強陽離子交換柱基線不穩

1. 2. 蛋白質組學樣品前處理（3）

說明：此篇筆記系2016-2017年由克里克學院與康昱盛主辦的蛋白質組學網路大課堂整理而成，侵刪。該課程由復旦大學生物醫學研究院（IBS）的劉曉慧博士所授。

我們通過上一篇筆記里介紹的各種方法把蛋白質提取出來以後，這事兒還沒完，因為我們需要對提取出來的蛋白進行一下質控，以確認是否成功提取出了足夠的蛋白，是否有污染等。

如上圖，質量控制分兩個部分：

含量測定 ：檢測是否有充足的蛋白被提取出。注意上圖里提到的不兼容問題，如果你樣品里加過SDS，就不要用Bradford法來測定蛋白濃度，而可以選用BCA方法；反之，如果你樣品里加入了還原劑，就不要用BCA方法來測定蛋白，可以選用Bradford法。

SDS-PAGE ：檢測蛋白的提取效率，以及是否有污染。比如我們上了50個樣，能看到的條帶卻很少，說明定量不準確。如果想從幾組樣品中尋找差異蛋白，特別需要做一次SDS-PAGE檢測同類樣品蛋白的提取效率。

以上圖為例，0號樣品中間的條帶不見了，可能是提取蛋白不充分引起的差異，也可能是樣品本身的差異。我們可以重新提取一次，先排除是否是提取造成的差異；如果是樣品本身的差異，建議用label free的方法，每個樣品單獨做定量，而不要用iTRAQ或TMT標記定量，否則會因為中間這個高豐度蛋白的影響，而導致定量不準。

我們再看來幾種常見的問題，以及解決方法，如下圖：

情況1：提取出來的結果差異很大。這種情況需要重新提取，以檢測到底是提取不充分造成的差異，還是樣品本身的差異；

情況2：左邊是分子量marker,右邊是實際樣品，可以看到實際樣品的條帶很少，可能是提取不充分，需要重設提取參數，使用更劇烈的條件，更長的時間，重新提取；

情況3：橫紋、縱紋比較多，很可能是核酸或脂蛋白的影響，這種情況需要進行脫鹽處理，也就是利用脫鹽柱與肽段結合，而與其它物質不結合，從而達到去除污染的目的。

情況4：兩個條帶很類似，但一條明顯比另一條淡。可能造成這種情況的原因有哪些呢？第一種情況，由於這是同樣類型的樣品，比如都是小鼠肌肉組織，一個樣品的蛋白質抽提充分，而另外一個樣品蛋白抽提不充分，就會導致兩條帶不一樣，這種情況下需要重新抽提。還有一種可能，考慮到是等量上樣跑的SDS-PAGE，如果兩個條帶顯示出的蛋白含量差別很大，則可能因為參考的含量測定結果不準確引起的，這時候需要重新定量。

蛋白提取後，還需要做脫鹽處理，我們來看看可以用哪些方法實現。

超濾： 可以截留10kDa及以上的蛋白分子，適用於體積較小的樣品。操作步驟可以是，從100μL超濾濃縮到40μL，再加緩沖液至100μL，再超濾到40μL，反復幾次。事實上，超濾是很難把污染（比如SDS）完全去掉的，最終仍然會有極少量的污染物存在，但當這些污染物的濃度降到一定程度時，則樣品的純凈度我們認為是可以接受的了。

透析 ：也是可以截留10kDa及以上的蛋白分子，適用於體積比較大的樣品，比如尿液，可以將鹽透析至外面的透析液里。

丙醇沉澱 ：-20℃丙酮（V _樣品 ：V _冷丙酮 =1：3以上）沉澱2個小時以上。

C18色譜柱脫鹽法 ：Waters公司生產的XBridge C18色譜柱，利用柱子上的填料與蛋白結合，而鹽類物質則流穿過去，從而達到分離的目的。

脫鹽完成以後，接下來我們就要進行相當重要的一步：還原烷基化及酶解。整個流程，大夥兒看下面這張圖：

這裡面有兩件事要先跟大夥兒聊聊。

首先，我們來說說為什麼步驟里要把丙酮沉澱放在烷基化以後。通過之前的學習，我們知道丙酮可以溶解樣品的去污劑、還原劑等，而蛋白是不會在丙酮中溶解的，而是會沉澱下來，這樣就達到了去除雜質的目的。

烷基化以後，球狀蛋白變成鏈狀，再通過丙酮沉澱去掉尿素或SDS等污染物，然後復溶（即重新溶解，以備下一步酶解操作），那麼鏈狀的蛋白比球狀蛋白的復溶效果會更好，可以避免因為復溶不充分而造成的損失。因此，丙酮沉澱要放在烷基化之後再做。

