Ⅰ 凯氏定氮法测定蛋白质含量的基本原理
样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳、氢被氧化为CO2和H2O逸出回，而样品中的答有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵，硫酸铵用NaOH中和生成NH3`H2O，加热又分解为氨，用硼酸吸收，吸收氨后的硼酸再以标准盐酸或硫酸溶液滴定，根据标准酸消耗量计算蛋白质的含量。
Ⅱ 试述用凯氏定氮法测定面粉中蛋白质含量的原理，简要步骤和计算公式。
测定蛋白质的方法可分为两大类：一类是利用蛋白质的物理化学性质来推算，如密度、折射率、紫外吸收、荧光性等；另一类是利用化学方法来计算，如定氮、双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂反应等
主要测定方法有：双缩脲法、染料结合法、酚试剂法、紫外分光光度法、水扬酸比色法、折光法、旋光法、近红外光谱法.
目前蛋白质测定最常用的方法是凯氏定氮法，是通过测总氮量来确定蛋白质含量的方法。
凯氏定氮法是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量,此法的结果称为粗蛋白质含量：由于样品中含有少量非蛋白质含氮化合物，如核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物.凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作较为简单的方法之一，可用于所有动、植物食品的分析及各种加工食品的分析，可同时测定多个样品，故国内外应用较为普遍，是个经典分析方法[6]。至今仍被作为标准检验方法.此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定
凯氏定氮法可分为全量法、微量法及经改进后的改良凯氏定氮法目前通常以硫酸铜作催化剂的常量、半微量、微量凯氏定氮法样品质量及试剂用量较少，且有一套微量凯氏定氮器。在凯氏法改良中主要的问题是，氮化合物中氮的完全氨化问题及缩短时间、简化操作的问题，即分解试样所用的催化剂。常量改良凯氏定氮法在催化剂中增加了二氧化钛[4].
在理化实验室,检验食品中蛋白质的含量通常用微量凯氏定氮法和全量凯氏定氮法.接下来以大量的试验来比较微量凯氏定氮法和全量凯氏定氮法的精确度的大小.
1.材料与方法：
1.1试验材料
1.1.1试验样品
面粉
1.1.2试验药品和试剂
所有试剂均为分析纯；水为蒸馏水或同等纯度的水。
硫酸铜；
硫酸钾；
浓硫酸；
40％氢氧化钠溶液：称取40g氢氧化钠溶于60mL蒸馏水中；
4％硼酸溶液：称取4g硼酸溶于蒸馏水中稀释至lOOmL；
0．1mol／L盐酸标准滴定溶液；
甲基红次甲基蓝混合指示液：将次甲基蓝乙醇溶液(1g／L)与甲基红乙醇溶液(1g／L)按1+2体积比混合。
1.1.3仪器和设备：
实验室常规仪器及下列各项：
凯氏烧瓶：500mL；
可调式电炉；蒸汽蒸馏装置；
铰肉机：
篦孔径不超过4nm；
组织捣碎机；
粉碎机；
研钵：玻璃或瓷质；
化学消化器，
凯氏定氮仪，
空气滤过器
1.2试验方法
1.2.1微量凯氏定氮法
微量凯氏定氮法的原理
样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后取消化液的1/10加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定[2]。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。包括消化、蒸馏、吸收、滴定四个步骤
1.2.2全量凯氏定氮法
全量凯氏定氮法的原理
样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后取消化液的全部加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。包括消化、蒸馏、吸收、滴定四个步骤
2 分析过程
