慢病毒浓缩超滤柱

1. 超滤和RO反渗透式净水机有什么差异

主要差别：过滤精度和净水效果
反渗透机和超滤机的主要差别在于过滤精度上。
超滤机的过滤精度大多为0.01纳米，配合1微米PP棉滤芯、活性炭滤芯，可以滤除粒径0.01纳米以上的铁锈、泥沙、细菌、病毒、有机物和漂白粉，在水质较好、无重金属污染的地区可直接饮用，但一般建议您把水烧开后再饮用。

反渗透净水机的过滤精度可达到0.0001微米，除上述物质外，还可滤除金属离子、水溶盐类，滤出的水近乎纯水，可以直接饮用，适合污染严重的地区以及对水质要求比较高的用户
主要差别：废水率
净水机在制水的时候要排放一定量的废水，冲洗滤膜也要消耗一部分水。一般来说，超滤机废水不多，普通的反渗透机废水多一些，通常是1:3，即制取1份纯水要排掉3份废水。有些品牌号称废水比1:3，实际上有1:4或者1:5，再加上冲洗滤膜的水，废水比甚至达到1:8甚至1:10！

废水多，瘆的慌！不仅费钱，还浪费国家宝贵的水资源！

面对废水率过高的行业困境，欧碧源着力研发新技术，突破行业瓶颈，推出了拥有国家发明专利的微废水技术，废水比3:1，制取3份纯水只排放1份废水，比普通RO机节水近90%。废水率降低后，用水的成本也大大下降，每吨水的成本仅为桶装水的一半，省钱省心。
次要差别
1、出水流量：
超滤机的出水流量较大，每小时出水60-70L左右。
反渗透净水机过滤结构细密，市面上普及率最高的50G机型每小时出水仅7.8L。但是，一般这样的净水机都配置储水桶，对于饮用而言用户的体验感是一样的。当然，如果想获得更好的饮用体验，可以选用400G大通量反渗透净水机，每小时出水60L，还能节省橱柜空间。

2、价格：
反渗透净水器滤芯成本高，制作工艺复杂，因此价格比超滤机高。
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2. PEG聚乙二醇浓缩的原理

蛋白质浓缩

浓缩

生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。常用的浓缩方法的：

减压加温蒸发浓缩
通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。
空气流动蒸发浓缩 空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外的溶剂不沁蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。
冰冻法 生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中，操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢地融解，利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时，不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质和酶的浓缩液。
吸收法 通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等，使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里，外加聚乙二醇复盖置于4度下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。
超滤法 超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，不液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻保留，这是近年来发展起来的新方法，最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活性，回收率高等优点。应用超滤法关键在于膜的选择，不同类型和规格的膜，水的流速，分子量截止值（即大体上能被膜保留分子最小分子量值）等参数均不同，必须根据工作需要来选用。另外，超滤装置形式，溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响。Diaflo 超滤膜的分子量截留值
膜名称
分子量截留值
孔的大的平均直径

XM －300
300，000
140

XM－200
100，000
55

XM－50
50，000
30

PM－30
30，000
22

UM－20
20，000
18

PM－10
10，000
15

UM－2
1，000
12

UM05
500
10

用上面的超滤膜制成空心的纤维管，将很多根这样的管拢成一束，管的两端与低离子强度的缓冲液相连，使缓冲液不断地在管中流动。然后将纤维管浸入待透析的蛋白质溶液中。当缓冲液流过纤维管时，则小分子很易透过膜而扩散，大分子则不能。这就是纤维过滤秀析法，由于透析面积增大，因而使透析时间缩短10倍。

3. 只具有蛋白质的亚病毒如何遗传

十九世纪以来，已经分离得到了多种引起传染病的细菌，不过也有一些传染如口蹄疫，烟花叶病等并不能证实是由细菌引起的，1892年俄国学者伊万诺夫斯基首次发现烟草花叶病的感染因子能通过细菌滤器，病叶叶汁通过滤器后得到的滤液，可感染健康的烟草现而使之发生花叶病。1898年荷兰生物学家贝哲林克(M.W.Beijerinck)独立进行了烟草花叶病病原体的研究，证实这种因子可用乙醇沉淀下来不失去其感染力，而且能在琼脂凝胶中扩散，但用培养细菌的方法培养不出来，他把这种因子命名为“病毒”，此后，许多学者陆续发现了各种植物动物、细菌、病毒。如：口蹄疫病毒、狂犬病毒、鸡肉瘤病毒，黄瓜花叶病毒，以及马铃薯X病毒体实质属于亚病毒，还发现了痢疾志贺氏菌的噬菌体。1935年美国生物化学家Stanley从病叶中分离提出了病毒结晶，该病毒结晶具有致病力。这件事成为分子生物学发展中的一个里程碑 ，Stanley因此荣获诺贝尔奖，接着进一步揭示了病毒的本质并不是糖蛋白，而是核蛋白。
十九世纪30年代初发明了电镜，德国的kausche 等（1940）首先用电镜观察到TMV的杆状外形，电镜技术在病毒学中的应用，使病毒研究进入了分子水平：
Kersheg 和Chase于1952年证明噬菌体遗传物质是DNA。
Franenkel— conrat 于1955年完成 病毒 折开重建实验。
Anderer于1960年弄清TMV衣壳蛋白亚基的AA排序。
1965年美国科学家Spiegeman首次在细胞外复制E.coli的RNAa噬菌体成功。 Baltimcre Temin(1970)发现反转录酶。
以后相继发现了亚病毒—类病毒、朊病毒、拟病毒、并相继测出各种病毒 ，亚病毒的核酸一级的研究。
至今，病毒作为遗传工程中外源基因载体的研究正在扩大和深入。由此将为人类带来无法预料的经济效益；此外病毒学对人类保健、畜牧兽医、植物保护和发酵工业的关系亦日见重要。
通过以上对病毒学简史的了解，似乎比较清楚了什么是病毒但随着有关病毒学知识的日益增多，新的病毒种类不断发现，现已把非细胞生物分成病毒和亚病毒。

从上可知，由于亚病毒尤其是朊病毒的发现，使病毒的定义更加难下。我们对病毒所下的定义是：病毒是一类超显微非细胞生物，每一种病毒只含一种核酸，它们只能在活细胞内营专性寄生。靠其宿主代谢补充，协助来复制核酸合成蛋白质等组分，然后再进行装配增殖，在离体条件下，能以无生命的化学大分子状态长期存在并保持其侵染活性。

