强阴离子交换柱洗脱

『壹』 阴离子交换柱能去除水中的什么

作用是用阴树脂中的氢氧根交换掉水中的其他阴离子。混合物通过阴离子交换柱，阴离子可以被吸附从而与其他物质分开，一般来说，阴离子交换柱的吸附剂应该呈阳性。

『贰』 强离子交换柱和弱离子交换柱的区别

阴树脂和阳树脂有什么不同？

交换原理：

阴离子交换树脂体内含有大量的碱性基团，是通过氯来与水中的杂质交换，而阳离子交换树脂则含有大量的酸性基团，是通过钠离子或者氢离子与水中的杂质进行交换。

交换顺序：

1、混床树脂的交换顺序一般是先阳离子，然后才是阴离子，阳离子交换树脂会释放出酸性基团，而阴离子交换树脂则会释放出碱性基团，两者中和，成为纯水。

2、离子所带有的电荷多，就容易被树脂吸附，而所带有的电荷较少，则比较难吸附。

3、如果带有相同电荷量的离子，原子序数大的元素，形成离子的水合半径小，较易被吸着。

温度：

阳离子交换树脂的耐温性比较好，所以一般阳离子交换树脂的使用温度或者储存温度都要比阴离子交换树脂高一些。

预处理：

阴阳离子交换树脂的功能基团不同，所以树脂预处理时使用的溶液也不同，阴阳树脂在使用饱和食盐水浸泡18-20小时之后，使用清水清洗干净。

阴树脂使用浓度为5%的氯化氢进行浸泡4-8小时，清洗干净，再使用浓度在2%-4%左右的氢氧化钠浸泡4-8小时，清洗至中性即可。

而阳树脂则使用浓度在2%-4%左右的氢氧化钠浸泡2-4小时，清洗干净后，使用浓度为5%的氯化氢进行浸泡4-8小时，清洗至中性即可。

『叁』 怎样利用离子交换柱层析法分离不同的蛋白质

离子交换柱层析法的核心在于不同的蛋白质的等电点不同
所以说，利用离子交换柱层析法分离不同的蛋白质其实就是利用不同蛋白质不同的等电点来分离。比如目的蛋白等电点是5，那么在环境pH为8.0的情况下，目的蛋白可以结合阴离子交换层析，而杂蛋白可能不能结合或者结合能力比目的蛋白弱。通过不同的盐浓度的洗脱让结合能力不同的蛋白在不同的组分被洗脱出来，最终完成对目的蛋白和杂蛋白的分离。

『肆』 离子交换层析中，为什么用氯离子洗脱阴离子

离子交换层析中，为什么用氯离子洗脱阴离子
阴离子交换柱的填料是正电填专料,在低盐条件下可以属通过电荷相互作用吸附样品中的阴离子和负电荷物质（如DNA）.这些带负电的物质由于其带电量不同,分子大小不同,因而与正电填料之间的结合力也就不同.用梯度的氯离子（一般用氯化钠梯度,例如从100mM氯化钠线性梯度升高到1M氯化钠）洗脱挂柱样品时,氯离子会和结合上的物质竞争结合正电填料,伴随着氯离子浓度的不断升高,氯离子的竞争作用越来越强,与填料结合的物质会按照亲和力从弱到强依次洗脱下来,形成独立的洗脱峰,从而将这些物质分开.
阳离子交换柱与之正好相反,柱子填料为负电荷,用钠离子洗脱结合的正电物质.