试样制备：固体样品：取有代表性的样品至少200g，用研钵捣碎、研细；不易捣碎、研细的样品应切(剪)成细粒；干固体样品用粉碎机粉碎；液体样品：取充分混匀的液体样品至少200g。粉状样品：取有代表性的样品至少200g(如粉粒较大也应用研钵研细)，混合均匀；糊状样品：取有代表性的样品至少200g，混合均匀；固液体样品：按固、液体比例，取有代表性的样品至少200g，用组织捣碎机捣碎，混合均匀；肉制品：取去除不可食部分、具有代表性的样品至少200g，用铰肉机至少铰两次，混合均匀。上述试样应放入密闭玻璃容器中，于4°C冰箱内贮存备用，尽快测定。
2.1微量凯氏定氮法的分析过程
2.1.1样品消化 :
步骤：准确称取一定量的样品，加入硫酸铜0.5g、硫酸钾10g和浓硫酸20mL、玻璃珠数粒→小心移入干燥洁净的500ml凯氏烧瓶中(固体或粉末用纸卷成纸筒送入)，轻轻摇匀，以45º斜支于有小孔的石棉网上→用电炉以小火加热(或先烧瓶放在距电炉较远处)，待内容物全部炭化、泡沫停止产生后→加大火力(或将烧瓶放在电炉上)，保持瓶内液体微沸→至液体变蓝绿色透明后→继续加热微沸30min→关闭电炉，取下烧瓶、冷却→转移至100ml容量瓶中，加水定容
2.1.2 蒸馏与吸收：
按图安装好微量定氮蒸馏装置。于水蒸气发生瓶内装水至2/3容积处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠。在接受瓶中加入10ml40g/L硼酸及2滴混合指示剂，将冷凝管下端插入液面以下。准确吸取消化液10mL于反应管内，经漏斗再加入10mL氢氧化钠溶液，用少量蒸馏水冲洗漏斗，夹好漏斗夹并水封，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水进行蒸馏。指示剂变绿色后继续蒸馏10min，将冷凝管尖端提离液面继续蒸1min
Ⅲ 凯氏定氮仪测定蛋白质的方法确认怎么做
最关键的是计算：
X =(（V1-V2）*N*0.014)/( m*（10/100）) *F*100%
X：样品中蛋白内质的百分含量，容g；
V1：样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml；
V2：试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，ml；
N：硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度；
0.014：1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；
m：样品的质量（体积），g（ml）；
F：氮换算为蛋白质的系数。蛋白质中的氮含量一般为15～17.6%，按16%计算乘以6.25即为蛋白质，乳制品为6.38，面粉为5.70，玉米、高粱为6.24，花生为5.46，米为5.95，大豆及其制品为5.71，肉与肉制品为6.25，大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83，芝麻、向日葵为 5.30。
Ⅳ 粗蛋白的测定有没有比凯氏定氮更好地方法呀
主要成分是蛋白质。检验方法是剀氏定氮法。
蛋白质的测定方法
pro的测定方法分为两大类：一类是利用pro的共性，即含氮量，肽链和折射率测定pro含量，另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸、碱性基团和芳香基团测定pro含量。但是食品种类很多，食品中pro含量又不同，特别是其他成分，如碳水化合物，脂肪和维生素的干扰成分很多，因此pro的测定通常利用经典的剀氏定氮法是由样品消化成铵盐蒸馏，用标准酸液吸收，用标准酸或碱液滴定，由样品中含氮量计算出pro的含量。由于食品中pro含量不同又分为凯氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它们的基本原理都是一样的。
一 凯氏定氮法
