⑴ 使用蔗糖密度梯度离心时，不同浓度的蔗糖为什么会分层
使用蔗糖密度梯度离心时，不同浓度的蔗糖为什么会分层
纯化病毒常用的方法是蔗糖密度梯度离心法，能得到比较纯的病毒。其过程如下：
1、将收集的组织或脏器或其他,用玻璃匀浆器充分研磨后制成悬液,经反复冻融3 次后,置- 20 ℃冰箱中,备用。
2、先以5000g离心15分钟后，获取上清夜，然后再20000g高速离心30分钟后取上清夜。
3、接着10万g超速离心2h，将沉淀用少量STE溶解。
4、先在超速离心管中加入5-8mL的第3步所获取的含病毒样品的溶解液，然后在离心管中依次加入30 % , 45 % , 60 %的蔗糖,加的时候是用长针头从底部往上加的。11万g离心2.5h,发现在30 %与45 % 以及45 % 与60 %之间都有一条明亮的带，用长针头将两条不同部位的带都吸取出来，分别收集到不同的瓶内。
5、去蔗糖；用STE缓冲液适量稀释纯化的病毒，然后11万g离心3h,用少量STE（根据沉淀的量决定加入多少）缓冲液把沉淀悬起，即最后获得了纯化的病毒。-20度冻纯备用，用时可用分光光度计测定其病毒含量。
⑵ 外泌体与蛋白比较，分子质量谁大
一般来说外泌体大，因为外泌体内可包含许多种蛋白和小RNA。
⑶ 什么是外泌体
外泌体是健康和疾病中细胞间近距离通讯的介质，影响细胞生物学的各个方面。[1]
所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。有关他们分泌和摄取及其组成、“运载物”和相应功能的精确分子机制刚刚开始研究。外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，对外泌体的研究兴趣日益增长，无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。
⑷ 离心分离外泌体是差速离心与密度梯度离心一起用吗
标准方法：Ficoll-泛影钠（Ficoll-Hypaque）密度梯度及红细胞裂解法1）取一50ml聚乙烯管，无菌采集专人外周静脉血属，加4.4ml3.8%或5%的柠檬酸盐液定容至40ml。上述全血300gX20min，离心，室温。2）吸出富含血小板的上清，2500gX15min，制备无血小板血浆（platelet-poorPlasma,PPP）。3）余下的沉降全血加入5ml6%Dextran(分子量500,000，用无菌生理盐水配制)，并用生理盐水（0.9%）调节最终体积至50ml，轻轻、彻底混匀。室温沉降30min。4）吸出富含白细胞的上层液，275gX6min。5）沉淀的细胞用8mlPPP-生理盐水（1：4）重悬，并移到15ml离心管中。6）悬液细胞上面加入3mlFicoll-Hypaque（密度1.077），750gX5min，室温。7）吸取富含中性粒细胞和红细胞层，用0.155MNH4Cl重悬细胞，使红细胞裂解，然后中性粒细胞用含0.25%BSAHanks平衡液（HBSA，无钙）洗2次，最终用HBSA（含钙）重悬。8）用此法可得95%以上的中性粒细胞。
⑸ 用血清超速离心法提取外泌体，能提取到多少
绝大多数培养基是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上，添加了氨基酸、维生素和其它与血清中浓度相似的营养物质。最广泛应用的培养基是Eearle`s MEM 的混合物，其中含有13种必须氨基酸、8种维生素。而Ham`s F12 也包括非必须氨基酸，维生素的范围亦很广，另外常规含有无机盐和代谢添加剂（例如核苷酸）。MEM/F12 这两种培养基各取1/2，形成神经生物学最通用的培养基。Dulbecco`s改良培养基——DMEM，现应用于快速生长的细胞，同MEM含有相同的营养成分，但浓度高出2~4倍
⑹ 什么是外泌体保存液，外泌体保存液介绍
外泌体(exosomes)是一种由活细胞分泌，直径在30-150nm，具有双层脂质膜结构的小囊泡，它在机体内广泛存在，如外周血、腹水、尿液、唾液、脑脊液等各种体液中，内含丰富的蛋白质、脂质以及核酸等生物活性成分。外泌体参与物质运输，还携带和传递重要的生物信息，在介导免疫抗原递呈、树突状细胞的活化、神经退行性疾病发生、肿瘤细胞抗原的转移及肿瘤诊断治疗中发挥重要作用，吸引了很多科研人员的关注，在深入研究外泌体前，外泌体的提取纯化、鉴定及合理保存是首要的步骤，也是一切后续实验的基础，只有高活性、高稳定性的外泌体才能确保后续实验的质量和可信度。
目前外泌体只能在2～8℃稳定保存3天，-20℃稳定保存1个月。长期保存需要-80℃低温，并且不能冻融，存储条件要求高，这些缺点影响了外泌体的深入研究。
由此，有效保持外泌体的完整性、生物活性和内含物稳定性的外泌体保存液仍有待开发。
⑺ 如何对exosomes进行成分分析
外泌体（Exosomes）是一种直径在40～100 nm的圆形单层膜结构，可由机体众多类型细胞释放，并广泛分布于唾液、血浆、乳汁、尿液等体液当中。外泌体可携带多种蛋白质、mRNA、miRNA，参与细胞通讯、细胞迁移、血管新生和肿瘤细胞生长等过程。2007 年，Valadi等发现细胞分泌的外泌体中含有生物学活性的mRNA、microRNA，使得研究人员对外泌体的研究热情激增。
传统的外泌体分离要涉及超速离心，操作繁琐、过程冗长，所得到的外泌体纯度较低。美国101Bio提供的系列外泌体分离试剂盒，可从细胞培养基或血清中富集大量完整的外泌体，试剂盒具有
ü 方便——无需超速离心；
ü 快捷——不到2个小时即可完成外切体分离纯化；
ü 高回收率——是超速离心的5~10倍；
ü 高纯度——所得外切体纯度高达95% 以上；
ü 仅需2ml的细胞培养基或200ul血清，即可获得足够的外切体用于下游研究。
PureExo®Exosomes Isolation Kit for Cell Culture Media
试剂盒组分
Solution A、Solution B、Solution C和PureExo® Columns
操作步骤
1. 无血清培养或血清饥饿48小时的细胞培养液于4℃ 600 g 离心10mins取上清；
2. 在玻璃管中按照比例加入细胞上清液及ABC混合液摇匀；
3. 于4℃孵育1h后出现分层；
4. 弃上层培养基，并将其余液体转移至EP管；
5. 1000g离心3mins，出现分层，弃上层培养基及下层无色澄清液体；
6. 上述步骤重复操作一次；
7. 室温干燥5~10mins后用1X PBS重悬；
8. 重悬液转移至纯化柱中，2000g离心5mins；
9. 收集流出液即为外切体。