第一节 病毒

以上已讨论过病毒定义，随着病毒学知识的日益增多，不同学者从不同角度对病毒的基本特性进行了概括，现将病毒区别于其他生物的主要特征归纳如下：
①形体极其微小，必须在电镜下才能观察，一般都具滤过性
②没有细胞构造，故也称分子生物
③其主要成分是核酸和蛋白质两种
④每一种病毒只含一种核酸，不是DNA就是RNA
⑤既无产能系统也无蛋白质合成系统
⑥利用宿主细胞设备进行增殖，不存在个体生长和二均分裂等细胞裂殖方式
⑦在宿主活细胞内营专性寄生
⑧在离体条件下，能以无生命的化学大分子状态存在，并可形成结晶
⑨对一般抗生素不敏感，但对干扰素敏感
病毒数量是一个急剧上升的变数，其宿主对人类有害或是有益可成灾或造福。
一、病毒 形态构造和化学组成
（一）病毒的大小
1.研究方法
病毒大小可采用不同的方法进行研究：
（1）电镜观察法，可直接测量病毒大小
（2）分级过虑法：根据病毒能通过哪种孔径的超滤膜以评估其大小
（3）超速离心沉降法：根据病毒粒子的沉降速度可用来推算病毒粒子的大小和分子量
（4）电泳法：根据电泳速度测病毒粒子的大小，一般来说颗粒越小（相对带静电荷多）电泳速度越快。
2.病毒大小
研究表明，病毒比细菌小得多 ，但比多数蛋白质分子大，而且病毒大小相差很远。直径在10－300nm之间，通常在100nm左右。
（二）病毒的形态
1.典型病毒粒子的构造
病毒粒子（或称病毒颗粒）是指成熟的结构完整的单个病毒，病毒粒子的主要成分是核酸和蛋白质，核酸位于病毒粒子的中心，构成了它的核心或基因组，蛋白质包围在核结构和抗原成分，对核酸有保护作用，在电镜下可看到，衣壳的形态学亚单位是衣壳粒，有些病毒，核衣壳外还有由类脂或脂蛋白组成的包膜，有时，包膜上还长有刺突等附属物。
2.病毒粒子的对称体制
研究表明：由于衣壳粒排列组合的方式不同，使病毒粒子往往表现出来不同的构型和形状，螺旋对称能使核酸与Pr亚基间的接触更为紧密，廿面体对称有利于核酸以高度卷曲的形式包裹在小体积的衣壳中，另外一些结构复杂的病毒，其衣壳的特点无非是螺旋对称和廿面体对称相结合而已，故称复合对称。
3.病毒的群体形态
病毒粒子无法用光学显微镜观察，但当它们大量聚集在一起并使宿主细胞发生病变时，就可用光学显微镜观察。如动物、植物细胞中的病毒包涵体，有的还可用肉眼看到，例如噬菌体的噬菌细胞。
（1）包涵体：在某些感染病毒的宿主细胞内，出现光学显微镜可见的大小，形态和数量不等的个体，称包涵体，有的在细胞质内，有的在细胞核内，有的在细胞质、细胞核中都存在的类型，根据包涵体的特点，可把它们分成以下四种类型 ①是病毒的聚集体②是病毒的合成部位③是病毒蛋白和与病毒感染有关的蛋白质④非病毒性包涵体。由化学因子或细菌感染形成。
在实践上，病毒包涵体主要有两类应用①病毒诊断②用于生物防治。
（2）噬菌斑
将少量噬菌体与大量宿主细胞混合后，将此混合液与45℃左右的琼脂培养基在培养皿中充分混匀，铺平后培养，经数小时至10余小时后，在平板表面布满宿主细胞的菌苔土，可以用肉眼看到一个个透亮不长菌的小圆斑，这就是噬斑，每一个噬菌斑一般由一个噬菌体粒子形成的，噬菌斑的形成可用于检出、分离、纯化噬菌体和进行噬菌体的计数。
（3）空斑和病斑：在动物细胞培养物上的与噬菌斑类似的空斑，称为病斑，因为受肿瘤病毒感染。
（4）枯斑：植物叶片上的植物病毒群体。
（三）三类典型形态的病毒
1.螺旋对称的代表－烟草花叶（TMV）
TMV是发现最早、研究最深和了解最清楚的一种病毒衣壳粒和核酸呈螺旋对称形排列，其外形呈直杆状。
长300nm宽15nm中空（内径4nm）含Pr95％和SSRNA5％，共有2130个蛋白亚基（衣壳粒）每个亚基由158个AA组成，分子量为17500亚基以逆时针方向螺旋排列共130圈（每圈长2.3 nm有16.33个亚基）SSRNA由6390个核苷酸单位组成，分子量为2*106，盘绕于蛋白质外壳内（因此螺距与Pr螺距相等），每3个核苷酸与一个蛋白亚基结合，因此每圈为49个核苷酸。
以上结构意义稳定，有人试验用灭毒的“工程TMV”作为茄科植物的疫苗，已取得初步结果。
2.廿面体对称的代表－腺病毒（Adenovirus）
这是一种动物病毒，看起来象球形，经分辨率高的电镜观察实际是廿面体，于1953年首次从手术切除小儿扁桃体中分离到。目前已分离到近百种腺病毒。其宿主包括人和各种动物。
核衣壳是由不同数量衣壳粒沿着三根互相垂直的轴形成对称体，直径为70－80nm的廿面体，具有20个面，30条边12个顶角，每个面为等边三角形，衣壳由252个衣壳粒组成，包括12个五邻体和240个6邻体，每个五邻体上实际突出一根末端带有顶球蛋白纤维，称为刺突，病毒核心是dsDNA,所有腺病毒，其基因组的大小都约为36500个核苷酸对。
腺病毒只能培养在人的组织细胞上，不能在鸡胚上生长，腺病毒在宿主的细胞核中进行增殖和装配，并能形成包涵体。
3.复合对称的代表－T偶数噬菌体
大肠杆菌的T偶数噬菌体共有三种，在自然界分布极广，它们是分子生物学研究中的极好材料，因此对它们了解极其深刻，尤其是T4早已有十分清晰的电镜照片和最完整的基因组图。

T4由头部、颈部和尾部三部分构成，由于头部呈廿面体对称尾部呈螺旋对称，故是一种复合对称结构。
尾管中空是头部核酸注入宿主细胞的通道。
6根尾丝：折成2段Pr构成：具吸附专一性
尾部 6个刺突：吸附功能
T偶数噬菌体虽呈蝌蚪状，但吸附却是通过尾丝，尾丝吸附后，会使基板受到构型的刺激，接着尾鞘蛋白发生收缩，使尾管插入宿主细胞。
（四）病毒的化学组成
1.病毒的核酸 2.病毒蛋白质 3.其他化学
二、各类病毒及其繁殖方式
病毒的种类很多，它们繁殖方式即有共性又有各自的特点，这是以噬菌体为重点介绍它们独特的繁殖方式。
（一）原核生物病毒－噬菌体
1.一般介绍
噬菌体广泛存在于自然界中，至今在绝大多数原核生物中都发现了相应的噬菌体，至今已作过电镜观察的噬菌体至少已有2850种。据Bradley(1967)归纳，噬菌体共有6类形态。
在病毒学研究中E.coli是发现噬体最多，研究最深入的一种宿主，现将它的若干种噬菌体特征列于表。
2.噬菌体的繁殖
（1）吸附 （2）侵入 （3）增殖
增殖过程包括核酸的复制和蛋白质的生物合成。增殖是通过噬菌体基因表达实现的。
烈性噬菌体的增殖方式按其核酸类型的不同主要分成三类①按早期、次早期和晚期基因的顺序来进行转录，转译和复制的双链DNA噬菌体的增殖方式②按“滚环”模型复制单链DNA的增殖方式③按“花朵”模式复制A蛋白衣壳蛋白和复制酶蛋白的增殖方式。以下仅以双链DNA噬菌体的增殖方式为典型代表来加以介绍。

（1）增殖（基因表达）特点：双链DNA噬菌体增殖过程中基因表达的特点
①基因表达有先有后，因此将噬菌体基因分为早期基因，次早期基因、晚期基因
②基因表达顺序为早期表达、次早期表达、核酸复制、晚期表达。
③前一次表达的产物是后次基因表达的mRNA聚合霉（其中次早期基因表达的产物还分解宿主DNA霉负责本身DNA复制的DNA聚合霉）
④晚期基因表达的结果是合成了各种整配蛋白（另外还有溶菌霉）
以上介绍的是T偶数噬菌体dsDNA的基因表达过程。噬菌体基因型不同，其基因表达（转录、转译）都各有特点归纳如下。
3.病毒核酸的复制
（1）双链DNA的复制：核酸以半保留方式进行复制（腺病毒）亲代DNA也可做模板转录mRNA，复制、转录、转译均按“中心”法则进行±DNA→±DNA
（2）单链DNA的复制：所有单链DNA＋DNA先合成互补的－DNA组成±DNA然后以新合成的－DNA为模板合成＋mRNA。最后只包含＋DNA

（3）双链RNA病毒的复制：首先通过半保留方式复制利用其中的“－”链产生“＋”RNA，再复制－RNA配成±RNA

（4）＋RNA病毒先复制－RNA组成±RNA，最后只包含＋RNA

（5）－RNA病毒的复制（非侵染性）无侵染性，也不起信使作用所以叫－RNA。

（6）逆转录病毒单链RNA的复制：由于DNA合成霉的作用，合成－DNA通过－DNA合成±RNA最后以（－）DNA为模板制成＋RNA。

4.病毒核酸的转录（以遗传物质为模板合成mRNA）
虽然宿主细胞能为病毒提供大部分合成条件，但毕竟不是全部，而且某些新的酶是用病毒提供的遗传信息合成，也即利用病毒感染后所合成的mRNA实现的，因此病毒生物合成的第一步是病毒mRNA的合成。
病毒新mRNA如何正确合成，取决于病毒类型，尤其是它的核酸类型，DNA还是RNA，双链还是单链。
（1）含±DNA的病毒，可直接以（－）链为模板转录为mRNA，±DNA→mRNA如天花病毒，脱病毒，T4噬菌体。
（2）＋DNA病毒。先复制－DNA，再转录为mRNA如ΨX174。