这种方法是1883年Kjeldahl发明，当时凯氏只使用H2SO4来分解试样，来定量谷物中的pro，他只知用H2SO4分解试样，而不能阐明H2SO4分解有机氮化合物生成氨的反应历程，所以只使用H2SO4分解试样，需要较长时间，后来由Gunning加入改进，他改进的办法是在消化时加入K2SO4使沸点上升，这样加快分解速度，因为温度由原来硫酸沸点的380上升到400℃，提高了不到67℃所以速度也就加快了，凯氏定氮法至今仍在使用。
我们在检验食品中pro时，往往只限于测定总氮量，然后乘以pro核算等数，得到蛋白质含量，实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为粗pro。
1 凯氏常量定氮法：
不论常量、半微量以及微量定氮法它们的原理都是一样的，首先第一个步骤是消化：
（1）消化：样品与硫酸一起加热消化，硫酸使有机物脱水。并破坏有机物，使有机物中的C、H氧化为CO2和H2O蒸汽逸出，而pro则分解氮，则与硫酸结合成硫酸铵，留在酸性溶液中。
（2）在消化过程中添加硫酸钾可以提高温度加快有机物分解，它与硫酸反应生成硫酸氢钾，可提高反应温度，一般纯硫酸加热沸点330℃，而添加硫酸钾后，温度可达400℃，加速了整个反应过程。此外，也可以加入硫酸钠，氢化钾盐类来提高沸点。其理由随着消化过程硫酸的不断地被分解，水分的逸出而使硫酸钾的浓度增大，沸点增加。加速了有机的分解。但硫酸钾加入量不能太大，否则温度太高，生成的硫酸氢铵也会分解，放出氨而造成损失。
为了加速反应过程，还加入硫酸铜，氧化汞或硒粉作为催化剂以及加入少量过氧化氢，次氯酸钾作为氧化剂。但为了防止污染通常使用硫酸铜。
所以有机物全部消化后，出现硫酸铜的兰绿色，它具有催化功能，还可以作为碱性反应指示剂。
（1）蒸馏：样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨，在这操作中，一是加入氢氧化钠溶液要过量，二是要防止样液中氨气逸出。
（2）吸收与滴定：
蒸馏过程中放出的氨可用一定量的标准硫酸或标准盐酸溶液进行氨的吸收，然后再用标准氢氧化钠溶液反滴定过剩的硫酸或盐酸溶液，从而计算出总氮量。
半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后，再用标准盐酸直接滴定，硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影响指示剂变色反应，它有吸收氨的作用。
1．操作步骤：
准确称取样品中0.50-2.00g→于500ml凯氏瓶中→加10g无水K2SO4→加0.5gCuSO4→加20ml H2SO4→在通风橱中先以小火加热，待泡沫消失后，加大火力，消化至透明无黑粒后，将瓶子摇动一下使瓶壁炭粒溶于硫酸中→继续消化30分钟→至到样液呈绿色状态，停止消化，冷却→加200ml水→连接蒸馏装置→用硼酸作吸收液→在K氏瓶中加波动珠数粒和80ml50% NaOH→立即接好定氮球→加热→至到K氏瓶内残液减少到三分之一时，取出用水冲洗→用0.1N HCl滴定。
N（V2-V1）0.014
W
计算：
总氮量%= （N(V2-V1)×0.014）/W × 100
0.014----氮的毫克当量数
pro%=总氮%×K
乳制品K=6.38（N=15.7%）
小麦粉K=5.79（N=17.6%）
动物胶K=5.6（N=18.0%）
冰蛋K=6.7（N=14.8%）
大豆制品K=6.0（16.7%） K=6.25则（N=16%）
K-换称等数
各种试剂的作用:
浓H2SO4：
A ：脱水使有机物炭化，然后有机物炭化生成碳，碳将H2SO4还原为SO2，本身则变为CO2
B： 氧化
C： pro与浓H2SO4生成NH3↑，CO2，SO2，H2O↑
D： NH3与H2SO4生成硫酸铵
（1）CuSO4的作用（催化剂）
CuSO4为红色沉淀，当C完全消化后，反应停止，红色消失，变为兰色，即为消化达到完全，兰色为CuSO4的颜色
（2）K2SO4的作用（提高沸点）
沸点由330℃提高到400℃加速了反应过程。
（3）硒粉和过氧化氢，氧化汞都为催化剂，但为了防止污染通常采用硫酸铜
（4）50%NaOH的作用