『伍』 设计一个利用阴离子交换柱纯化一个等电点为7.5的蛋白质的实验

既然是抄阴离子交换，就要让目标蛋白带负电，那么缓冲液PH就要大于等电点。缓冲体系的选择也很重要，一般用TRIS-HCl，特别是弱阴离子柱不可选用带负电强的磷酸盐缓冲液，否则上样液中被交换的将是磷酸根而不是目标蛋白。一般用NaCl平衡后上样进行离子交换，然后再用较强的阴离子洗脱。

『陆』 阴离子交换色谱中阴离子洗脱强度顺序

阴离子交换树脂洗脱顺序是先从上层然后到下层,对阴离子交换树脂进行洗脱的目的是为了更好的对树脂进行再生。

『柒』 样本前处理（三）

蛋白提取的质量控制

我们通过上一篇笔记里介绍的各种方法把蛋白质提取出来以后，这事儿还没完，因为我们需要对提取出来的蛋白进行一下质控，以确认是否成功提取出了足够的蛋白，是否有污染等。

如上图，质量控制分两个部分：

含量测定 ：检测是否有充足的蛋白被提取出。注意上图里提到的不兼容问题，如果你样品里加过SDS，就不要用Bradford法来测定蛋白浓度，而可以选用BCA方法；反之，如果你样品里加入了还原剂，就不要用BCA方法来测定蛋白，可以选用Bradford法。

SDS-PAGE ：检测蛋白的提取效率，以及是否有污染。比如我们上了50个样，能看到的条带却很少，说明定量不准确。如果想从几组样品中寻找差异蛋白，特别需要做一次SDS-PAGE检测同类样品蛋白的提取效率。

以上图为例，0号样品中间的条带不见了，可能是提取蛋白不充分引起的差异，也可能是样品本身的差异。我们可以重新提取一次，先排除是否是提取造成的差异；如果是样品本身的差异，建议用label free的方法，每个样品单独做定量，而不要用iTRAQ或TMT标记定量，否则会因为中间这个高丰度蛋白的影响，而导致定量不准。

我们再看来几种常见的问题，以及解决方法，如下图：

情况1：提取出来的结果差异很大。这种情况需要重新提取，以检测到底是提取不充分造成的差异，还是样品本身的差异；

情况2：左边是分子量marker,右边是实际样品，可以看到实际样品的条带很少，可能是提取不充分，需要重设提取参数，使用更剧烈的条件，更长的时间，重新提取；

情况3：横纹、纵纹比较多，很可能是核酸或脂蛋白的影响，这种情况需要进行脱盐处理，也就是利用脱盐柱与肽段结合，而与其它物质不结合，从而达到去除污染的目的。

情况4：两个条带很类似，但一条明显比另一条淡。可能造成这种情况的原因有哪些呢？第一种情况，由于这是同样类型的样品，比如都是小鼠肌肉组织，一个样品的蛋白质抽提充分，而另外一个样品蛋白抽提不充分，就会导致两条带不一样，这种情况下需要重新抽提。还有一种可能，考虑到是等量上样跑的SDS-PAGE，如果两个条带显示出的蛋白含量差别很大，则可能因为参考的含量测定结果不准确引起的，这时候需要重新定量。

脱盐

蛋白提取后，还需要做脱盐处理，我们来看看可以用哪些方法实现。

超滤： 可以截留10kDa及以上的蛋白分子，适用于体积较小的样品。操作步骤可以是，从100μL超滤浓缩到40μL，再加缓冲液至100μL，再超滤到40μL，反复几次。事实上，超滤是很难把污染（比如SDS）完全去掉的，最终仍然会有极少量的污染物存在，但当这些污染物的浓度降到一定程度时，则样品的纯净度我们认为是可以接受的了。

Tips :

样品中的尿素浓度需要控制在1M以下才能不对样品造成影响，我们提取蛋白时使用的是8M尿素，直接稀释8倍的话，造成样品体积太大，下一步加入酶后，则酶和蛋白的浓度会特别低，酶解效果受到很大影响。另外，体积太大处理起来也不方便。这时也可以使用超滤的方法，多步稀释，将尿素的浓度降到1M以下。