(3)含±RNA病毒，可直接以－RNA为模板，转录 mRNA

（4）含＋RNA病毒 先合成互补的－RNA组成±RNA，以－RNA为模板转录 mRNA，如脊髓灰质炎病毒。

（5）合成－RNA病毒，可在RNA聚合E的作用下，直接转录为 mRNA

（4）成熟（装配）
噬菌体的成熟过程实际上是E合成的各部件的装配过程，病毒核酸的复制与病毒蛋白质的分开进行的。由分别合成好的核酸与蛋白质组合成完整的新的病毒粒子的过程称成熟。
具体过程：头部、尾部、先分装
（1）裂解（释放）
（2）成熟的病毒粒子从被感染细胞内转移到外界的过程称为病毒的释放（裂解量）
3.噬菌体效价的测定：指噬菌体是液的浓度。
效价指烈性噬菌体（侵染性）数/ml样品
一般都用噬菌体法测定指数。
由于试样中一般噬菌体粒子含量较高，故应先对试样进行梯级稀释，然后取选用合适的方法测定其效价。
（1）斑点试验法

这是一种预试验方法，只能大概地估计待测样品效价高低，不能得出准确数据。
（2）液体稀释管法
4.噬菌体增殖规律的描述方法
一步生长曲线
从裂性噬菌体感染宿主细胞，到新复制的噬菌体粒子经宿主细胞裂解释放出来的整个过程，称为烈性噬菌体的生长周期，可用一步生长曲线来表示。
将高浓度的敏感菌培养物与适量相应的噬菌体悬液相混一定时间以离心术或抗病毒血清除去游离的噬菌体后，高度稀释（以免发生二次吸附感染）致使每个菌体都含一个噬菌体，在适宜的条件下培养，定时取样，用噬菌斑法测定培养物中噬菌体数目，以培养时间为横坐标，以噬菌斑数为纵坐标绘成的曲线称为一步生长曲线。
5.溶源性
（1）温和噬菌体
不裂解宿主细胞的噬菌体称为温和噬菌体，如大肠杆菌噬菌体只将其DNA整合到宿主细胞染色体组上，并可长期随宿主DNA的复制而进行同步复制。
温和噬菌体特点①都是dsDNA②溶源菌 含有前噬菌体（温和噬菌体）的细菌也具有溶源性称为溶源菌。①细菌的溶源性具有遗传性，产生的子代细胞也具有溶源性，也是溶源菌。②溶源菌对同源噬菌体具有免疫性，在培养基上形成噬菌斑才可觉查③溶源性细菌在培养中一般不易被查觉，只有用非溶源性敏感菌株混合培养在培养基上形成噬菌斑才可被觉查到。④溶源性细菌有时能失去前噬菌体，而变成非溶源细胞使溶源性复愈⑤自发裂解和诱导裂解：有少数噬菌体可自发诱发裂解宿主细胞⑥溶源性细菌可获得一些新的生理特性，如日喉杆菌只有在含有－噬菌体时才能产生白喉毒素，引起宿主发病。
噬菌体介绍了以上五方面问题，其中重点介绍了噬菌体的增殖过程，同时对动物、植物病毒的增殖过程与噬菌体增殖的不同点作了介绍。所以以后我们就不再动植物病毒的增殖做特别介绍。
（二）植物病毒
1.概述从病毒学的发展史来看，一些开创性的工作和基础理论研究成果，首先是在植物病毒领域里取得的，最先发现提纯、结晶和电镜观察的都是植物病毒，已知的植物病毒多达600种（1983）其中多数是单链RNA病毒，具体如表。
植物染毒后，症状主要有三：①因叶绿体不能行使正常功能而引起花叶、黄化或红化等症状②植株发生矮化，从枝或畸形等③形成植斑或坏死等症状。
2.增殖过程
“侵入”方式（1）借昆虫刺吸式口器进入（2）通过伤口进入通过胞间连丝或输导组织迅速向其他部位扩散引起普遍感染（3）不释放
（三）脊椎动物病毒
1.根据病毒在人体与哺乳动物中普遍存在，其他各类动物、禽类、爬行类和鱼类等多种脊椎动物中也广泛存在着相应的病毒家畜中的口蹄疫、猪瘟、牛瘟、马传染性贫血、兔的乳头状瘤等都是病毒引起的，家禽中的瘟疫病，两栖类、鱼类的肿瘤、鱼痘等 病毒引起的。人类传染病80％由病毒引起如：流行感冒、肝炎、麻诊、水痘、腮腺炎、流行性乙型脑炎、脊髓灰质炎、狂犬病受病毒感染而诱发的，这些病毒病至今还缺少有效的对付手段，大量增殖，导致宿主细胞裂解死亡。
另一些病毒感染动物后，并不致死宿主细胞，而是引起肿瘤。
2.病毒与癌
病毒与肿瘤是人们关心问题之一，早在1908年Ellerman和Bang就观察到鸡的白血病可无菌细胞滤液传播，1911年美国医生Rous在研究鸡的可转移肿瘤中，证明鸡肉瘤，现在已知病毒能引起许多动物形成肿瘤，人的肿瘤特别是恶性肿瘤已证明不是由病毒引起。但病毒可诱导人产生恶性肿瘤。

动物病毒增殖过程与噬菌体的增殖大致相同。
（四）昆虫病毒（无脊椎动物病毒）
1.概况
无脊椎动物病毒主要在节肢动物的昆虫纲中发现，国内外也昆虫病毒的研究做了大量工作，目前从昆虫体内分离到的病毒有1671 种（1990）其中80％来自鳞翅目昆虫。
2.寄生
昆虫病毒主要寄生在昆虫的真皮、脂肪组织、血细胞、肠道细胞中，有的在宿主的细胞核中，有的在宿主的细胞质里，大量增殖导致宿主组织破坏、死亡。
二、分类
根据是否形成多角体和多角体的形态及形成部位，可把昆虫病毒分为以下几类（包涵体在显微镜下呈角状）。
1.核型多角体病毒 2.质型多角体病毒 3.颗粒体病毒 4.昆虫痘病

详细不？

4. 净水器超滤好还是反渗透好

超滤净水机通过超滤膜高精度物理净化工艺，能够去除水中几乎所有的泥沙、铁锈、细菌、可见悬浮物、藻类以及大分子有机物，大多数超滤机都采用前置PP滤芯、超滤滤芯、后置活性炭等三层结构，其中PP滤芯大约3-6个月需要更换，超滤滤芯根据使用情况，寿命也大约能维持12-18个月的使用。
RO反渗透净水器又被一些厂商称之为纯水机，相较超滤净水机，它在超滤滤芯之后，还会多加一层RO反渗透膜，这是一种孔径只有0.1nm的反渗透膜，透过对水分子施加压力，水分子能够顺利通过膜内，而剩余的废水则会透过膜外进行排出。最初，反渗透纯水的技术是为了宇宙空间中，宇航员能够重复使用饮用水，而如今它已经成为了最主流的净水技术。
正是因为过滤的方式有所差异，要区别RO反渗透净水机和普通超滤净水机的方法非常简单：RO反渗透净水机需要对水进行施压，因此在使用中会需要电能，并且过滤后还将有一定的废水排除，而超滤净水器本身由于采用自来水自身的水压进行过滤，因此不需要通电，也不会产生废水。
相对而言，RO反渗透净水机在净水效果方面有绝对的优势，借助纯净水导电性较差的特点，我们也能对纯水机的性能进行一定程度的监控。或许许多人不知道，虽然水会导电，但这并不是水本身的缘故，而是水中包含的杂质造成的，因此通过检测水的导电性，我们能轻松掌握水中杂质的多少——而这就是TDS检测的原理，一支十几元的TDS检测笔就能反映出纯水的干净程度，通常RO反渗透过滤机能够将TDS指标降低至30以下，而超滤后的水质指标几乎与自来水无异。
因此，要根据自己的需求来选择，这才是最合适的。