下面我就针对几点来说明为何影响氨化完全和速度快的因素:
（1）K氏烧瓶和取样量
如果称1g以上的样品，就需要K氏烧瓶最小500ml，800~1000ml的更好，这样的K氏烧瓶对于缩短氨化时间，加热的均匀性和完全氨化效果最好。
（2）分解剂
A H2SO4和K2SO4的添加量
有机无分解需要H2SO4量，H2SO4应根据有机物种类不同而加的量就不同，如果试样含脂类高，则加H2SO4多，为了提高分解温度，要大量添加K2SO4，但不能太多，也不能太少，太少则氨化不充分。K2SO4和H2SO4的添加比例是：
1g样品 K2SO4： H2SO4=7g：12ml
这种比例在国内外都使用，是公认的
还有一种比例： K2SO4：H2SO4=10：20ml
B 催化剂
用作催化剂的有Hg、HgO、Se，硒化合物，CuSO4、TiO2，对Hg，HgO有毒但结果好，Se与CuSO4得到结果是一种，TiO2，的结果偏低，采用不同的催化剂则消化时间不同， HgO消化麦子为38，Se与CuSO4消化麦子55，TiO2消化麦子70，所以在给出测定结果时要注明催化剂的类型。
（3）热源的强度
消化时热源的强度同迅速消化和完全氨化关系很大，即便盐类K2SO4加得多，如果热源弱，也是没有意义的，热源过强导致H2SO4损失，使氨回收率低，另外K氏瓶的容量大小，颈部的粗细和长短等，也与热源的强度有关。
（4）氨的蒸馏和吸收及滴定
蒸馏有两种:
1 直接蒸馏（装置简便，准确性好）
2 水蒸汽蒸馏
蒸馏加NaOH是50%，加的量为H2SO4量的4倍，硫酸量为12ml，则NaOH为12×4=48ml，而且一般高于这个理论值，即加到50~55ml，如果NaOH量加的不够就变成H2S， H2S是强酸，使颜色变红。
吸收液有：
1标准H2SO4 用标准碱返滴定，甲醛红指示剂
2 硼酸 用HCl进行滴定，混合指示剂
目前都用硼酸吸收液，用硼酸代替H2SO4，这样可省略了反滴定，H2SO4是强酸，要求较严，而硼酸是弱酸，在滴定时，不影响指示剂变色范围，另外硼酸为吸收液浓度在3%以上可将氨完全吸收，为保险期间一般用4%。
〈6〉实验注意事项
a.样品应时均匀的，若是固体样品应事先研细，液体样要混合均匀。
b.样品放入K氏烧瓶时，不要黏附瓶颈上，万一黏附可用少量水缓慢冲下，以免被检样消化不完全，使结果偏低。
c.消化时，如不容易呈透明溶液，可将K氏烧瓶放冷后，加入30%过氧化氢催化剂2~3ml，促使氧化。
d.在整个消化过程中，不要用强火，保持和缓的沸腾，使火力集中在K氏烧瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。
e.如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这时会形成硫酸氢钾，而不与氨作用，因此当硫酸过多底物被消耗掉或样品中脂肪含量过高时，要添加硫酸量。
f.混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色，如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲醛红乙醇溶液。
g.氨是否完全蒸馏出来，PH试纸检查馏出液是否为碱性。
h.向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀无。这时由于分解促进剂与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀，有时Cu离子与氨作用生成深兰色的络合物。
i.消化剂绿色后继续消化30分钟即可。
2 K氏微量定氮仪法
3 K氏半微量定氮仪法 (2 、 3原理一样)
操作方法大同小异，半微量法消化后，定容100ml，然后吸25ml蒸馏吸收液吸收。
N（V2-V1）0.014
W＊10／100
计算总氮%=(N(V2-V1)×0.014)/(W×10/100)×100
对于微量定氮仪法，仪器有了改进，样液称样少，蒸馏消化液也少，其它基本一样。
4 K氏自动定氮法
原理与上面一样，仪器，采用K氏自动定氮仪：其装置内具有自动加碱蒸馏装置，自动吸收和滴定装置以及自动数字显示装置，消化装置：由优质玻璃制成的K氏消化瓶以及红外线装置的消化炉。