透析 ：也是可以截留10kDa及以上的蛋白分子，适用于体积比较大的样品，比如尿液，可以将盐透析至外面的透析液里。

丙醇沉淀 ：-20℃丙酮（V样品：V冷丙酮=1：3以上）沉淀2个小时以上。

C18色谱柱脱盐法 ：Waters公司生产的XBridge C18色谱柱，利用柱子上的填料与蛋白结合，而盐类物质则流穿过去，从而达到分离的目的。

还原烷基化及酶解

脱盐完成以后，接下来我们就要进行相当重要的一步：还原烷基化及酶解。整个流程，大伙儿看下面这张图：

这里面有两件事要先跟大伙儿聊聊。

首先，我们来说说为什么步骤里要把丙酮沉淀放在烷基化以后。通过之前的学习，我们知道丙酮可以溶解样品的去污剂、还原剂等，而蛋白是不会在丙酮中溶解的，而是会沉淀下来，这样就达到了去除杂质的目的。

烷基化以后，球状蛋白变成链状，再通过丙酮沉淀去掉尿素或SDS等污染物，然后复溶（即重新溶解，以备下一步酶解操作），那么链状的蛋白比球状蛋白的复溶效果会更好，可以避免因为复溶不充分而造成的损失。因此，丙酮沉淀要放在烷基化之后再做。

另外，关于酶切这一步，有些抗体如果只用胰酶进行酶切，由于酶切位点太少，导致切出来的肽段太长，不便于质谱检测。这种情况下可以结合其它酶，比如Lys-C，进行多酶酶切，使肽段变得短一些。经过测试我们发现，用Lys-C+胰酶酶切，比只用胰酶酶切，可以提高10%-20%的鉴定率。

酶解需要在buffer体系下完成，比如25mM碳酸氢铵体系（易挥发，pH 7-8）最为常用，或者也可以使用TEAB（ triethyl ammonium bicarbonate，三乙基二乙胺盐，10-100mM）。

Tips :

如果做iTRAQ（或TMT）标记，最好用TEAB，而不是碳酸氢铵体系。因为iTRAQ（或TMT）试剂是标记末端氨基，碳酸氢铵上的氨基也会被标记上，影响蛋白的标记效率。

酶的用量可以参考以下的公式：

W（酶）：W（底物）=1:20 – 1:50

此外，需要注意的是胰酶酶解的兼容性问题。胰酶只能耐受最多1M的尿素，且不能与SDS同时使用。

蛋白质及肽段的预分级

前面提过，质谱仪是一种离子饱和性仪器，高丰度蛋白的存在会对低丰度蛋白的信号产生抑制，并且质谱仪反应也需要一定的时间。例如，人的细胞内通常会表达20300种蛋白，它们酶解后，每种蛋白会产生10-20种肽段，那么就有几十万种肽段，质谱很难同时检测到这么多种肽段。所以对肽段混合物进行分级，可以降低检测的难度，得到更多的肽段/蛋白鉴定结果。

我们既可以从蛋白水平进行分离，也可以从肽段水平进行分离，还可以将多种分离手段结合起来。从蛋白水平的分离，大家都比较熟悉吧？通常我们用SDS-PAGE或IEF等技术，利用蛋白质的分子量、形状、等电点等理化性质的不同，将混合在一起的蛋白质分开。

第二种分离方案是在肽段水平上进行，根据肽段的不同性质，使用不同填料进行分离。

SCX（Strong Cation Exchange）：是以硅胶为基质的强阳离子交换柱，可以与阳离子结合，并通过buffer进行离子交换，将阳离子分离和洗脱出来，达到与其它不带阳离子的肽段分离的目的。

SAX（Strong Anion Exchange）：硅胶键合季铵基团的强阴离子交换柱，可以与阴离子结合，并通过buffer进行离子交换，将阴离子分离和洗脱出来，达到与其它不带阴离子的肽段分离的目的。

RPLC（Reverse Phase Liquid Chromatography）：反相液相色谱柱，与正相柱在表面键合极性官能团不同，反相柱的表面键合的是非极性的官能团，例如，键合十八烷基官能团，称为C18柱，其它常用的还有C8，C4和C2等。这里我们选用C18柱，根据肽段疏水性的不同，达到分离的目的。