5. 超滤膜净水器好还是反渗透净水器好

区别一：RO反渗透净水效果更好

实际上，超滤和反渗透净水器的结构是相似的。它们在上半部都上配备了PP棉、活性炭和其他粗滤元件，最后的差别是在超滤膜、反渗透的过滤能力。超滤式净水器的过滤精度约为0.01-0.1微米，反渗透膜的过滤精度可达0.0001微米，这就好比孔径大小的筛子做对比，明显孔距更小的筛子过滤精度更高。

在过滤效果方面，超滤净水器可去除水中的铁锈、沉淀物、细菌、病毒、残余氯、异色气味，而反渗透净水器可进一步滤除重金属物质（如：汞、铅、铜、锌、无机砷），但人体所需的钙和镁离子也随废水一起排出。所以 RO反渗透净水器的输出几乎是纯净水。但是现在RO膜后端可增加弱碱滤芯，可向水中添加有益人体健康的微量元素，从而解决了这个问题。

区别二：RO反渗透净水器需要用电

反渗透净水器通过增加渗透压来实现纯水逆着自然渗透方向的反向运动。它需要高水压才能“推动”，因为中国自来水水压较小，所以RO反渗透净水器要用增压泵正常工作，因此许多反渗透净水器需要连接到主电源使用。但是不用担心，增压泵只在净水器工作时工作，功率也较低。

超滤净水器是物理类型的过滤。超滤净水器可以在水压达到标准的区域内通常无压力地过滤净化水。此外，一些超滤净水器采用单滤芯过滤滤器，其在空间占用和安装条件方面较低。

区别三：超滤净水器的出水流量较大

如果没有加压，RO反渗透净水器甚至不会为您生产纯净水，其精细的过滤结构将大大降低水流量。RO膜过水量越大，产水值也越高。例如，一般500G 的RO机出水量是1.3升/每分钟。而超滤不需要担心流动问题。它们的水输出一般为1.5升/每分钟。如果用水量大，水流量应该是乐观的。

区别四：RO反渗透净水器有废水率

因为RO膜的外表一些残留物质（如碳酸钙、硫酸钙、硅）就会在反渗透膜表面沉积下来，为了防止RO膜堵塞，就需要用水不断冲洗RO膜。因此你想获得纯净的健康水，你必须牺牲一定比例的废水。通常，超滤净水器的废水很少，但要记得定期更换净水器滤芯。

相反，反渗透净水器为了确保反渗透膜的寿命，增加废水比可以防止反渗透膜的结垢。通常，反渗透净水器的废水率从最早的5：1增长到2：1或甚至1：1，随着科学技术的不断发展，废水率将越来越低。同时，被称为“废水”的水也很干净，它的纯度高于原水，但低于纯水，可以用来洗衣服、拖地或冲厕所。

区别五：两种净水器的不同适用范围

如果您的家在恶劣的环境、水污染严重，请务必选择RO反渗透净水器（净水器）。净化效果非常好，非常彻底，其过滤精度非常高，只允许水分子通过，可以有效去除水中的铁锈、沉积物、大分子有机物、重金属、细菌、病毒等，出水是纯净水。然而，由于RO净水器需要使用电力并使用更多的水，因此成本会更高一些。

如果水质不是太差，食品级超滤净水器就行了。超滤净水器可去除水中的铁锈、沉积物、大分子有机物、细菌、病毒等，纯物理过滤、无电，只需要自来水压足够即可。

无论是RO反渗透净水器还是超滤净水器，它们都有优点和缺点。现在水资源受到污染的时代，安全才是我们首选需要考虑的问题。当然，如果您想购买适合自己的净水器，最重要的是根据您所在地的水质获得正确的净水效果。

6. 打狂犬疫苗会不会传染艾滋病

1983年美国巴斯德研究首次分离到引起艾滋病的病原体HIV，随后便有人预言对付这种病的疫苗将在两年之内问世，然而到1987年8月，美国NIAIDS才在巴斯德美国国立卫生院进行了首次HIV候选疫苗的人体试验。过去的二十几年，各类抗HIV药物相继进入Ⅲ期临床试验，并且不断有新药上市，而艾滋病疫苗的临床试验却是举步维艰，进入临床试验的候选疫苗研究进展十分缓慢[13]是多方面的。
4.1 艾滋病疫苗研制的一个很大的障碍是艾滋病疫苗相关的免疫机制尚未明了。
对于多数疫苗可预防的疾病，自然发生或疫苗诱生的免疫应答都与抗感染或疾病的保护作用相关。然而，即使多数HIV感染者能产生广泛的抗病毒免疫应答，这些应答也不能消除感染。就目前所知，HIV特异性免疫应答与低病毒载量有关。低病毒载量不仅能削弱免疫应答，具有逃避免疫应答的特性，还能整合入宿主细胞基因组并在机体的中央神经系统或骨髓神经系统中长期存在，使得机体无法彻底清楚病毒。此外，由于没有一个人能够自然清楚HIV病毒或从AIDS痊愈，这使保护人体免受HIV攻击的有关免疫参数的鉴定和研究变得更加困难[14][15]。
4.2 HIV基因的高度变异性。
HIV病毒基因具有极高的遗传变异性，并且进化速度相当惊人。首先，HIV-1和HIV-2在基因序列上至少存在25%的差异，两种HIV又可以根据基因序列的差异分别分为9个和6个亚型，世界各地的主要流行株不同，虽然目前仍缺乏科学证据证实HIV基因遗传变异性与HIV特异性免疫应答是否有关以及对每个亚型是否需要设计特定的疫苗，但是在设计疫苗时这也是不可忽视的因素。其次，HIV在宿主机体的免疫压力环境以及药物选择压力下具有高度变异性。HIV的基因片段中碱基替换的积累、插入、缺失以及核壳蛋白糖基化位点的增加和减少都会导致HIV基因的变异。不同亚型的病毒间也会发生基因重组，产生独特的循环重组型（CRV），更容易逃避已有的免疫保护。最后，HIV的自身某些机制能逃避宿主免疫系统的攻击。此外，HIV外膜糖蛋白gp120上的高度变异性V3环和聚糖残基掩盖了协同受体结合位点，使得gp120中和抗体和难以结合位点为靶点；同时，具有高度变异性的V3环可发生突变作用，使V3环的构象明显改变，从而使病毒逃避中和作用，至使单一的gp120疫苗无法保护人体，避免HIV感染[15]。HIV以上的这些特性给疫苗的设计带来了巨大的挑战。
4.3 缺乏良好的动物模型。
一个好的动物模型对于病毒的研究和疫苗的研制至关重要，现在还没有确定的HIV感染的动物模型用于预测HIV疫苗对人体的安全有效性。非洲猴是各种猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus,SIV）的天然宿主，但是非洲猴感染这些病毒后不能发展为临床疾病。相比之下，印度猴，尤其是印度恒河猴对SIV高度敏感，感染后逐渐发展为人类艾滋病类似的免疫缺陷综合症。目前疫苗诱导的保护性反应评价都以SIV或SIV与HIV的嵌和病毒（SHIV）感染的印度恒河猴为模型的实验来评价疫苗效能需要在猴子体内接种大剂量的病毒，相当于5X107SIV RNAcopies/ml，与之相比人体自然感染HIV病毒的浓度要低的多，一般低于103-105HIV RNAcopies/ml。种种迹象表明，设计出的疫苗在动物中的试验效果与临床试验的效果仍有很大差别，尚不清楚是否能通过动物试验结果预测疫苗在人类中的保护作用，人体保护作用和资料只能来自人临床试验。此外，由于一些宗教和政治方面的原因，印度在1978年中止了恒河猴的出口，这也不利于全球对HIV的研究以及对疫苗的开发。
4.4 不能激发免疫记忆。
现在的大多数候选疫苗不能激发机体产生持久的免疫记忆。只要HIV在人体内存在，就能够缓慢地复制、积累，而没有免疫记忆的话，针对HIV的特意性CTL和中和抗体会慢慢消失，导致病毒在体内再度爆发。
4.5 HIV感染机体的特点。
HIV感染机体本身的一些特点也使疫苗的研制难度增大：1 HIV侵入人体的主要部位是黏膜，黏膜局部必须有足够的免疫应答；2 HIV能进入中枢神经，而相应抗体受血脑屏障的阻隔，所以免疫应答不容易建立；3 HIV不同于其他前病毒，它可以前病毒的形式整合进入宿主染色体DNA中，但受整合的细胞表面不表达或仅表达少量的HIV抗原成分，因此采用刺激机体产生抗体的疫苗对此无能为力；4 HIV能通过多核巨细胞的形成而在细胞之间直接扩散，不需接触血液，所以抗体虽能中和游离病毒，但不能阻止HIV通过细胞-细胞间蔓延[16,17]。
4.6 其他原因。
首先，疫苗必须经过人体临床试验，而找到足够数量的符合条件的志愿者很难，并且由于受人权、道德方面的限制，使艾滋病疫苗的人体试验的进行更加困难；其次，疫苗的开发需要足够的资金由于开发艾滋病疫苗的艰巨性与不确定性，使很多公司不愿意承担风险来投资疫苗的研发。

