㈠ 如何進行蛋白超濾設備選型
如何進行蛋白超濾設備選型？在分離分析特別是蛋白質分離分析中，層析是相當重要、且相當常見的一種技術，其原理較為復雜，對人員的要求相對較高，這里只能做一個相對簡單的介紹。
一、 吸附層析
1、 吸附柱層析
吸附柱層析是以固體吸附劑為固定相，以有機溶劑或緩沖液為流動相構成柱的一種層析方法。
2、 薄層層析
薄層層析是以塗布於玻板或滌綸片等載體上的基質為固定相，以液體為流動相的一種層析方法。這種層析方法是把吸附劑等物質塗布於載體上形成薄層，然後按紙層析操作進行展層。
3、 聚醯胺薄膜層析
聚醯胺對極性物質的吸附作用是由於它能和被分離物之間形成氫鍵。這種氫鍵的強弱就決定了被分離物與聚醯胺薄膜之間吸附能力的大小。層析時，展層劑與被分離物在聚醯胺膜表面競爭形成氫鍵。因此選擇適當的展層劑使分離在聚醯胺膜表面發生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的連續過程，就能導致分離物質達到分離目的。
二、 離子交換層析
離子交換層析是在以離子交換劑為固定相，液體為流動相的系統中進行的。離子交換劑是由基質、電荷基團和反離子構成的。離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應主要以離子交換方式進行，或藉助離子交換劑上電荷基團對溶液中離子或離子化合物的吸附作用進行。`
三、 凝膠過濾
凝膠過濾又叫分子篩層析，其原因是凝膠具有網狀結構，小分子物質能進入其內部，而大分子物質卻被排除在外部。當一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時，溶液中的物質就按不同分子量篩分開了。
四、 親和層析
親和層析的原理與眾所周知的抗原一抗體、激素一受體和酶一底物等特異性反應的機理相類似，每對反應物之間都有一定的親和力。正如在酶與底物的反應中，特異的廢物(S')才能和一定的酶(E)結合，產生復合物(E－S')一樣。在親和層析中是特異的配體才能和一定的生命大分子之間具有親和力，並產生復合物。而親和層析與酶一底物反應不同的是，前者進行反應時，配體(類似底物)是固相存在；後者進行反應時，底物呈液相存在。實質上親和層析是把具有識別能力的配體L(對酶的配體可以是類似底物、抑制劑或輔基等)以共價鍵的方式固化到含有活化基團的基質M(如活化瓊脂糖等)上，製成親和吸附劑M－L，或者叫做固相載體。而固化後的配體仍保持束縛特異物質的能力。因此，當把圍相載體裝人小層析柱(幾毫升到幾十毫升床體積)後，讓欲分離的樣品液通過該柱。這時樣品中對配體有親和力的物質S就可藉助靜電引力、范德瓦爾力，以及結構互補效應等作用吸附到固相載體上，而無親和力或非特異吸附的物質則被起始緩沖液洗滌出來，並形成了第一個層析峰。然後，恰當地改變起始緩沖 液的PH值、或增加離子強度、或加人抑③劑等因子，即可把物質S從固相載體上解離下來，並形成了第M個層析峰(見圖6－2)。顯然，通過這一操作程序就可把有效成分與雜質滿意地分離開。如果樣品液中存在兩個以上的物質與固相載體具有親和力(其大小有差異)時，採用選擇性緩沖液進行洗脫，也可以將它們分離開。用過的固相載體經再生處理後，可以重復使用。
上面介紹的親和層析法亦稱特異性配體親和層析法。除此之外，還有一種親和層析法叫通用性配體親和層析法。這兩種親和層析法相比，前者的配體一般為復雜的生命大分子物質(如抗體、受體和酶的類似底物等)，它具有較強的吸附選擇性和較大的結合力。而後者的配體則一般為簡單的小分子物質(如金屬、染料，以及氨基酸等)，它成本低廉、具有較高的吸附容量，通過改善吸附和脫附條件可提高層析的解析度。