另外，關於酶切這一步，有些抗體如果只用胰酶進行酶切，由於酶切位點太少，導致切出來的肽段太長，不便於質譜檢測。這種情況下可以結合其它酶，比如Lys-C，進行多酶酶切，使肽段變得短一些。經過測試我們發現，用Lys-C+胰酶酶切，比只用胰酶酶切，可以提高10%-20%的鑒定率。

酶解需要在buffer體系下完成，比如25mM碳酸氫銨體系（易揮發，pH 7-8）最為常用，或者也可以使用TEAB（ triethyl ammonium bicarbonate，三乙基二乙胺鹽，10-100mM）。

酶的用量可以參考以下的公式：

W（酶）：W（底物）=1:20 – 1:50

此外，需要注意的是胰酶酶解的兼容性問題。胰酶只能耐受最多1M的尿素，且不能與SDS同時使用。

前面提過，質譜儀是一種離子飽和性儀器，高豐度蛋白的存在會對低豐度蛋白的信號產生抑制，並且質譜儀反應也需要一定的時間。例如，人的細胞內通常會表達20300種蛋白，它們酶解後，每種蛋白會產生10-20種肽段，那麼就有幾十萬種肽段，質譜很難同時檢測到這么多種肽段。所以對肽段混合物進行分級，可以降低檢測的難度，得到更多的肽段/蛋白鑒定結果。

我們既可以從蛋白水平進行分離，也可以從肽段水平進行分離，還可以將多種分離手段結合起來。從蛋白水平的分離，大家都比較熟悉吧？通常我們用SDS-PAGE或IEF等技術，利用蛋白質的分子量、形狀、等電點等理化性質的不同，將混合在一起的蛋白質分開。

第二種分離方案是在肽段水平上進行，根據肽段的不同性質，使用不同填料進行分離。

SCX（Strong Cation Exchange）：是以硅膠為基質的強陽離子交換柱，可以與陽離子結合，並通過buffer進行離子交換，將陽離子分離和洗脫出來，達到與其它不帶陽離子的肽段分離的目的。

SAX（Strong Anion Exchange）：硅膠鍵合季銨基團的強陰離子交換柱，可以與陰離子結合，並通過buffer進行離子交換，將陰離子分離和洗脫出來，達到與其它不帶陰離子的肽段分離的目的。

RPLC（Reverse Phase Liquid Chromatography）：反相液相色譜柱，與正相柱在表面鍵合極性官能團不同，反相柱的表面鍵合的是非極性的官能團，例如，鍵合十八烷基官能團，稱為C18柱，其它常用的還有C8，C4和C2等。這里我們選用C18柱，根據肽段疏水性的不同，達到分離的目的。

HILIC（Hydrophilic interaction liquid chromatography ）：親水色譜柱可以用來分離極性化合物。由於強極性肽段在反相色譜柱中保留情況都比較差，很難將它們分開，而親水色譜柱卻可以用來固定強極性的肽段，並結合高比例有機相與低比例水相組成的流動相，來實現分離的目的，且這樣的流動相組成尤其有利於提高電噴霧離子化質譜（ESI-MS）的靈敏度。

High pH - Low pH RPLC：用pH10的液相條件，結合pH2的RPLC酸性條件，進行分離。

多維分離：例如，先從蛋白水平進行分離，再從肽段水平進行分離，或者多種肽段水平的分級分離結合起來使用。接下來我們重點聊一下各種多維分離的策略和效果。

我們先來看看上面這張圖。左上角的「A圖「展示的是通過High pH - Low pH RPLC將樣品分成了40個餾分，然後進行叉開的合並，合並為20個餾分，這樣的合並可以讓樣品中的肽段分布更加均勻。

右上角的」B圖」展示的是通過SDS-PAGE進行分離，也分成20個餾分，然後用兩種合並方案，分別合並為5個餾分和6個餾分，這樣做的目的也是為了讓樣品的肽段分布更加均勻。

左下角的「C圖」針對同一種樣品，對High/Low pH RPLC和SDS-PAGE兩種分離策略進行了比較，發現經過兩種分離方法後，有5408個蛋白是都可以鑒定到的，另外有1951種蛋白是只在High/Low pH RPLC分離策略中鑒定到的，而用SDS-PAGE分離，則可以鑒定到其它389種蛋白。從這個圖上看，兩種方法有互補性。

右下角的四幅小圖說明，當我們在做分級分離時，分的級別越多，能鑒定到的蛋白也就越多。不過這種增長並不是呈線性關系的，分級的級數達到一定程度時，能鑒定到的蛋白數量的增長就會飽和。所以比較省時省力又能保證效果的做法時，選擇一個合適的分級數即可。