二 水扬酸比色法：
1 原理： 样品中的pro经H2SO4消化转化为铵盐溶液后，在一定的酸度和温度下与水扬酸钠和次氯酸钠作用生成有颜色的化合物，可以在波长660nm处比色测定，求出样品含氮量，计算蛋白质含量。
2 方法 （1）标准曲线的绘制
取6个25ml容量瓶编号 0 1 2 3 4 5 6
分别加空白酸液 2ml
分别加磷酸盐缓冲液 5ml
稀释至总体体积至15ml
分别加水扬酸钠 5ml
37C水浴 15分钟
加入次氯酸钠 2.5ml
37C水浴 15分钟
取出试液于660nm下进行比色，绘标准曲线。
（2）样品处理：
准确称样0.20~1.00g→于K氏瓶中→加15mlH2SO4和5g催化剂→电炉上加热到沸腾后→加大
火力消化→直到出现暗绿色时→摇动瓶子→K氏瓶全部消化后→冷却→加水至250ml容量
瓶。
（3）样品测定：
准确吸取上述消化溶液10ml→于100ml容量瓶中→定容→准确吸2ml→于25ml容量瓶中→加
5ml磷酸缓冲液→以下操作与标准曲线绘制的步骤相同
并以试剂空白微对照，测得样液的光密度，从标准曲线查出其含氮量。
（4）计算
C×F
含氮%= ---------------------------× 100
W×1000×1000
C---从标准曲线中查出测定样液的含氮量（Ug）
F---样品溶液的稀释倍数
W---样品重量（g）
pro%=总氮%×K（K可为6.25，也可查）
3注意事项：
A 当天消化液最好当天测定，结果重现性好，如果样液改至第二天比色就有变化。
B 当在PH和试剂适当范围内加入氯源后，颜色的显色和温度有关，应严格控制反应温度。
C 这种方法测定结果基本与K氏法一致。
4 试剂
（1）氯标液：称经110℃干燥2h的硫酸铵0.4719g→于烧瓶中定容10ml→此液1ml相当于
1.0mg氮标液→使用时配制成1ml相当于2.50Ug氮标液。
（2）空白酸液：称0.50g蔗糖→加15mlH2SO4和5g催化剂→与样品一样消化→定容250ml→
使用时吸收此液10ml→加水至100ml为工作液备用。
（3）磷酸盐缓冲液：称7.1g磷酸氢二钠→加38g磷酸三钠→加20g三九石酸钾钠→加400ml水
溶解→过滤→另称35gNaOH溶于100ml水中→冷至室温→缓缓地搅拌加入磷酸盐溶液中→加
入水稀释至1000ml备用。
（4）水扬酸钠溶液：称25g水杨酸钠和0.15g亚硝基铁氰化钠溶于200ml水中过滤，加水稀释
至500ml
（5）次氯酸钠溶液：吸4ml安替富民液，用水稀释至100ml
5 仪器
（1）分光光度计
（2）恒温水浴
三 紫外分光光度法
1 原理：
pro及其降解产物的芳香环基 ，在紫外区内对某一波长具有一定的光选择吸收，在280nm下，光吸收与pro浓度（3~8mg/ml）成直线关系，因此，通过测定pro溶液的吸光度，并参照事先用K氏定氮法分析的标准样品，从标准曲线查出蛋白质的含量。
2 试剂：
（1） 0.1mol/l柠檬酸水溶液。
（2）8mol/l脲[（NH2）2CO]的2NNaOH溶液。 脲的2N氢氧化钠液
（3） 95%乙醇
（4） 无水乙醚
3 仪器
（1） 751型的紫外分光光度计
（2） 离心机
4 操作方法
（1）标准曲线的绘制：准确称取样品.2.00g，置于50ml烧瓶中，加入0.1mol/l柠檬酸水溶液30ml，搅拌30分钟使其充分溶解，用四层纱布过滤于玻璃离心管中，以每秒钟3000~5000转的速度离心10分钟，分别吸出上清夜0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0ml于6个10ml容量瓶钟，每个容量瓶，8mol/l脲的氢氧化钠溶液充分摇2分钟（如果离心再次离心），取透明液于比色皿中，在280nm下测定其吸光度。（做参比值）
以事先用K氏定氮法测定的样品中蛋白质的含量微横坐标上面的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
（2）样品测定