五、 聚焦層析
聚焦層析也是一種柱層析。因此，它和另外的層析一樣，照例具有流動相，其流動相為 多緩沖劑，固定相為多緩沖交換劑。
聚焦層析原理可以從PH梯度溶液的形成、蛋白質的行為和聚焦效應三方面來闡述。
1、PH梯度溶液的形成
在離子交換層析中，PH梯度溶液的形成是靠梯度混合儀實現的。例如，當使用陰離子 劑進行層析時，制備PH由高到低呈線性變化的梯度溶液的方法是，在梯度儀的混合室(這層析柱者)中裝高PH溶液，而在另一室裝低PH極限溶液，然後打開層析柱的下端出口，讓洗脫液連續不斷地流過柱體。這時從柱的上部到下部溶液的PH值是由高到低變化的。而在聚焦層析中，當洗脫液流進多緩沖交換劑時，由於交換劑帶具有緩沖能力的電荷基團，故PH梯度溶液可以自動形成。例如，當柱中裝陰離子交換劑PBE94(作固定相)時，先用起始緩沖液(配方見表了一2)平衡到PHg，再用含PH6的多緩沖劑物質(作流動相)的淋洗液通過柱體，這時多緩沖劑中酸性最強的組分與鹼性陰離子交換對結合發生中和作用。隨著淋洗液的不斷加人，住內每點的PH值從高到低逐漸下降。照此處理J段時間，從層析柱頂部到底部就形成了PH6～9的梯度。聚焦層析柱中的PH梯度溶液是在淋洗過程中自動形成的，但是隨著淋洗的進行，PH梯度會逐漸向下遷移，從底部流出液的PH卻由9逐漸降至6，並最後恆定於此值，這時層析柱的PH梯度也就消失了。
2．蛋白質的行為
蛋白質所帶電荷取決於它的等電點(PI)和層析柱中的PH值。當柱中的PH低於蛋白質的PI時，蛋白質帶正電荷，且不與陰離於交換劑結合。而隨著洗脫劑向前移動，固定相中的PH值是隨著淋洗時間延長而變化的。當蛋白質移動至環境PH高於其PI時，蛋白質由帶正電行變為帶負電荷，並與陰離子交換劑結合。由於洗脫劑的通過，蛋白質周圍的環境PH 再次低於PI時，它又帶正電荷，並從交換劑解吸下來。隨著洗脫液向柱底的遷移，上述過程將反復進行，於是各種蛋白質就在各自的等電點被洗下來，從而達到了分離的目的。
不同蛋白質具有不同的等電點，它們在被離子交換劑結合以前，移動之距離是不同的，洗脫出來的先後次序是按等電點排列的。
供靜脈注射的25%人胎盤血白蛋白（即胎白）通常是用硫酸銨鹽析法、透析脫鹽、真空濃縮等工藝制備的，該工藝流程硫酸銨耗量大，能源消耗多，操作時間長，透析過程易產生污染。改用超濾工藝後，平均回收率可達97.18%；吸附損失為1.69%；透過損失為1.23%；截留率為98.77%。大幅度提高了白蛋白的產量和質量，每年可節省硫酸銨6.2噸，自來水16000噸。目前國外生產超濾膜和超濾裝置最有名的廠家是美國的Milipore公司和德國的Sartorius公司。
隨著現代生物技術的發展, 通過基因工程生產蛋白質葯物在治療人類面臨的重大疾病如癌症等方面展示出巨大的潛力. 為滿足生物技術產品工業化生產的需要, 開發高通量、低成本、高效的分離純化方法已引起人們的高度關注. 超濾技術由於具有通量高, 操作條件溫和, 易於放大等特點, 特別適合生物活性大分子的分離. 在生物技術領域, 超濾技術目前已廣泛應用於細胞收集分離、除菌消毒、緩沖液置換、分級( fract ionatio n) 、脫鹽及濃縮[ 1] . 近年來越來越多的研究表明, 通過選擇適當的膜或膜表面改性,以及對分離過程進行優化, 充分利用和調控膜—蛋白質以及蛋白質—蛋白質之間的靜電相互作用, 可以實現分子量相近的兩種蛋白質的高選擇性超濾分離[2- 7] .