7. 本人想搞尿激酶的生产，请求帮助,谢谢！

尿激酶是从男性尿中提取的一种生化药物，广泛应用于治疗新鲜血栓性闭塞性疾病、肺栓塞、急性脑血栓形成，脑血管栓塞以及视网膜中央静脉血栓形成。我国由于人口众多，资源丰富，劳动力价格低廉，因而尿激酶粗品的生产遍及全国各地。在生产的尿激酶粗品中，仅有一部分经过精制成精品出口，不少粗品直接出口，让外商赚取了大量的利润。研究纯化尿激酶的技术与方法以及提高纯化过程中各道工序尿激酶的收率，提高尿激酶产品的高附加值，利用再生资源，出口创汇，利国利民，具有显著的经济与社会效益和重要意义。
一、主要材料
尿激酶粗品(硅胶法生产)，甘氨酸(C·P)、硫酸(A·R)、氢氧化钠(A·R)、盐酸
(A·R)、磷酸二氢钠(C·P)、磷酸氢二钠，叠氮化钠(A·R)，714树脂，CM一S。

二、试验过程与技术条件
(一)解析
1.取尿激酶粗品200克(经测定，比活为325iu/mgP)，悬浮于8倍量的。.SM甘氨酸缓冲液中，尿激酶浓度在45ooiu/ml，维持低温，搅拌75分钟，静置45分钟，上清液经虹吸与底部沉淀分开。
2.虹吸上清液后的沉淀加入1倍量的甘氨酸缓冲液，处理同上，取上清液.
3.合并两次上清液，在低温下缓慢加入SNH:50.调PHlo.。士。.1(取样测定价).
(二)714树脂脱色
1.按解析液效价每亿单位用1.4kg树脂上柱，树脂用蒸馏水洗几个床体积后备用。
2.将PH10·。的解析液上柱，流速控制在1.8~2.oml/cmZ分，收集流出液，上柱完毕后，，柱用一个床体积的低温蒸馏水洗涤.
3.合并柱流出液用sNHZSO‘调PH为10.0士0.1.
(三)超滤处理
1.将PH为10.。的脱色液用超滤器超滤脱盐，超滤浓缩至原体积的六分之一左右。
2.浓缩液中加入低温蒸馏水，稀释至电导4.smV(10℃)。
3.再次浓缩至六分之一体积。
4.二次浓缩液中加人低温。.18M、PH6.8磷酸缓冲液及蒸馏水稀释至原体积，二者加入的比例应使稀释液电导为4.8士0.lmV(10℃时)。
5.再用SNHZSO.调PH为6.8士0.1。
6.再次校正电导为4.8士。.lmV(10℃)。
(四)CM一S交换凝胶纯化(在低温下进行)
1.CM一S预处理:CM一S用燕馏水浸泡后，分别用Na0H和HCL处理，然后用0.18M、
PH6.8磷酸缓冲液平衡，过滤;平衡过的CM一S悬浮于含0.08%NaN:，0.18M、PH6.8磷酸缓冲液中，低温冷藏。
2.CM一S吸附
(1)经超滤PH6.8电导4.smV的尿激酸溶液，按skg/亿单位加入经平衡的CM一S，搅
拌两小时，防止起泡，静置一小时，虹吸去除上清液。
(2)吸附尿激酶的CM一S上有机玻璃柱，防止柱内起泡，柱面平整.
3.洗涤去除杂蛋白
(1)CM一S上柱后用含0.3%NaN3，PH6.8、0.18M磷酸缓冲液洗涤，流速为1.8~
2.。而/cmZ分左右，流至流出液效价低于10oiu/耐，28onm光吸收峰低于。.04E/已。
(2)改用1.SMPH6.8磷酸缓冲液洗涤一个半床体积，流速不变，流出液280nm吸收峰应降至0.03以下。
4.尿激酸洗脱
(1)洗涤完毕后用0.08MP、H8.8磷酸氢二钠、0.95M氛化钠缓冲液洗脱，流速。.4ml/cmZ分，测定流出液效价及280nm吸收峰，将有活力流出液合并，使混合液浓度在S000in/ml以上。
(2)混合液调PH6.。~7.0.抽取试样化验后，装于二升的塑料瓶内，干冰速冻，一22℃以下低温保存。
(五)尿激酸〔UK)效价和比活的测定
1.测试原理
(1)主要试剂与器材
恒温水浴锅、刻度闹钟、荧光灯、UK效价坐标纸、牛凝血酶(T)、牛纤维蛋白溶酶原(PG)、牛纤维蛋白(FG)、UK标准品、Barbiton一Na，Tri。，NaZEDTA，Nael
(2)试剂配制
T:牛凝血酶40BP(卫生部药品生物制品检验所)，每支加6.6mlBarbiton一Na缓冲液。
PG:牛纤维蛋白溶酶原22BP(卫生部药品生物制品检验所)，每支加24mlTris缓冲液。
PG一T:取PG6.6nil与配好的6.耐T等体积混匀，放入50血三角烧瓶中，扎口备用。
FG:片纤维蛋白原，12sBP(卫生部药品生物制品检验所)，每支加18mlBarbiton一Na
缓冲液。
(3)标准UK稀释
将标准品(loooiu/支)用巴比妥溶液稀释成60in/ml。
(4)绘制标准曲线
①取5时试管4支，作记号并分别加入FGO.3耐;
②分别加入稀释标准UK溶液0.4、0.3、0.2、0.lm卜
③分别加巴比妥溶液0.6、0.7、0.3、0.9回;
④分别加入0.4mlPG一T，摇匀，立即放入37℃恒温水溶锅，记时;
⑤观察气泡上升情况，体积一半时记终止时间;
⑥以单位效价为横坐标，时间为纵坐标，绘制标准曲线，要求至少有三点在一条直线上。
(5)样品检测
①继标准曲线后，在同一条件下，同一试剂情况下，进行样品检测;
②分别加FGO.3ml，巴比妥缓冲液0.gml，PG一TO.4mh
③其余步骤同前。
(6)测O.D值
将加酸后的样品稀释10倍，然后测其O·D值。
(7)计算效价与比活
①根据测试样品的气泡上升时间，在标准曲线上找出相应的点的效价，乘以20得出样品
实际效价。
②总效价~单位效价(iu/mDx总体积(ml)
③比活~平均效价xl.75/0·D
2.对产品收率和比活的测定
①对解析液进行总效价和比活测定，结果如下:
总效价:2489万单位，比活:325iu/mgP
②精制后总效价和比活
总效价:1082万单位;比活:”660iu/mgP
③精制收率:41%
三、讨论
1.尿激酶通常以两种分子形式存在，即分子量36。。。和54000，大分子量的尿激酶活性
较小分子量尿激酶活性强得多，提高比活，一是要去除杂蛋白，二是要除去小分子量尿激酶。
分离出的小分子量尿激酶可以另作回收纯化处理。
2.尿激酶作为一种活性物质，在纯化过程中要注意防止失活。我们在研究过程中，先是
熟练地掌握尿激酶效价和比活的测定步骤，然后不断改变操作条件，通过对每一道工序中影
响尿激酶收率、比活提高因素的研究，逐步摸索出最佳技术条件。
3.对CM一S吸附后的母液及CM一S洗脱液中效价大于200iu/ml的部分要进行超滤盐
析回收，可用作粗品投料。