我們來看一下目前發表的文獻里，利用多級分離所能鑒定到的蛋白數量。

就像前面說到的，對蛋白及多肽分離的級數越多，能鑒定到的蛋白也就越多，但常常因為機時的限制，再加上這種變化趨勢到一定程度總會飽和，所以我們通常有個權衡。比如常規的分10個餾分，基本上可以鑒定到5000-8000個蛋白。如果是血清樣品，可以餾分更多一些，尤其是RPLC一維，如果分到40或60個餾分，再合並為10或20個餾分，比直接分成10個或20個餾分能鑒定到的蛋白要多30%左右！

樣品前處理的各個步驟就介紹到這，下篇將繼續分享樣品前處理的最新方法與進展

2. 氣相色譜基線問題

你的問題可能有兩方面的原因。一個是你每次樣品分析完之後，色譜柱內的化合物沒有吹掃干凈，或者你沒有老化好色譜柱所致，所以每次開機後色譜柱中流出上一次分析殘留的物質，導致基線雜峰很笑裂多。另一個是你的載氣有問題，老化色譜柱對色譜柱本身產生傷害，從而導致每山散次老化後色譜柱基線不穩，不老化還好，一老化就出問題，因為老化的溫度較高。關於色譜問題建逗升氏議你到「生化色譜網」去看看，那裡非常專業。

3. 氣相色譜為什麼溫度升高就基線不穩,降低溫度基線就好了、

不知道你的譜圖是什麼樣子的？能否把你的所謂的基線有鋸齒狀的譜圖拆斗宴傳上來看看。一般情況下程序升溫都會有基線的波動。但是如果波動很大的話，尤其是在升溫的時候這種鋸齒狀的基線出現銷卜就會要看看你的檢測器是否玷污了，柱子也可能污染了旅銀。從你的情況我推測原因是上面的。有時候電路線頭接觸不良也導致基線的波動，載氣的不幹凈也會導致這種現象的發生。

4. 使用高效液相色譜儀時，監視器的基線不平是什麼原因導致的

使用高效液相色譜儀時，監視器的基線不平的原因包括：未平衡，梯度，柱內滯留雜質出峰。

儀器本身的電雜訊，儀器無法屏蔽產品的外部信號的干擾信號，工作站軟體的信號線連接時接觸非儀器方面的輸入信號，都會引起基線的規則性波動和突發性波動；這種不穩定一般可以通過基線信號的規律判斷出來的。

色譜柱

應按各品種項下的規定，常用的色譜柱填料有硅膠和化學鍵合硅膠。後者以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用辛基鍵合硅膠次之，氰基或氨基鍵合硅膠也有使用；離子交換填料用於離子交換色譜；凝膠或玻璃微球等，用於分子排阻色譜等。注樣量一般為數微升。流動相與固定相之間應互不相溶，有一個明顯的分界面。當試樣進入色譜柱，溶質在兩相間進行分配。

以上內容參考：網路-高效液相色譜

5. 磺酸基陽離子交換柱的磺酸基陽離子交換柱產品

Venusil SCX HPLC Columns強陽離子交換柱
粒徑5um 孔徑300A 比表面積50m2/g
強陽離子交換柱：以超純硅膠為基質，表面鍵合有芳內香族磺酸基團。容300A，5um；比表面積50m2/g。可用於分離鹼性、水溶性化合物和生物分子。中國葯典2005版中，鹽酸二甲雙胍的有關物質測定方法即使用磺酸基陽離子交換（SCX）色譜柱。
Venusil SCX HPLC Columns 4.6*100mm/5um
Venusil SCX HPLC Columns 4.6*150mm/5um
Venusil SCX HPLC Columns 4.6*250mm/5um
三聚氰胺VSc 958505-m Venusil scx4.6*250mm/5um
（建議配保護柱卡套使用壽命更長）

6. 哪些化合物適用於強陽離子交換色譜哪些適用於強陰離子交換色譜

強陽離子交換色譜和強陰離子交換色譜是兩種常用的分離和純化化合物的技術。

強陽離子交換色譜是一種用於分離和純化有機陽離子的技術。它通常用於分離和純化含有有機陽離子的化合物，例如鹼性氨基酸、氨基苯甲酸等。

強陰離子交換色譜是一種用於分離和純化有機陰離子的技喊衫術燃塌。它通常用於分離和純化含有有機陰離子的化合物，例如羧基苯甲酸、磺基苯甲酸等。
注意，不同的化合物可能同時鄭段腔含有有機陽離子和有機陰離子。在這種情況下，可以使用其他技術來分離和純化這些化合物，例如層析色譜、靜電場色譜等。