為克服常規蛋白質超濾分離過程優化中存在的實驗蛋白質消耗多、工作量大、費時以及費用高等缺點, 我們相繼開發了脈沖進樣技術( Pulsed sampleinject ion technique ) [8]和參數連續變化超濾技術( Parameter scanning ultraf ilt ration) [9]. 並以此為基礎, 結合載體相超濾技術( Carrier phase ult rafil—t rat ion) [10]進一步提出了一種蛋白質超濾分離快速優化新方法[11], 實現了人血漿白蛋白—免疫球蛋白[12]、人源化單克隆抗體( A lemtuzumab) 單體— 二聚體[13]的超濾分離過程快速優化和高選擇性分離,並在膜的篩選及其適用性快速評估方面展現出巨大的潛力. 該方法的主要特徵是與AKTA Prime 系統聯用, 採用脈動進樣技術顯著減少了蛋白質的用量;而利用雙緩沖體系( 類似梯度洗脫) 的參數連續變化超濾技術, 在pH 或離子強度連續變化的情況下考查pH 或離子強度對蛋白質透過率或截留率的影響, 進一步縮短了實驗時間, 降低了蛋白質的用量,極大地減少了實驗量, 加快了過程優化進程; 另外,載體相超濾技術的應用則可保證超濾分離自始至終在設定的條件下進行, 從而最大限度地保證超濾過程的穩定性.
2012-02-25
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㈡ 蛋白質的分離方法有哪些它們各依據蛋白質的什麼性質或特點
（一）水溶液提取法
稀鹽和緩沖系統的水溶液對蛋白質穩定性好、溶解度大、是提取蛋白質最常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1-5倍，提取時需要均勻的攪拌，以利於蛋白質的溶解。提取的溫度要視有效成份性質而定。一方面，多數蛋白質的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利於溶解，縮短提取時間。但另一方面，溫度升高會使蛋白質變性失活，因此，基於這一點考慮提取蛋白質和酶時一般採用低溫（5度以下）操作。為了避免蛋白質提以過程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
下面著重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇。
1、pH值
蛋白質，酶是具有等電點的兩性電解質，提取液的pH值應選擇在偏離等電點兩側的pH
范圍內。用稀酸或稀鹼提取時，應防止過酸或過鹼而引起蛋白質可解離基團發生變化，從而導致蛋白質構象的不可逆變化，一般來說，鹼性蛋白質用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質用偏鹼性的提取液。
2、鹽濃度
稀濃度可促進蛋白質的溶，稱為鹽溶作用。同時稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質部分結合，具有保護蛋白質不易變性的優點，因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽，一般以0.15摩爾。升濃度為宜。緩沖液常採用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。
（二）有機溶劑提取法
一些和脂質結合比較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質和酶，不溶於水、稀鹽溶液、稀酸或稀鹼中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑，它們具的一定的親水性，還有較強的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必須在低溫下操作。丁醇提取法對提取一些與脂質結合緊密的蛋白質和酶特別優越，一是因為丁醇親脂性強，特別是溶解磷脂的能力強；二是丁醇兼具親水性，在溶解度范圍內（度為10%，40度為6.6%）不會引起酶的變性失活。另外，丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣，也適用於動植物及微生物材料。
二、蛋白質的分離純化
蛋白質的分離純化方法很多，主要有：
（一）根據蛋白質溶解度不同的分離方法
1、蛋白質的鹽析
中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質的溶解度增加，此稱鹽溶；當鹽濃度繼續升高時，蛋白質的溶解度不同程度下降並先後析出，這種現象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO4和NH4)有很強的水化力，可奪取蛋白質分子的水化層，使之「失水」，於是蛋白質膠粒凝結並沉澱析出。鹽析時若溶液pH在蛋白質等電點則效果更好。由於各種蛋白質分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調節混合蛋白質溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質分段沉澱。
影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對溫度敏感的蛋白質在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進行。一般溫度低蛋白質溶介度降低。但有的蛋白質（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時溶解度低，更容易鹽析。（2）pH值：大多數蛋白質在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低。（3）蛋白質濃度：蛋白質濃度高時，欲分離的蛋白質常常夾雜著其他蛋白質地一起沉澱出來（共沉現象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質含量在2.5-3.0%。