准确称取试样1.00g→于50ml烧杯中→加0.1mol/l柠檬酸溶液30ml→搅拌10分钟→四层纱布过滤到离心管中→用8mol/L脲的NaOH溶液定容，摇匀后于280nm下测吸光度，从标准曲线上查出pro的含量。
计算： 蛋白质= C/W× 100
C----从标准曲线上查得的pro含量（mg）
W----测定样品溶液相当于样品量（mg）
说明：
a.此法运用于糕点，牛乳和可溶性pro样品，测定糕点时，应把表皮颜色去掉。
b.温度对pro水解有影响，操作温度应控制在20~30℃。
四 双缩脲法-皮尼克法
1 原理：
双缩脲在碱性条件中，能与CuSO4结合成红紫色的络合物。pro分子中含有肽链与双缩脲结构相似，也呈此反应。本法直接用于测定像小麦粉等固体试样的pro含量。但作为铜的稳定剂，酒石酸钾钠比甘油好些。小麦粉中的pro能直接地一边抽出一边进行定量。
2 试剂
⑴甘油作为稳定剂：取10ml10N KOH溶液，3.0ml甘油加到937ml水中，激烈搅拌，同时加入4%CuSO450ml。
⑵酒石酸钠作稳定剂，吸10ml10N KOH溶液和20ml25%酒石酸钾钠溶液加到930ml水中，激烈搅拌，同时加入4%CuSO4液40ml。
配制以上两种溶液、试剂，必须澄清，无氢氧化铜生成，否则重配。
3 方法：样品测定
标准曲线绘制
准确称0.6g样品→使用试剂（1）
准确称0.5g样品→使用试剂（2）
假如用试剂（2）
（1）准确称样→0.5g→于80ml离心管→加1mlClC4→混合→加50ml酒石酸钾钠稳定剂→盖上盖子离心10min（4000转/分）→放置1小时→吸混合液15ml→于20ml离心管中→离心到完全透明→取上清夜5ml于→10ml容量瓶→加水定容→于550nm处测定吸光度，从标准曲线上查出pro含量。
（2）标准曲线绘制
按样品测定方法，根据样品中pro含量，取离心澄清样液0.0 2.0 4.0 8.0 10.0ml于10ml容量瓶中→分别加水定容，按照样品测定其吸光度。
事先用K氏定氮法测定样品中pro含量为横坐标，以上述吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
4 计算：蛋白质%=C/W×100
C----从标准曲线上查得得pro含量（mg）
W----测定样液时相当于样品重量（mg）
Ⅳ 试述用凯氏定氮法测定面粉中蛋白质含量的原理，简要步骤和计算公式。
面粉与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定。
1、 样品处理：精密称取0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml液体样品（约相当氮30-40mg），移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及20毫升硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上，小火加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5小时。取下放冷，小心加20ml水，放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸同一方法做试剂空白试验。
2、 装好定氮装置，于水蒸气发生器内装水约2/3处加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。
3、 向接收瓶内加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示剂1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml样品消化液由小玻璃杯流入反应室，并以10ml水洗涤小烧杯使流入反应室内，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。将10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其缓慢流入反应室，立即将玻璃盖塞紧，并加水于小玻璃杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏，蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏5min。移动接收瓶，使冷凝管下端离开液皿，再蒸馏1min，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.01N硫酸或0.01N盐酸标准溶液定至灰色或蓝紫色为终点。 同时吸取10.0ml试剂空白消化液按3操作。