用于提取尿激酶的男性尿液，其pH值<6.5，电导为20~3OMO一’，细菌总数<1000
个/ml，用3N氢氧化钠调pH~8·5一9.加入硅藻土吸附并沉淀后，滤取硅藻土，用清水搅拌洗涤，甩干装入交换柱，用氨水淋洗，在洗脱液中加入饱和磷酸二钠,调pH=8.0，再加氯化钠调电导至22Mn，通过季钱乙基，交联聚糖凝胶层析柱，再用磷酸缓冲液洗脱，合并流出液与洗脱液，加醋酸调pH一4.2，调电导至16~17Mn一’，通过甲基纤维素层析柱，用氨水洗脱，收集洗脱液，加水透析，经离心分机冷冻干燥得到尿激酶成品。上述得到的仅为尿激酶粗品，还可用右旋糖配、肝素、人血清白蛋白等加以修饰精制，以增强其生化稳定性，延长在人体内的作用时间。除用上述分离法制取尿激酶外，还可以采用中性蛋白酶降解的办法制取尿激酶。国外还有采用DNA重组的办法，在大肠杆菌中培植尿激酶原。在提取尿激酶的同时还可利用剩余尿液提取人尿白蛋白.

尿激酶属碱性蛋白酶无抗原性，无毒性和其它副作用，可临床用于肺栓塞、冠心病、脑血栓、心肌梗塞、玻璃体混浊、眼底出血、颅内血肿、静脉栓塞以及急
(慢)性肾小球肾炎等疾病的治疗，还可用于治疗纤维蛋白沉着引起的疾病，并可用作抗癌辅助药物。此外，尿激酶还可用来开发保健饮料、太空饮料及化妆品等。作为乡镇企业，开发尿激酶产品，不仅投资少，效益高，能耗低，且原料易得，工艺简单，无毒无害无污染，值得大力提倡.

8. 肝腹水可以治好吗

肝腹水是肝硬化晚期的典型并发症，一旦出现肝腹水往往代表肝硬化步入了晚期。肝腹水治疗情况主要看患者身体情况和治疗措施，大多数早发现早治疗的肝腹水患者病情可以得到控制，使肝腹水消退，身体达到基本康复。但是，如果出现肝腹水后仍然不积极治疗，或者治疗方法不恰当，就有可能使病情迅速恶化，甚至导致死亡。
事实证明多数经过专业治疗的肝腹水能有效控制，肝腹水治好后只要注意生活细节，保持乐观的精神状态，遵循医嘱，防止肝腹水的复发。

9. 净水器能够过滤掉水中的病菌吗

净水器能够过滤掉水中的病菌，在家庭使用净水机对于滤除杂质、有毒物、细菌、病毒、余氯版、化学权物质（苯、有机磷、丙酮、乙醚等）、重金属（镉、铅、汞、铬、砷等）确实会发挥重要的作用。

对于城市供水而言，净水器还能有效解决自来水出厂后因为管道输送原因导致的“最后一公里”污染，以及因为家庭装修中使用的管道（水具）等“最后一米”污染。

(9)慢病毒浓缩超滤柱扩展阅读：

在购买净水器时最好选购“智能多级滤芯更换提示”功能的净水机。可带来更长效的优质饮水和安全保障。作为净水机最核心的部件，反渗透滤芯状态直接影响出水的品质，所以定期更换是必不可少的。

为保证净水效果及防止二次污染，净水机要根据额定出水总净水量按时更换滤芯。以往人工计算净水量不准确，目前市场上已有MAX3.0长效技术类型的产品，反渗透核心滤芯寿命延长至3年，高于传统反渗透滤芯1.5倍。

