外泌體超濾離心網

Ⅰ 細胞外泌體是什麼

外泌體——是一類有細胞釋放的細胞外囊泡。外泌體的特點見正文。

細胞外囊泡——簡稱EV，是由細胞釋放的各種具有膜結構的囊泡結構統稱，這些囊泡的直徑可以從30、40nm到8、9um。細胞外囊泡有不同的亞群，而目前研究最火熱的是外泌體這個亞群。

然而由於目前很難純化到非常純的外泌體亞群，人們純化到的通常是直徑小於200nm的囊泡，因此越來越多的人開始稱之為sEV（即 small extracellular vesicle，小細胞外囊泡）。為了嚴謹，所以今天我們也以細胞外囊泡來稱呼這些膜泡結構。本文中沒有特殊說明的情況下，細胞外囊泡主要指外泌體和微囊泡。

今天主要介紹內容包括細胞外囊泡的研究意義、細胞外囊泡的分類、細胞外囊泡含有的成分、細胞培養上清的制備、細胞外囊泡的保存、細胞外囊泡的鑒定實驗要求。所有內容都參考目前已發表的綜述，並非hzangs杜撰。所以請新朋友們放心學習。

細胞外囊泡的研究意義
目前，細胞外囊泡的功能還沒有完全闡明。已有的報道認為它們能夠調節宿主-病原體的相互作用，參與傳染性和炎性疾、神經疾病和癌症等很多種疾病的病理過程，同時在正常的生理過程中也發揮著介導細胞間通訊的重要功能，已有文章報道細胞外囊泡在發育中也發揮著重要作用。細胞外囊泡在臨床醫學中也有十分光明的應用前景，主要是因為它們含有豐富的生物標志物，可用於監測臨床狀態，治療反應，疾病進展等，同時由於它們具有遞送生物分子的功能，因此它們還有發展成臨床葯物遞送載體的潛力。

細胞外囊泡的分類
細胞外囊泡—這個詞是由國際細胞外囊泡學會（ISEV）創造的術語，根據細胞外囊泡的生物合成或釋放途徑可以對囊泡進行分類：外泌體（exosomes）直徑為30-150nm，起源於內吞途徑，其密度約為1.11-1.19g mL-1；微粒/微囊泡（microparticles/microvesicles）直接從質膜釋放，直徑約100-1000nm；凋亡小體（apoptotic body/bleb）直徑約為50nm-2μm，由細胞凋亡產生；腫瘤小泡（large oncosomes）直徑約1-10μm，由腫瘤細胞釋放產生；以及其他各種EV亞群。由於不同EV亞群的大小以及它們的所包含的生物分子存在差異，因此現在已經有幾個小組開始表徵EV亞群的組成。最近的論文聲稱，基於一般表面蛋白質組學分析或個別EV群體的轉錄譜，對細胞外囊泡進行了成功的亞群分類。目前可以通過差速離心、過濾、免疫親和、層析、流式細胞分選、密度梯度離心選取不同密度區域等多種手段大致分離不同的細胞外囊泡亞群，但是這些方法都不能完全純化到特定的亞群，分離到的通常是富集了某一個亞群同時帶有其他細胞外囊泡亞群。

細胞外囊泡含有的成分
細胞外囊泡的組成成分並不是隨機的，每一個細胞外囊泡都會攜帶特定的分子信息。 實際上，這些納米尺寸的細胞外囊泡能夠攜帶蛋白質，脂質，核酸和糖等生物活性分子在細胞間傳遞信號，並且其包裝的獨特分子構成決定了要傳遞給受體細胞的細胞外信號的類型。有一個復雜的分選系統來決定那些分子能夠進入細胞外囊泡。

細胞培養上清的制備
目前有兩個策略來制備細胞培養上清用於提取細胞外囊泡。使用去除細胞外囊泡的胎牛血清（FBS）培養基培養細胞和使用不含FBS的培養基培養細胞（血清飢餓細胞）。但是目前一些高水平的文章報道使用的方法通常是前者。另外，有些文章開始關注去除細胞外囊泡的胎牛血清中游離RNA對實驗結果的影響，但是目前並沒有形成共識。如果需要先儲存培養上清，一定量後再用於細胞外囊泡分離，那需要預先去除體系中的死細胞和細胞碎片。

