管20滴。做洗脱液中氨基酸检验，在第三个氨基酸用0.1mol/L NaOH洗脱下来以后，再继续收集两管茚三酮反应阴性部分。
最后，以洗脱液管号为横坐标，洗脱液各管光密度（以水作空白，在570nm波长读取吸光度）或颜色深浅（以-，±，+，++．．．表示）为纵坐标作图，即可画出一条洗脱曲线。
实验注意事项包括：保持流速10滴/分钟～12滴/分钟，并注意勿使树脂表面干燥。在装柱时必须防止气泡、分层及柱子液面在树脂表面以下等现象发生。