10. 与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有什么特点

2.1 概述 ? 在自然科学,尤其是生命科学高度发展的今天,蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题,而生物大分子结构与功能的研究,必须首先解决生物大分子的制备问题,有能够达到足够纯度的生物大分子的制备工作为前题,结构与功能的研究就无从谈起.然而生物大分子的分离纯化与制备是一件十分细致而困难的工作. ? 与化学产品的分离制备相比较,生物大分子的制备有以下主要特点： ? ⑴生物材料的组成极其复杂,常常包含有数百种乃至几千种化合物. ? ⑵许多生物大分子在生物材料中的含量极微,分离纯化的步骤繁多,流程长. ? ⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活,因此分离过程中如何防止其失活,就是生物大分子提取制备最困难之处. ? ⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的,温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响,很难准确估计和判断. ? 生物大分子的制备通常可按以下步骤进行： ? ①确定要制备的生物大分子的目的和要求,是进行科研、开发还是要发现新的物质. ? ②建立相应的可靠的分析测定方法,这是制备生物大分子的关键. ? ③通过文献调研和预备性实验,掌握生物大分子目的产物的物理化学性质. ? ④生物材料的破碎和预处理. ? ⑤分离纯化方案的选择和探索,这是最困难的过程. ? ⑥生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定,要求达到一维电泳一条带,二维电泳一个点,或HPLC和毛细管电泳都是一个峰. ? ⑦产物的浓缩,干燥和保存. ? ? 分析测定的方法主要有两类： ? 即生物学和物理、化学的测定方法. ? 生物学的测定法主要有：酶的各种测活方法、蛋白质含量的各种测定法、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等； ? 物理、化学方法主要有：比色法、气相色谱和液相色谱法、光谱法（紫外／可见、红外和荧光等分光光度法）、电泳法、以及核磁共振等. ? 实际操作中尽可能多用仪器分析方法,以使分析测定更加快速、简便. 要了解的生物大分子的物理、化学性质主要有： ? ①在水和各种有机溶剂中的溶解性. ? ②在不同温度、pH 值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性. ? ③固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性. ? ④各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数. ? ⑤其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性. ? ⑥对其他生物分子的特殊亲和力. ? 制备生物大分子的分离纯化方法多种多样,主要是利用它们之间特异性的差异,如分子的大小、形状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其他分子的亲和性等. ? 各种方法的基本原理可以归纳为两个方面： ? ①利用混合物中几个组分分配系数的差异,把它们分配到两个或几个相中,如盐析、有机溶剂沉淀、层析和结晶等； ? ②将混合物置于某一物相（大多数是液相）中,通过物理力场的作用,使各组分分配于不同的区域,从而达到分离的目的,如电泳、离心、超滤等. ? 目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是电泳、层析和高速与超速离心. ? 2.2 生物大分子制备的前处理 ? 2.2.1 生物材料的选择 ? 制备生物大分子,首先要选择适当的生物材料.材料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物. ? 选择的材料应含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低,尽可能保持新鲜,尽快加工处理. ? 动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分,绞碎后在适当的溶剂中提取,如果所要求的成分在细胞内,则要先破碎细胞. ? 植物要先去壳、除脂. ? 微生物材料要及时将菌体与发酵液分开. ? 生物材料如暂不提取,应冰冻保存.动物材料则需深度冷冻保存. ? 2.2.2 细胞的破碎 ? 不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织,其细胞破碎的难易不一,使用的方法也不相同,如动物脏器的细胞膜较脆弱,容易破碎,植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁,要采取专门的细胞破碎方法. ? (1)机械法： ? 1) 研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中,加入少量石英砂研磨或匀浆. ? 2) 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法,通常可先用家用食品加工机将组织打碎,然后再用10000r/min～20000r/min的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织的细胞打碎. ? (2)物理法： ? 1) 反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃,然后放于室温(或40℃)迅速融化,如此反复冻融多次,由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎. ? 2) 超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器.破碎微生物细菌和酵母菌时,时间要长一些. ? 3) 压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法.在1000×105Pa～2000×105Pa 的高压下使细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压,细胞将彻底破碎. ? 4) 冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法.在90℃左右维持数分钟,立即放入冰浴中使之冷却,如此反复多次,绝大部分细胞可以被破碎. ? (3)化学与生物化学方法： ? 1) 自溶法：将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下,细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解,使细胞内含物释放出来. ? 2) 溶胀法：细胞膜为天然的半透膜,在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中,由于存在渗透压差,溶剂分子大量进入细胞,将细胞膜胀破释放出细胞内含物. ? 3) 酶解法：利用各种水解酶,如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等,于37℃,pH8,处理15分钟,可以专一性地将细胞壁分解. ? 4) 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞,可将细胞膜溶解,从而使细胞破裂,此法也可以与研磨法联合使用. ? ? 2.2.3 生物大分子的提取 ? “提取”是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细胞置于溶剂中,使被分离的生物大分子充分地释放到溶剂中,并尽可能保持原来的天然状态不丢失生物活性的过程. ? 影响提取的因素主要有： ? 目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小； ? 由固相扩散到液相的难易； ? 溶剂的pH值和提取时间等. ? 通常： ? 极性物质易溶于极性溶剂,非极性物质易溶于非极性溶剂； ? 碱性物质易溶于酸性溶剂,酸性物质易溶于碱性溶剂； ? 温度升高,溶解度加大； ? 远离等电点的pH值,溶解度增加. ? 提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加和保持其生物活性. ? ⑴ 水溶液提取： ? 蛋白质和酶的提取一般以水溶液为主.稀盐溶液和缓冲液对蛋白质的稳定性好,溶解度大,是提取蛋白质和酶最常用的溶剂.用水溶液提取生物大分子应注意的几个主要影响因素是： ? 1) 盐浓度（即离子强度）： ? 离子强度对生物大分子的溶解度有极大的影响,有些物质,如DNA-蛋白复合物,在高离子强度下溶解度增加. ? 绝大多数蛋白质和酶,在低离子强度的溶液中都有较大的溶解度,如在纯水中加入少量中性盐,蛋白质的溶解度比在纯水时大大增加,称为“盐溶”现象.盐溶现象的产生主要是少量离子的活动,减少了偶极分子之间极性基团的静电吸引力,增加了溶质和溶剂分子间相互作用力的结果. ? 为了提高提取效率,有时需要降低或提高溶剂的极性.向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其极性降低,增加离子强度（如加入KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4）可以增加溶液的极性. ? ? 2) pH值：蛋白质、酶与核酸的溶解度和稳定性与pH值有关.过酸、过碱均应尽量避免,一般控制在pH=6～8范围内,提取溶剂的pH应在蛋白质和酶的稳定范围内,通常选择偏离等电点的两侧. ? 3) 温度：为防止变性和降解,制备具有活性的蛋白质和酶,提取时一般在0℃～5℃的低温操作. ? 4) 防止蛋白酶或核酸酶的降解作用：加入抑制剂或调节提取液的pH、离子强度或极性等方法使相应的水解酶失去活性,防止它们对欲提纯的蛋白质、酶及核酸的降解作用. ? 5) 搅拌与氧化：搅拌能促使被提取物的溶解,一般采用温和搅拌为宜,速度太快容易产生大量泡沫,增大了与空气的接触面,会引起酶等物质的变性失活.因为一般蛋白质都含有相当数量的巯基,有些巯基常常是活性部位的必需基团,若提取液中有氧化剂或与空气中的氧气接触过多都会使巯基氧化为分子内或分子间的二硫键,导致酶活性的丧失.在提取液中加入少量巯基乙醇或半胱氨酸以防止巯基氧化. ? ⑵ 有机溶剂提取 ? 一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶难溶于水、稀盐、稀酸、或稀碱中,常用不同比例的有机溶剂提取. ? 常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等,这些溶剂可以与水互溶或部分互溶,同时具有亲水性和亲脂性. ? 有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱,又能溶于含有一定比例的有机溶剂的水溶液中,在这种情况下,采用稀的有机溶液提取常常可以防止水解酶的破坏,并兼有除去杂质提高纯化效果的作用. 例如,胰岛素（见讲义p36）. ? 2.3 生物大分子的分离纯化 ? 由于生物体的组成成分是如此复杂,数千种乃至上万种生物分子又处于同一体系中,因此不可能有一个适合于各类分子的固定的分离程序,但多数分离工作关键部分的基本手段是相同的. ? 为了避免盲目性,节省实验探索时间,要认真参考和借鉴前人的经验,少走弯路.常用的分离纯化方法和技术有： ? 沉淀法（包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀等）、离心、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等.本章以介绍沉淀法为主. ? 2.3.1 沉淀法 ? 沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程.沉淀法（即溶解度法）操作简便,成本低廉,不仅用于实验室中,也用于某些生产目的的制备过程,是分离纯化生物大分子,特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法.通过沉淀,将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相,而与杂质得到初步的分离. ? 其基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的,不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的,溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关,溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变. ? 在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是： ? ⑴中性盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化. ? ⑵有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化. ? ⑶选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白. ? ⑷等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀,但此法单独应用较少,多与其他方法结合使用. ? ⑸有机聚合物沉淀： 是发展较快的一种新方法, 主要使用PEG聚乙二醇（Polyethyene glycol）作为沉淀剂. ? 