細胞外囊泡的保存
Lőrincz等人曾對中性粒細胞來源的細胞外囊泡做了不同條件的儲存，之後再去分析這些囊泡的特性，他們發現雖然細胞外囊泡樣品中囊泡數量和形態沒有明顯變化，但即使是儲存在-20或-80攝氏度情況下的細胞外囊泡也存在磷酯醯絲氨酸外翻明顯增多的情況；但他們同時也發現，尿液來源的細胞外囊泡並沒有這些變化。Kalra等人分離了來自結直腸癌細胞的細胞外囊泡，不同條件保存一定時間後進行PKH67染色跟蹤細胞外囊泡的攝取，分析發現這些囊泡依舊可以被細胞攝取。就目前的情況，學者們並未就儲存條件對細胞外囊泡是否有影響達成共識。因此建議大家實驗時分離細胞外囊泡後盡快用於實驗，盡量減少儲存過程。

細胞外囊泡的鑒定及實驗要求
根據國際細胞外囊泡協會於2014年發表的一個指導手冊（MISEV），鑒定外泌體首先需要通過WB來鑒定細胞外囊泡的標志蛋白是否存在於樣品中，通過電子顯微鏡來觀察樣品中細胞外囊泡的形態特徵，通過NTA等手段來分析樣品中細胞外囊泡的群體特徵（粒子濃度、直徑分布等）。

今天就先介紹到這里。細胞外囊泡領域作為生物學研究中的一個新興領域越來越受到學者和生物公司的關注，也有越來越多的研究報道出現。但是我們也要清楚的認識到該領域的研究技術依舊不完善，對細胞外囊泡的認識依舊不充分，細胞外囊泡研究依舊處於一個起始階段，要走的路還很長。

Ⅱ 外泌體提取策略

外泌體即細胞外囊泡（簡孫納卜稱EVs）是所有細胞主動分泌的納米級囊泡,活細胞釋放不同類型的細胞外囊泡進入細胞外環境進行細胞間交流,細胞外囊泡越來越多地被認為是有希望的液體活檢生物學標志物｡根據相似囊泡的直徑大小可將細胞外囊泡分為三類,直徑在50-150nm的外泌體,直徑在100-1000nm的微囊泡､外粒體和微顆粒,直徑在-100-5000nm的凋亡小體｡目前主要認為,外泌體產生的過程是細胞膜內陷形成內體,再形成多泡體,多泡體與質膜融合導致其管腔內囊泡釋放到細胞外,產生一種稱為外泌體的EV亞型｡

2 外泌體的提取純化方法

2.1 基於密度的分離方法

2.1.1 超速離心法

超速離心法是最常用的外泌體提取方法,首先,施加較低速度的離心力300g以從細胞培養液中去除細胞;然後,對上清液施加較大的離心力(10000-20000g),去除大的細胞碎片和破碎的細胞器;最後,再次進行高速(100000-150000g)離心從 上清液 中收集外泌體,所有離心在4℃下進行｡超速離心法獲得的外泌體不被分離試劑污染,且分離數量多,處理樣本小｡盡管超速離心法是提取外泌體最廣泛的「金標准」,但仍然有很多缺點,如所需的超高速離心儀器比較昂貴､樣品量大､耗時長､電鏡觀察外泌體時仍存在蛋白質污染｡

2.1.2 蔗糖密度梯度離心法

目前已發現,外泌體在蔗糖梯度為1.15-1.19g/mL密度中漂浮,所以根據這個特性,可以將樣品與蔗糖梯度溶液一起超速離心,外泌體沉降到不同的密度區域就可以將其區分出來｡蔗糖密度梯度離心法需要預先配好連續梯度濃度的蔗糖溶液,將蔗糖溶液鋪於離心管底部,再將樣本放於上部,4℃下100000g超速離心｡蔗糖密度梯度離心法獲得的外泌體純度較高,但是前期准備復雜,耗時長,又不能完全將外泌體與蛋白質分離開｡2013年10月ISEV會議一些研究人員表示,通過蔗糖密度梯度離心法分離囊泡時,細胞囊泡的生物功能喪失｡

2.2 沉澱法

2.2.1  聚乙二醇 (PEG)

PEG 是一種水溶性非離子化合物,具有極強的親水性,可以與疏水的脂質雙分子層結合,從而改變外泌體的溶解度而使外泌體沉澱｡RIDER等研究發現,PEG水平會影響外泌體的產率,且從外泌體中獲得的總蛋白和RNA在數量和質量上足以用於蛋白質組學和測序分析｡沉澱法操作簡單,不需要特殊設備,更經濟,外泌體產量高,但是會沉澱一些非外泌體的疏水性物質而導致外泌體純度不夠｡