X =(（V1-V2）*N*0.014)/( m*（10/100）) *F*100% X：样品中蛋白质的百分含量，g； V1：样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml； V2：试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，ml； N：硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度； 0.014：1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数； m：样品的质量（体积），g（ml）； F：氮换算为蛋白质的系数。蛋白质中的氮含量一般为15～17.6%，按16%计算乘以6.25即为蛋白质，乳制品为6.38，面粉为5.70，玉米、高粱为6.24，花生为5.46，米为5.95，大豆及其制品为5.71，肉与肉制品为6.25，大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83，芝麻、向日葵为 5.30。
Ⅵ 凯氏定氮法测定蛋白质中氨基酸含量的主要步骤有哪些
凯氏定氮法只能检测蛋白质中氮含量，不能检测氨基酸的含量。其中蛋白质含量也只是称为粗蛋白质的含量，只是用氮的含量乘以6.25（系数）得出，不是真正的蛋白质的含量。
凯氏定氮法测氮的方法如下：
1、称取0.5～1g试样（含氮量5～80mg）准确至0.0002g，无损失地放入凯氏烧瓶中，加入硫酸铜0.9g，无水硫酸钾（或硫酸钠）15g，与试样混合均匀，再加硫酸25ml和2粒玻璃珠，在消煮炉士小心加热，待样品焦化，泡沫消失，再加强火力（360～410℃）直至溶液澄清后，再加热消化15min。
2、氨的蒸馏
（1）常量直接茂馏法 将上述的试样消煮液冷却，加蒸馏水200ml，摇匀，冷却。沿瓶壁小心加入40％氢氧化钠溶液100ml，立即与蒸馏装置相连．蒸馏装置冷凝管的末端应浸入50ml硼酸吸收液lcm。加混合指示剂2滴，轻摇凯氏烧瓶，使溶液混匀，加热蒸馏，直至馏出液体积约150ml。先将吸收液取下，再停止加热。
（2）半微量水蒸汽蒸馏法 上述试样的消煮液冷却，加蒸馏水20m1转入100ml容量瓶，冷却后用水稀释至刻度，摇匀，为试样分解液。取2％硼酸溶液20ml，加混合指示剂2滴，使半微量蕉馏装置的冷凝管末端浸入此溶液；蒸馏装置的蒸汽发生器的水中应加甲基红指示剂数滴，硫酸数滴，且保持此液为橙红色，否则应补加少许硫酸。准确移取试样分解液10～20ml注入蒸馏装置的反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加10ml40％氢氧化钠溶液，小心提起玻璃塞使之流入反应室，将玻璃塞塞好，并在入口处加水封密好，防止漏气，蒸馏4min，使冷凝管末端离开吸收液面，用蒸馏水洗冷凝管末端，洗液均流入吸收液。
3、滴定 用硼酸吸收氨后，立即用0.05mol/L的HCI标准溶液滴定，仍以甲基红或混合甲基红为指示剂。
在测定样本中含氮量的同时，应做一空白对照测定，即各种试剂的用量及操作步骤完全相同，但不加样本，这样可以校正因药品不纯所发生的误差，吸收氨后的吸收液立即用0.05mol/L盐酸标准溶液滴定，溶液由蓝绿色变为灰红色为终点。
4、空白测定 称取蔗糖0.0lg，以代替试样，按上述测定步骤进行空白测定，消耗0.05mol/L盐酸标准溶液的体积应不得超过0.3ml。
5、计算