另外，還有一些化合物沒有明顯的有機陽離子或有機陰離子，例如烷基苯甲酸等。這些化合物通常不適用於強陽離子交換色譜或強陰離子交換色譜。

7. 離子色譜基線走不穩的原因

造成基線漂移的原因有很多種：環境、溫度、電壓等變化都會引起基線的變化，而基線的變化直接影響樣品結果的准確性，往往微小的漂移都會造成樣品數值較大的偏差。

離子色譜的分離機理主要是離子交換，有3種分離方式，它們是高效離子交換色譜（HPIC）、離子排斥色譜和離子對色譜。

用於3種分離方式的柱填料的樹脂骨架基本都是苯乙烯-二乙烯基苯的共聚物，但樹脂的離子交換功能基和容量各不相同。

(7)強陽離子交換柱基線不穩擴展閱讀：

高效離子交換色譜，應用離子交換的原理，採用低交換容量的離子交換樹脂來分離離子，這在離子色譜中應用最廣泛，其主要填料類型為有機離子交換樹脂；

以苯乙烯二乙烯苯共聚體為骨架，在苯環上引入磺酸基，形成強酸型陽離子交換樹脂，引入叔胺基而成季胺型強鹼性陰離子交換樹脂；

此交換樹脂具有大孔或薄殼型或多孔表面層型的物理結構，以便於快速達到交換平衡，離子交換樹脂耐酸鹼可在任何pH范圍內使用，易再生處理、使用壽命長，缺點是機械強度差、易溶易脹、受有機物污染。

8. 氣相色譜中柱補償是什麼意思

這個術語一般是用在熱導檢測器中的。
也就是你如果不是單池熱導猛渣核，需要平衡氣。有時也叫做柱補償。

另外一種情況是，色譜柱基線不穩而產生的術語，解釋起來比較梁含復雜。枝掘

9. 在高效液相色譜分析中，如果基線不穩定，是什麼原因引起的

高效液相色譜儀分析中的基線不穩定的原因一般是硬體引起的可以從兩個大方向去判斷：

1、產品質量方面的故障：儀器本身的電雜訊，儀器無法屏蔽產品的外部信號的干擾信號，工作站軟體的信號線連接時接觸非儀器方面的輸入信號，都會引起基線的規則性波動和突發性波動；這種不穩定一般可以通過基線信號的規律判斷出來的；

2、使用和維護范圍內的基線不穩定：流動相流路中有氣泡會引起規律性的小波動；色譜柱污染則會導致基線大幅度的波動和各種不規則的出峰，檢測器污染也會導致基線的不穩定1、柱溫波動。（即使是很小的溫度變化 都會引起基線的波動。通常影響示差檢測 器、電導檢測器、較低靈敏度的紫外檢測 器或其它光電類檢測器。） 1、控制好柱 子和流動相的溫度，在檢測器之前使用熱 交換器圖 2、流動相不均勻。（流動相條件變化引 起的基線漂移大於溫度導致的漂移。） 2 、使用HPLC級的溶劑，高純度的鹽和添 加劑。流動相在使用前進行脫氣，使用中 使用氦氣。 3、流通池被污染或有氣體 3、用甲醇或 其他強極性溶劑沖洗流通池。如有需要， 可以用1N的硝酸。（不要用鹽酸） 4、檢測器出口阻塞。（高壓造成流通池 窗口破裂，產生噪音基線） 4、取出阻塞 物或更換管子。參考檢測器手冊更換流通 池窗。 5、流動相配比不當或流速變化 5、更改 配比或流速。為避免這個問題可定期檢查 流動相組成及流速。 6、柱平衡慢，特別是流動相發生變化時 6、用中等強度的溶劑進行沖洗，更改流 動相時，在分析前用10-20倍體積的新流 動相對柱子進行沖洗。 7、流動相污染、變質或由低品質溶劑配 成 7、檢查流動相的組成。使用高品質的 化學試劑及HPLC級的溶劑 8、樣品中有強保留的物質（高K 值）以 饅頭峰樣被洗脫出，從而表現出一個逐步 升高的基線。 8、使用保護柱，如有必要 ，在進樣之間或在分析過程中，定期用強 溶劑沖洗柱子。 9、使用循環溶劑，但檢測器未調整。 9 、重新設定基線。當檢測器動力學范圍發 生變化時，使用新的流動相。 10、檢測器沒有設定在最大吸收波長處，將波長調整至最大吸收波長處

10. 強陽離子交換和弱陽離子交換的區別

這是包含關系。質子交換膜是陽離子交換膜中的一種。陽離子交換膜可能透過除了質子的其他陽離子