2.2.2 試劑盒法

最近已經開發出基於聚合物共沉澱的試劑盒,如ExoQuick､TEI等,可用於提取多種體液中的外泌體｡聚合物沉澱劑ExoQuick與樣品4℃共孵育30min,然後室溫1500g離心30min,即可獲得外泌體沉澱｡與超速離心法比較,試劑盒法更簡便､耗時短,且能獲得更高的外泌體產量｡試劑盒法獲得外泌體沉澱含有的雜質較多,不同來源的樣本需要使用不同的試劑盒來進行提取,且試劑盒價格較貴｡

2.3 基於大小的分離方法

2.3.1 SEC SEC

主要根據外泌體的大小對外泌體進行分離和純化｡樣品中大分子物質不能進入凝膠孔而被流動相快速洗脫出來,尺寸小於孔徑的物質可進入多孔材料,需要較長時間被洗脫出來,即可通過不同的洗脫時間分離外泌體｡BING等證明了瓊脂糖凝膠可以從無血小板上清液中純化出外泌體,通過這種方法茄吵,外泌體很容易從蛋白質和高密度脂蛋白中分離出來｡HONG等通過改編和使用mini-SEC方法能夠有效分離出外泌體,與漫長而復雜的超速離心法不同,它可在30min內完成外泌體分離｡通過SEC分離的外泌體純度較高,分離出結構上完整且功能活躍的囊泡是基於微型SEC分離的重要優勢,但數量較少,而且需要特殊設備,故應用不廣泛｡

2.3.2超濾法

超濾法是根據外泌體的大小使用相應孔徑的濾膜,將樣品中小分子物質過濾到膜的另一側,而將大分子物質滯留在膜上來達到分離的目的｡超慮法簡單､省時､成本低｡LIU等改則穗良了簡單的超濾法,通過將不同孔徑的膜(200､100､80､50､30nm)串聯在一起,實現了不同大小外泌體的快速分離,且捕獲效率明顯高於超速離心法｡然而,過濾器很容易被囊泡和其他大分子物質堵塞,這種情況很容易導致膜壓力過大而破碎｡

2.4 基於表面成分親和力的分離法

2.4.1 蛋白質

外泌體表面含有豐富的蛋白質,所以基於其表面成分的親和力特別適合於分離外泌體｡CD63是外泌體中發現的最豐富的蛋白質之一,因此,常用抗CD63免疫吸附外泌體｡ZHAO等通過使用抗CD63包裹的磁珠與血液樣品不斷混合,將外泌體捕獲到磁珠上後,加 緩沖液 沖洗5min,然後引入3種不同熒光染料標記的抗體[抗CD24､抗上皮細胞黏附分子(抗EpCAM)､抗糖類抗原-125(抗CA-125)],通過觀察不同熒光強度可以量化卵巢癌中不同腫瘤標志物的表達水平｡

2.4.2 膜磷脂

雖然大部分基於表面成分的親和方法是基於外泌體表面的蛋白質,但是脂質雙層也是一種很好的檢測目標｡XU等利用外泌體膜上表達的磷脂醯 絲氨酸 (PS)可以被PS結合受體Tim4很好地結合,用Tim4固定化的磁珠與樣品反應進行外泌體捕獲,並且觀察到洗脫的外泌體保持著完整的形態,與商業外泌體提取試劑盒相比,表現出更高的捕獲率｡CHEN等利用外泌體將帶負電荷的PS暴露在膜上的特點,使用帶正電荷基團的離子交換樹脂的磁珠與血漿樣品反應,血漿中的外泌體就能與磁珠結合,通過這種方法分離的外泌體具有比超速離心法更高的回收率和更少的雜質蛋白｡

2.5   ACE分離法

ACE微陣列產生的介電泳(DEP)分離力是通過施加交流電場產生的,納米級的粒子和其他納米級實體物質被吸引到圓形微電極邊緣周圍的DEP高場區域,細胞和大的實體物質被吸引到DEP低場區域｡ IBS EN等的ACE裝置需要30-50μL血漿樣品就能夠在15min內將外泌體濃縮到微電極周圍的高場區域｡ACE設備流程明顯快於目前使用的方法,這個裝置簡化了外泌體提取和回收過程的能力,明顯減少了加工步驟和消耗時間｡CHEN等構建了具有交叉電極的DEP晶元,能在30min內從血漿樣品中分離出外泌體｡經過測試證明,DEP晶元具有高捕獲率和高回收率,需要的時間更短,並且不需要笨重和貴重的儀器｡