蛋白質鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。
其中應用最多的硫酸銨，它的優點是溫度系數小而溶解度大（25度時飽和溶液為4.1M，即767克/升；0度時飽和溶解度為3.9M，即676克/升），在這一溶解度范圍內，許多蛋白質和酶都可以鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質變性。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間，當用其他pH值進行鹽析時，需用硫酸或氨水調節。
蛋白質在用鹽析沉澱分離後，需要將蛋白質中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質溶液裝入秀析袋內（常用的是玻璃紙），用緩沖液進行透析，並不斷的更換緩沖液，因透析所需時間較長，所以最好在低溫中進行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽，所用的時間就比較短。
2、等電點沉澱法
蛋白質在靜電狀態時顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質的等電點有差別，可利用調節溶液的pH達到某一蛋白質的等電點使之沉澱，但此法很少單獨使用，可與鹽析法結合用。
3、低溫有機溶劑沉澱法
用與水可混溶的有機溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數蛋白質溶解度降低並析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質較易變性，應在低溫下進行。
（二）根據蛋白質分子大小的差別的分離方法
1、透析與超濾
透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質分開。
超濾法是利用高壓力或離心力，強使水和其他小的溶質分子通過半透膜，而蛋白質留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質。
2、凝膠過濾法
也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadex
ged）和瓊脂糖凝膠（agarose gel）。
（三）根據蛋白質帶電性質進行分離
蛋白質在不同pH環境中帶電性質和電荷數量不同，可將其分開。
1、電泳法
各種蛋白質在同一pH條件下，因分子量和電荷數量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質作為載體，電泳時兩性電解質形成一個由正極到負極逐漸增加的pH梯度，當帶一定電荷的蛋白質在其中泳動時，到達各自等電點的pH位置就停止，此法可用於分析和制備各種蛋白質。
2、離子交換層析法
離子交換劑有陽離子交換劑（如：羧甲基纖維素；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素；DEAE?FONT
FACE="宋體"
LANG="ZH-CN">纖維素），當被分離的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上，隨後用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質洗脫下來。（詳見層析技術章）
（四）根據配體特異性的分離方法－親和色譜法
親和層析法（aflinity
chromatography）是分離蛋白質的一種極為有效的方法，它經常只需經過一步處理即可使某種待提純的蛋白質從很復雜的蛋白質混合物中分離出來，而且純度很高。這種方法是根據某些蛋白質與另一種稱為配體(Ligand）的分子能特異而非共價地結合。其基本原理：蛋白質在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在，每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質，因此蛋白質的分離（Separation），提純（Purification）
和鑒定（Characterization）是生物化學中的重要的一部分，至今還沒的單獨或一套現成的方法能移把任何一種蛋白質從復雜的混合蛋白質中提取出來，因此往往採取幾種方法聯合使用。
細胞的破碎
1、高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置於筒內約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調速器先撥至最慢處，開動開關後，逐步加速至所需速度。此法適用於動物內臟組織、植物肉質種子等。
2、玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置於管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細胞研碎，此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高，適用於量少和動物臟器組織。
3、超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震盪破裂，此法多適用於微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，在1KG至10KG頻率下處理10-15分鍾，此法的缺點是在處理過程會產生大量的熱，應採取相應降溫措施。對超聲波敏感和核酸應慎用。