2.3.1.1 中性盐沉淀（盐析法） ? 在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”.除了蛋白质和酶以外,多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离. ? 盐析法应用最广的还是在蛋白质领域,已有八十多年的历史,其突出的优点是： ? ①成本低,不需要特别昂贵的设备. ? ②操作简单、安全. ? ③对许多生物活性物质具有稳定作用. ? ⑴ 中性盐沉淀蛋白质的基本原理 ? 蛋白质和酶均易溶于水,因为该分子的－COOH、－NH2和－OH都是亲水基团,这些基团与极性水分子相互作用形成水化层,包围于蛋白质分子周围形成1nm～100nm颗粒的亲水胶体,削弱了蛋白质分子之间的作用力,蛋白质分子表面极性基团越多,水化层越厚,蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大,因而溶解度也越大.亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜.因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性,所以加入大量中性盐后,夺走了水分子,破坏了水膜,暴露出疏水区域,同时又中和了电荷,破坏了亲水胶体,蛋白质分子即形成沉淀.盐析示意图如下页“图 4”所示. ? ⑵ 中性盐的选择 ? 常用的中性盐中最重要的是（NH4）2SO4,因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点： ? 1) 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度,这是其他盐类所不具备的.由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定,因而盐析操作也要求在低温下（0～4℃）进行.由下表可以看到, 硫铵在0℃时的溶解度,远远高于其它盐类： ? 表2-1 几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水） ? 0℃ 20℃ 80℃ 100 ℃ （NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103 ? Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2 ? NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 101 ? ? ? ? ? 2) 分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵 盐析,一步就可以除去75％的杂蛋白,纯 度提高了四倍. ? 3) 不易引起变性,有稳定酶与蛋白质结构的 作用.有的酶或蛋白质用2～3mol/L浓度的 （NH4）2SO4保存可达数年之久. ? 4) 价格便宜,废液不污染环境. ? ⑶ 盐析的操作方法 ? 最常用的是固体硫酸铵加入法.将其研成细粉,在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入,接近计划饱和度时,加盐的速度更要慢一些,尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀.盐析后要在冰浴中放置一段时间,待沉淀完全后再离心与过滤. ? 在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离,高浓度硫酸铵常用过滤方法. ? 各种饱和度下需加固体硫酸铵的量可由附录中查出. ? ⑷ 盐析曲线的制作 ? 如果要分离一种新的蛋白质和酶,没有文献数据可以借鉴,则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度.具体操作方法如下(讲义p39)： 蛋白质量(mg)或酶活力 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫铵饱 和度％ ? ⑸盐析的影响因素 ? 1) 蛋白质的浓度：高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度沉淀,若蛋白质浓度过高,易产生各种蛋白质的共沉淀作用.低浓度的蛋白质,共沉淀作用小,但回收率降低.较适中的蛋白质浓度是2.5％～3.0％,相当于25 mg/mL～30mg/mL. ? 2) pH值对盐析的影响：在等电点处溶解度小,pH值常选在该蛋白质的等电点附近. ? 3) 温度的影响：对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子,在高离子强度溶液中,温度升高,它们的溶解度反而减小.在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随浓度升高而增加的.一般情况下,可在室温下进行.但对于某些对温度敏感的酶,要求在0℃～4℃下操作,以避免活力丧失. ? ? 2.3.1.2 有机溶剂沉淀法 ? ⑴基本原理 ? 有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用,是较早使用的沉淀方法之一.其原理主要是： ? ①降低水溶液的介电常数,向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数,减小溶剂的极性,从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力,导致蛋白质溶解度降低而沉淀. ? ②由于使用的有机溶剂与水互溶,它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子,破坏了蛋白质分子的水膜,因而发生沉淀作用. ? ? 有机溶剂沉淀法的优点是： ? ①分辨能力比盐析法高,即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀. ? ②沉淀不用脱盐,过滤比较容易（如有必要,可用透析袋脱有机溶剂）.因而在生化制备中有广泛的应用. ? 其缺点是对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活,操作需在低温下进行. ? ⑵有机溶剂的选择和浓度的计算 ? 用于生化制备的有机溶剂的选择首先是要能与水互溶.沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮. ? 为了获得沉淀而不着重于进行分离,可用溶液体积的倍数：如加入一倍、二倍、三倍原溶液体积的有机溶剂,来进行有机溶剂沉淀. ? ⑶有机溶剂沉淀的影响因素 ? 1) 温度：多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感,温度稍高就会引起变性,且有机溶剂与水混合时产生放热反应,因此必须预冷,操作要在冰盐浴中进行,加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓. ? 一般规律是温度越低,得到的蛋白质活性越高. ? 2) 样品浓度：低浓度样品回收率低,要使用比例更大的有机溶剂进行沉淀.高浓度样品,可以节省有机溶剂,减少变性的危险,但杂蛋白的共沉淀作用大. ? 通常使用5mg/mL～20mg/mL的蛋白质初浓度为宜. ? ? 3) pH值：选择在样品稳定的pH值范围内,通常是选在等电点附近,从而提高此沉淀法的分辨能力. ? 4) 离子强度：盐浓度太大或太小都有不利影响,通常盐浓度以不超过5％为宜,使用乙醇的量也以不超过原蛋白质水溶液的2倍体积为宜,少量的中性盐对蛋白质变性有良好的保护作用,但盐浓度过高会增加蛋白质在水中的溶解度,降低了沉淀效果,通常是在低浓度缓冲液中沉淀蛋白质. ? 沉淀所得的固体样品,如果不是立即溶解进行下一步的分离,则应尽可能抽干沉淀,减少其中有机溶剂的含量,如若必要可以装透析袋透析脱有机溶剂,以免影响样品的生物活性. ? 2.3.1.3 选择性变性沉淀法 ? 这一方法是利用生物大分子与非目的生物大分子在物理化学性质等方面的差异,选择一定的条件使杂蛋白等非目的物变性沉淀而得到分离提纯. ? ⑴ 热变性 ? 利用生物大分子对热的稳定性不同,加热升高温度使非目的生物大分子变性沉淀而保留目的物在溶液中. ? ⑵ 表面活性剂和有机溶剂变性 ? 使那些对表面活性剂和有机溶剂敏感性强的杂蛋白变性沉淀.通常在冰浴或冷室中进行. ? ⑶ 选择性酸碱变性 ? 利用对pH值的稳定性不同而使杂蛋白变性沉淀.通常是在分离纯化流程中附带进行的分离纯化步骤. ? 2.3.1.4 等电点沉淀法 ? 利用具有不同等电点的两性电解质,在达到电中性时溶解度最低,易发生沉淀,从而实现分离的方法.氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质,可以利用此法进行初步的沉淀分离. ? 由于许多蛋白质的等电点十分接近,而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度,不能完全沉淀析出,因此,单独使用此法分辨率较低,因而此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用,以提高沉淀能力和分离效果. ? 此法主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白,而不用于沉淀目的物. ? 2.3.1.5 有机聚合物沉淀法 ? 有机聚合物是六十年代发展起来的一类重要的沉淀剂,最早应用于提纯免疫球蛋白和沉淀一些细菌和病毒.近年来广泛用于核酸和酶的纯化.其中应用最多的是 “聚乙二醇”【HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH (n ＞4)】( Polyethylene Glycol 简写为 PEG ),它的亲水性强,溶干水和许多有机溶剂,对热稳定,有广泛围的分子量,在生物大分子制备中,用的较多的是分子量为6000～20000的 PEG. ? 本方法的优点是： ? ①操作条件温和,不易引起生物大分子变性. ? ②沉淀效能高,使用很少量的P“EG即可以沉淀相当多 的生物大分子. ? ③沉淀后有机聚合物容易去除. ? 2.3.2 透析 ? 自Thomas Graham 1861年发明透析方法至今已有一百多年.透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一.在生物大分子的制备过程中,除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术. ? 透析只需要使用专用的半透膜即可完成.保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”,袋（膜）外的溶液称为“渗出液”或“透析液”.截留分子量MwCO通常为1万左右. ? 用1％ BaCl2检查(NH4)2SO4,用1％ AgNO3 检查NaCl、KCl等. ? 2.3.3 超滤 ? 超过滤即超滤,自20年代问世后,直至60年代以来发展迅速,很快由实验室规模的分离手段发展成重要的工业单元操作技术.超滤现已成为一种重要的生化实验技术,广泛用于含有各种小分子溶质的各种生物大分子（如蛋白质、酶、核酸等）的浓缩、分离和纯化. ? 超滤是一种加压膜分离技术,即在一定的压力下,使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜,而使大分子溶质不能透过,留在膜的一边,从而使大分子物质得到了部分的纯化. ? 超滤根据所加的操作压力和所用膜的平均孔径的不同,可分为微孔过滤、超滤和反渗透三种. ? 微孔过滤所用的操作压通常小于4×104Pa,膜的平均孔径为500埃～14微米（1微米＝104埃）,用于分离较大的微粒、细菌和污染物等. ? 超滤所用操作压为4×104Pa～7×105Pa,膜的平均孔径为10—100埃,用于分离大分子溶质. ? 反渗透所用的操作压比超滤更大,常达到35×105Pa～140×105Pa,膜的平均孔径最小,一般为10埃以下,用于分离小分子溶质,如海水脱盐,制高纯水等. ? 超滤技术的优点是操作简便,成本低廉,不需增加任何化学试剂,尤其是超滤技术的实验条件温和,与蒸发、冰冻干燥相比没有相的变化,而且不引起温度、pH的变化,因而可以防止生物大分子的变性、失活和自溶. ? 在生物大分子的制备技术中,超滤主要用于生物大分子的脱盐、脱水和浓缩等. ? 超滤法也有一定的局限性,它不能直接得到干粉制剂.对于蛋白质溶液,一般只能得到10～50％的浓度. ? 超滤技术的关键是膜. ? 常用的膜是由乙酸纤维或硝酸纤维或此二者的混合物制成.近年来发展了非纤维型的各向异性膜,例如聚砜膜、聚砜酰胺膜和聚丙烯腈膜等.这种膜在pH 1～14都是稳定的,且能在90℃下正常工作.超滤膜通常是比较稳定的,能连续用1～2年. ? 超滤膜的基本性能指标：水通量（cm3/(cm2?h)）；截留率（以百分率％表示）；化学物理稳定性（包括机械强度）等. ? 超滤装置由若干超滤组件构成.分为板框式、管式、螺旋卷式和中空纤维式四种主要类型. ? 由于超滤法处理的液体多数是含有水溶性生物大分子、有机胶体、多糖及微生物等.这些物质极易粘附和沉积于膜表面上,造成严重的浓差极化和堵塞,这是超滤法最关键的问题,要克服浓差极化,通常可加大液体流量,加强湍流和加强搅拌. ? 2.3.4 冰冻干燥 ? 冰冻干燥机是生化与分子生物学实验室必备的仪器之一,因为大多数生物大分子分离纯化后的最终产品多数是水溶液,要从水溶液中得到固体产品,最好的办法就是冰冻干燥