2.6 微流控晶元法

微流控晶元法是新開發出來的用於快速高效分離樣品中外泌體的方法｡WOO等使用2個納米過濾器(Exodisc)集成的實驗盤在30min內實現了20-600nm外泌體的全自動富集｡使用納米粒子跟蹤分析定量檢測證實了細胞培養上清液中外泌體的回收率大於95%｡與超速離心法相比,Exodisc提供了高出100倍的mRNA水平,更省時,所需樣本量更少｡FANG等開發了一種微流體晶元,將包裹了抗CD63的磁珠與血漿樣品通入晶元,在第1個腔室中捕獲到外泌體,通入一抗與磁珠-外泌體混合物結合,再通入熒游標記的二抗形成磁珠-外泌體-一抗-二抗混合物聚集在第2個腔室｡微流控晶元法操作簡單,捕獲率高,特別適合於生物學研究｡外泌體作為癌症診斷的有前景的生物學標志物,其在癌症的液體 活檢 中受到關注｡外泌體的生物學價值和臨床應用價值凸顯了開發有效提取和分離外泌體技術的重要性和必要性｡相信隨著技術的不斷進步和創新,外泌體提取將變得更加簡便經濟,純度越來越高,完整性越來越好｡

提取後往往需要進一步檢測，確定提取的是不是外泌體。有三種方法：1. 掃描電鏡觀察；2. NTA儀器粒徑檢測；3. WB檢測。如圖所示，在外泌體上往往存在許多標志物，這時候就可以選擇相應的抗體進行WB檢測。根據22 篇外泌體相關文獻的統計，排在前4 位的檢測指標為 CD63（13/22）、Tsg101(8/22)、CD9 和CD81並列第三位（6/22）；接著檢測較多的4 個指標為Alix （4/22）、HSP70(3/22)、flotillin (3/22)和Syntenin (2/22)；此外還有一些指標僅在1 篇文獻中出現過，例如HSP90、LAMP2B、LMP1、ADAM10、nicastrin、AChE、AQP2、RPL5、a-1AT。針對外泌體的定性檢測至少選擇兩個指標就能滿足文章發表需要了，比如檢測CD63 和Tsg101。 

Ⅲ 實戰分享 | 外泌體提取之經驗小結

近些年來，關於外泌體的研究如火如荼。外泌體在免疫中抗原呈遞、腫瘤的生長與遷移、組織損傷的修復等生理病理上起著重要的作用。同時，不同細胞分泌的外泌體具有不用的組成成分和功能，可作為疾病診斷的生物標志物。 來自華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院的崔老師，對外泌體提取積累了自己的心得，並將自己的研究成果發表在 Bioactive Materials 上。 下文是崔老師的分享。

要進行關於外泌體的研究，提取純化外泌體一直是大家非常關注的問題。 能否獲得較高純度的足量外泌體，直接關系著後續研究能否開展 。雖然目前仍然沒有能同時保證外泌體的含量、純度和生物活性的提取宏氏方法，但是我們可以結合當前的實際情況，對外泌體提取做一些探討和經驗總結。

超速離心（差速離心）法是目前最常用的外泌體提取方法 ，即採用低速離心、高速離心交替進行，可分離到大小相近的囊泡顆粒。超離法因操作簡單，獲得的囊泡數量較多而廣受歡迎。本人近期發表的論文中最後也是採用了這種方法。

具體的步驟大家都比較熟悉，無論是提取血清來源的外泌體，還是細胞條件培養基來源的外泌體 ，大家都習慣於先將血清或者條件培養基收集後保存於-80℃的溫度下，等達到一定量後，再批量進行超速離心。

這樣的話， 大家會發現一個非常嚴重的問題，尤其是在拍攝電鏡的時候——背景雜質很多，並且很多囊泡的形態不夠典型，不鎮絕雀是文獻中描述的那種典型的雙凹圓盤狀或者茶托狀。

通過幾次實驗的對比，我大概發現了原因， 主要是由於在凍存收集到培養基的時候，沒有進行低速離心和普通高速離心。

低速離心可以去除培養基中的未貼壁細胞、死細胞以及大的細胞殘骸，而普通高速離心可以去除其中的大型細胞外囊泡。無論是未貼壁細胞、死細胞、大的細胞殘骸，還是大型細胞外囊泡，在-80℃凍存及復溫的過程中，都會發生破裂，產生小型的細胞膜碎片結構。