HILIC（Hydrophilic interaction liquid chromatography ）：亲水色谱柱可以用来分离极性化合物。由于强极性肽段在反相色谱柱中保留情况都比较差，很难将它们分开，而亲水色谱柱却可以用来固定强极性的肽段，并结合高比例有机相与低比例水相组成的流动相，来实现分离的目的，且这样的流动相组成尤其有利于提高电喷雾离子化质谱（ESI-MS）的灵敏度。

High pH - Low pH RPLC：用pH10的液相条件，结合pH2的RPLC酸性条件，进行分离。

Tips :

通常，我们通过RPLC与质谱联用。因为RPLC体系是用水和乙腈，易挥发，不含盐，可以直接送入质谱进行检测。而像SCX/SAX这类正相柱，需要通过高盐的体系将样品洗脱下来，所以它与质谱不兼容。我们在做多级分离时，前面都会有各种盐的洗脱，最后才是RPLC，然后就可以直接连质谱了。

多维分离：例如，先从蛋白水平进行分离，再从肽段水平进行分离，或者多种肽段水平的分级分离结合起来使用。接下来我们重点聊一下各种多维分离的策略和效果。

我们先来看看上面这张图。左上角的“A图“展示的是通过High pH - Low pH RPLC将样品分成了40个馏分，然后进行叉开的合并，合并为20个馏分，这样的合并可以让样品中的肽段分布更加均匀。

右上角的”B图”展示的是通过SDS-PAGE进行分离，也分成20个馏分，然后用两种合并方案，分别合并为5个馏分和6个馏分，这样做的目的也是为了让样品的肽段分布更加均匀。

左下角的“C图”针对同一种样品，对High/Low pH RPLC和SDS-PAGE两种分离策略进行了比较，发现经过两种分离方法后，有5408个蛋白是都可以鉴定到的，另外有1951种蛋白是只在High/Low pH RPLC分离策略中鉴定到的，而用SDS-PAGE分离，则可以鉴定到其它389种蛋白。从这个图上看，两种方法有互补性。

右下角的四幅小图说明，当我们在做分级分离时，分的级别越多，能鉴定到的蛋白也就越多。不过这种增长并不是呈线性关系的，分级的级数达到一定程度时，能鉴定到的蛋白数量的增长就会饱和。所以比较省时省力又能保证效果的做法时，选择一个合适的分级数即可。

我们来看一下目前发表的文献里，利用多级分离所能鉴定到的蛋白数量。

一篇2013年发表在MCP上的文献报道，采用RP-RPLC两级分离，分成常规的24个馏分，上样量为100μg，在一天内能检测到8000多个蛋白。

一篇2013年发表在Nat Comm上的文献报道，先采用RP柱分级，再使用SAX分离，然后通过1米的长柱子反相色谱分离。样品为人的胚胎干细胞，上样量仍然为100μg，在线分离8天检测了9818个蛋白，如果分离时间延长到24天，则可以检测13075个蛋白。

一篇2014年发表在Nat Method上的文献报道，采用IEF（等电聚焦电泳，isoelectric focusing）与RPLC结合，样品是人的上皮癌细胞，上样量为800μg，分成了360个馏分，耗时超过15天，一共分析到13078个蛋白。

就像前面说到的，对蛋白及多肽分离的级数越多，能鉴定到的蛋白也就越多，但常常因为机时的限制，再加上这种变化趋势到一定程度总会饱和，所以我们通常有个权衡。比如常规的分10个馏分，基本上可以鉴定到5000-8000个蛋白。如果是血清样品，可以馏分更多一些，尤其是RPLC一维，如果分到40或60个馏分，再合并为10或20个馏分，比直接分成10个或20个馏分能鉴定到的蛋白要多30%左右！

Tips :