N%*6.25=粗蛋白质（%）=（V2-V1）*0.014*6.25*100/m*（V’/ V）
每m1的lmol/L盐酸标准溶液相当于0.0140g的N。因此，
式中：v2—试样滴定时所需酸标准溶液的体积（m1）；
v1—空白滴定时所需酸标准溶液的体积(m1)；
c—盐酸标准溶液的浓度(mol/L)；
m一试样的质量（g）；
v —试样的分解液总体积（ml）；
v’—试样分解液蒸馏用体积（m1）；
0.0140—每ml HCl标准溶液相当于N的克数；
6.25一氮换算成蛋白质的平均系数。
每个试样取两个平行样进行测定，以其算术平均值为结果。 当粗蛋质含量在25％以。上，允许相对偏差为1％；当粗蛋白质含量在l0％～25％时，允许相对偏差为2％；当粗蛋白质含量在10％以下时，允许相对偏差为3％。
Ⅶ 凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量的原理和基本操作方法是什么
原理：有机含氮化合物与浓硫酸共热消化，氮转化为氨，再与硫酸结合成硫酸铵。硫酸铵与强碱反应，放出氨。将氨蒸馏到过量的标准无机溶液中，再用标准碱溶液进行滴定。根据测得的氨量，计算样品的总氮量。
、试剂与材料：
浓硫酸、硫酸钾-硫酸铜粉末(称取80g硫酸钾和20g硫酸铜(五水)，0.3g二氧化硒研细混合)、30%氢氧化钠溶液、2%硼酸溶液、0.01M标准盐酸、混合指示剂(田氏指示剂)储存液(取50ml0.1%甲烯蓝乙醇溶液与200ml0.1%甲基红溶液混合，储存于棕色瓶中备用。此指示剂在PH5.2为紫色;PH为5.4为暗灰色或灰色;PH5.6为绿色;变色点为PH5.4)、硼酸-田氏指示剂混合液(100ml2%硼酸溶液，滴加约1ml田氏指示剂，摇匀后，溶液呈紫红色)、蛋白质样品、容量瓶、吸管、凯氏烧瓶、凯氏定氮蒸馏装置、微量滴定管、电炉
三、操作方法
1、样品处理：固体样品，应在105℃干燥至恒重。液体样品可直接吸取一定量，也可经适当稀释后，吸取一定量进行测定，使每一样品的含氮量在0.2-1.0mg范围内。
2、消化：取一定量样品，于50ml干燥的凯氏烧瓶内。加入300mg硫酸钾-硫酸铜混合粉末，再加入3ml浓硫酸。用电炉加热，在通风厨中消化，瓶口加一小漏斗。先以文火加热，避免泡沫飞溅，不能让泡沫上升到瓶颈，待泡沫停止发生后，加强火保持瓶内液体沸腾。时常转动烧瓶使样品全部消化完全，直至消化液清澈透明。
另取凯氏瓶一个，不加样品，其它操作相同，作为空白试验，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质，以对样品进行校正。
3、蒸馏：将微量凯氏蒸馏装置洗涤(先用水蒸气洗涤)干净。将凯氏烧瓶中的消化液冷却后，全部转入100ml的容量瓶，用蒸馏水定容至刻度。
吸取20ml稀释消化液，置于蒸馏装置的反应室中，加入10ml30%氢氧化钠溶液，将玻璃塞塞紧，于漏斗中加一些蒸馏水，作为水封。
取一三角瓶，加入10ml硼酸-田氏指示剂混合液，置于冷凝管之下口，冷凝管口应浸没在硼酸液面之下，以保证氨的吸收。
加热水蒸汽发生器，沸腾后，夹紧夹子，凯氏蒸馏。三角瓶中的硼酸-指示剂混合液，吸收蒸馏出的氨，由紫红色变为绿色。蒸馏15min，让硼酸液面离开冷凝管口，再蒸1-2min以冲洗冷凝管口。空白试验按同样操作进行。
4、滴定：样品和空白均蒸馏完毕后，用0.01M标准盐酸滴定，至硼酸-指示剂混合液由绿色变回淡紫色，即为滴定终点。
四、计算 样品总氮量(mg)=(A-B)×c×14×100/20
式中：A：样品滴定时消耗的标准盐酸体积 B：空白滴定时消耗的盐酸体积 C：标准盐酸的当量浓度 14：氮的相对分子量 20：用于蒸馏的稀释消化液体积 100：稀释消化液的体积
样品中粗蛋白含量(mg)=样品总氮量(mg)×6.25
Ⅷ 凯氏定氮法测定蛋白质，蒸馏液加入过量的氢氧化钠后呈色
绿色
因为所用混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。
Ⅸ 蛋白质测定中，定氮蒸馏时，水蒸气发生器中的水为什么保持酸性
水中也含有氮元素，为防止水中的氮元素随水蒸汽挥发出来，可以加硫酸使之生成硫酸铵留在水中