這樣的話，就導致了電鏡背景很雜亂，難以達到高水平論文雜志期刊的要求。另外，還會導致這御早樣一個矛盾現象，即蛋白定量中計算的外泌體產量虛高，而蛋白免疫印跡中外泌體標記物蛋白的含量卻不高。

因此，在這里推薦給大家一個小貼士

就是在收集准備提取外泌體的條件培養基或者血清時，一定要提前做到低速離心和普通高速離心這一步，尤其是為了做透射電鏡或者蛋白免疫印跡實驗而提取的外泌體 ，一定要注意這一點。盡管過程比較費時，但是能生產出有用的結果才是更重要的。

至於其他的外泌體提取方法，如密度梯度離心、色譜柱、超濾離心法、微流控晶元法、磁珠免疫法、多聚物沉澱法，我看到學校裡面鮮少有人去嘗試，畢竟更麻煩。但不同的方法各有優劣，大家可根據自己的實驗，謹慎選用。

Ⅳ 什麼是芝萊美外泌體超速離心法

超速離心是先通過低速離心去除細胞和細胞凋亡碎片，再通過超高速去除大囊泡和沉澱外泌體。此方法耗時耗力，往往需要8-30個小時；且需要大量的起始材料和超速離心機⌄產量不高。

Ⅳ 什麼是外泌體

外泌體是健康和疾病中細胞間近距離通訊的介質，影響細胞生物學的各個方面。[1]
所有培養的細胞類型均可分泌外泌體，且外泌體天然存在於體液中，包括血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁中。有關他們分泌和攝取及其組成、「運載物」和相應功能的精確分子機制剛剛開始研究。外泌體目前被視為特異性分泌的膜泡，參與細胞間通訊，對外泌體的研究興趣日益增長，無論是研究其功能還是了解如何將其用於微創診斷的開發。

Ⅵ 外泌體small建庫跑膠純化與磁珠純化的區別

外泌體small建庫跑膠純化與磁珠純化的區別，Extracellular Vesicles (EVs) 細胞外囊泡是由細胞主動釋放的多樣的納米級膜囊泡。類似大小的囊泡可根據其生物發生、大小和生物物理性質進一步分類(如外泌體、微囊泡)。現在EVs越來越多地被認為是細胞間通信和疾病診斷和預後的循環生物標志物世擾的重要載體。根據其生物起源，EVs主要分為三大類：外泌體、微搜顫旦囊泡和洞團凋亡小體（見Table 1）。（Shao H , et al. 2018）本期小編重點介紹一下外泌體。

Ⅶ 裝外泌體的離心管可以回收嗎

裝外泌體的離心管是可以回收的。超離對外泌豎讓賀體的回收率不高,但是超滑搜離作為一種物理分離的方法,可以在不破壞外泌體群余派體特性的情況下回收。

Ⅷ 外泌體還可以這樣研究嗎

外泌體的提取主要包括以下幾種方式。
一是超速離心法，這是目前外泌體提取最常用的方法 。此種方法得到的外泌體量多，但是純度不足，電鏡鑒定時發現外泌體聚集成塊， 由於微泡和外泌體沒有非常統一的鑒定標准，也有一些研究認為此種 方法得到的是微泡不是外泌體 。
二是過濾離心， 這種操作簡單、省時，不影響外泌體的生物活性 ，但同樣存在純度不足的問題。
三是密度梯度離心法， 用此種方法分離到 的外泌體純度 高，但是前期准備工作繁雜，耗時，量少。
四是免疫磁珠法，這種方法可以保證外泌體形態 的完整，特異性高、操作簡單、不需要昂貴的儀器設備，但是非中性pH 和非 生理性鹽濃度會影響外泌體生物活性， 不便進行下一步的實驗 。
五是PS親和法，該方法將PS（磷脂醯絲氨酸）與磁珠結合，利用親和原理捕獲外泌體囊泡外的PS。該方法與免疫磁珠法相似，獲得的外泌體形態完整，純度最高。由於不使用變性劑，不影響外泌體的生物活性，外泌體可用於細胞共培養和體內注射。2016.9 nature雜志發表了該方法最新數據，表明PS法可提取相當高純度的外泌體。
六是色譜法，這種方法分離到的外泌體在 電鏡下大小均 一， 但是需要特殊的設備 ， 應用不廣泛 。

Ⅸ 什麼是外泌體

通過上述科普，大家對外泌體美容一定有了更全面的認識