对于分馏分，通常是利用C18的色谱柱来分级分馏分，这个没有试剂盒。

『捌』 有谁知道HiTrap SP column 和HiTrap Mono Q column

HiTrap SP column 是一种来强阴离子源交换柱，而HiTrap Mono Q column则是一种强阳离子交换柱。可以根据分离纯化样品的等电点来决定用哪个柱子。可以根据洗脱溶液的盐浓度或者pH来分离蛋白质。

它们一般有散装的，自己装柱，便宜一些。但是公司一般都有预装柱，分1mL和5mL规格，象GE公司的SP预装柱5 × 1 ml，价格在100美元左右。monoQ稍贵。自己装柱，需要自己组装整个设备。但是预装柱需要有HPLC或者FPLC的仪器。

使用规则和一般的离子交换没什么差别，同时要参照柱子的说明和仪器说明书。

『玖』 离子交换分离操作中，以高浓度盐溶液进行洗脱的原理是

用离子交换树脂进行分离的操作程序包括三个步骤,具体操作过程如下文中所述.
(1)交换柱的制备首先选择合适的离子交换树脂类型,用相应的溶液进行处理,如强酸性阳离子交换树脂需要在稀盐酸中浸泡,以除去杂质并使之溶胀和完全转变成H式.然后用蒸馏水洗至中性,装入充满蒸馏水的交换柱中.注意防止气泡进入树脂层.
(2)交换使待处理水样以合适的流速通过交换柱进行离子交换.交换完毕后用蒸馏水洗去残留的溶液及交换过程中形成的酸、碱或盐类等.
(3)洗脱洗脱是将已交换到树脂上的离子分离出来的过程.选择合适的洗脱液,使之以适宜速度通过交换柱进行洗脱.（更多质量检测、分析测试、化学计量、标准物质相关技术资料请参考中检所对照品查询 www.rmhot.com）
阳离子交换树脂常用盐酸溶液作为洗脱液；阴离子交换树脂常用盐酸溶液、氯化钠或氢氧化钠溶液作洗脱液.对于分配系数相近的离子,可用含有机络合剂或有机溶剂的洗脱液,以提高洗脱过程的选择性.
离子交换技术在富集和分离微量或痕量元素方面应用很广.例如分离水中的锂离子、锰离子、铜离子、铁离子、锌离子等多种金属离子,首先加入盐酸使一部分离子转变为络合阴离子,然后将水样通过强碱性阴离子交换树脂,各种离子均被交换在树脂上,最后用不同浓度的盐酸溶液进行洗脱分离.锂离子不生成络合阴离子,不发生交换,可用12mol／L HCl溶液最先洗脱出来

『拾』 急！急！如何装阴离子交换柱，使用时候出现气泡怎么除去谢谢

可以用适量的有机溶剂润洗一下层析柱，柱子体积较小的话就用玻璃棒搅匀排除一下气泡。

不管是干柱和湿柱，都要加层析液，不能要求一开始就没有气泡的。要用洗脱剂不停的洗脱，就是用配置好的试剂一边一边对柱子进行洗脱，这样不但可以消除气泡，还可以使硅胶充分沉降，让层析效果更好。等柱子没有气泡后在上样用洗脱液进行层析。

若柱中留有气泡或各部分松紧不匀（更不能有断层）时，会影响渗透速度和显色的均匀。去除就是用玻璃棒搅拌，赶走气泡。

(10)强阴离子交换柱洗脱扩展阅读：

水溶液中一些阳离子进入了反离子层，而原来的反离子层中的阳离子进入了水溶液。这种在正常浓度下，反离子层与水溶液之间的各向同性离子交换称为离子交换作用。

离子交换主要发生在扩散层与正常水溶液之间。由于粘土颗粒表面通常带有负电荷，离子交换主要是阳离子交换，所以又称阳离子交换。离子交换严格遵循等价定律，即进入反离子层的阳离子等价于从反离子层排开的阳离子等价。