4、反復凍融法：將細胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復幾次，由於細胞內冰粒形成和剩餘細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結構破碎。
5、化學處理法：有些動物細胞，例如腫瘤細胞可採用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細胞膜破壞，細菌細胞壁較厚，可採用溶菌酶處理效果更好。
無論用哪一種方法破碎組織細胞，都會使細胞內蛋白質或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導致天然物質量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺醯氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，還可通過選擇pH、溫度或離子強度等，使這些條件都要適合於目的物質的提取。
濃縮、乾燥及保存
一、樣品的濃縮
生物大分子在制備過程中由於過柱純化而樣品變得很稀，為了保存和鑒定的目的，往往需要進行濃縮。常用的濃縮方法的：
1、減壓加溫蒸發濃縮
通過降低液面壓力使液體沸點降低，減壓的真空度愈高，液體沸點降得愈低，蒸發愈快，此法適用於一些不耐熱的生物大分子的濃縮。
2、空氣流動蒸發濃縮
空氣的流動可使液體加速蒸發,鋪成薄層的溶液，表面不斷通過空氣流；或將生物大分子溶液裝入透析袋內置於冷室，用電扇對准吹風，使透過膜外的溶劑不沁蒸發，而達到濃縮目的，此法濃縮速度慢，不適於大量溶液的濃縮。
3、冰凍法
生物大分子在低溫結成冰，鹽類及生物大分子不進入冰內而留在液相中，操作時先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體，然後緩慢地融解，利用溶劑與溶質融點介點的差別而達到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質和酶的鹽溶液用此法濃縮時，不含蛋白質和酶的純冰結晶浮於液面，蛋白質和酶則集中於下層溶液中，移去上層冰塊，可得蛋白質和酶的濃縮液。
4、吸收法
通過吸收劑直接收除去溶液中溶液分子使之濃縮。所用的吸收劑必需與溶液不起化學反應，對生物大分子不吸附，易與溶液分開。常用的吸收劑有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝膠等，使用聚乙二醇吸收劑時，先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋裡，外加聚乙二醇復蓋置於4度下，袋內溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水飽和後要更換新的直至達到所需要的體積。
5、超濾法
超濾法是使用一種特別的薄膜對溶液中各種溶質分子進行選擇性過濾的方法，不液體在一定壓力下（氮氣壓或真空泵壓）通過膜時，溶劑和小分子透過，大分子受阻保留，這是近年來發展起來的新方法，最適於生物大分子尤其是蛋白質和酶的濃縮或脫鹽，並具有成本低，操作方便，條件溫和，能較好地保持生物大分子的活性，回收率高等優點。應用超濾法關鍵在於膜的選擇，不同類型和規格的膜，水的流速，分子量截止值（即大體上能被膜保留分子最小分子量值）等參數均不同，必須根據工作需要來選用。另外，超濾裝置形式，溶質成份及性質、溶液濃度等都對超濾效果的一定影響。Diaflo
超濾膜的分子量截留值：
膜名稱分子量截留值孔的大的平均直徑
XM－300300，000140
XM－200100，00055
XM－5050，00030
PM－30 30，00022
UM－2020，00018
PM－1010，00015
UM－21，00012
UM05500 10
用上面的超濾膜製成空心的纖維管，將很多根這樣的管攏成一束，管的兩端與低離子強度的緩沖液相連，使緩沖液不斷地在管中流動。然後將纖維管浸入待透析的蛋白質溶液中。當緩沖液流過纖維管時，則小分子很易透過膜而擴散，大分子則不能。這就是纖維過濾秀析法，由於透析面積增大，因而使透析時間縮短10倍。
二、乾燥
生物大分子制備得到產品，為防止變質，易於保存，常需要乾燥處理，最常用的方法是冷凍乾燥和真空乾燥。真空乾燥適用於不耐高溫，易於氧化物質的乾燥和保存，整個裝置包括乾燥器、冷凝器及真空乾燥原理外，同時增加了溫度因素。在相同壓力下，水蒸汽壓隨溫度下降而下降，故在低溫低壓下，冰很易升華為氣體。操作時一般先將待乾燥的液體冷凍到冰點以下使之變成固體，然後在低溫低壓下將溶劑變成氣體而除去。此法干後的產品具有疏鬆、溶解度好、保持天然結構等優點，適用於各類生物大分子的乾燥保存。
三、貯存
生物大分子的穩定性與保存方法的很大關系。乾燥的製品一般比較穩定，在低溫情況下其活性可在數日甚至數年無明顯變化，貯藏要求簡單，只要將乾燥的樣品置於乾燥器內（內裝有乾燥劑）密封，保持0－4度冰箱即可，液態貯藏時應注意以下幾點。
1、樣品不能太稀，必須濃縮到一定濃度才能封裝貯藏，樣品太稀易使生物大分子變性。
2、一般需加入防腐劑和穩定劑，常用的防腐劑有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白質和酶常用的穩定劑有硫酸銨糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和輔酶以提高其穩定性。此外，鈣、鋅、硼酸等溶液對某些酶也有一定保護作用。核酸大分子一般保存在氯化鈉或檸檬酸鈉的標准緩沖液中。
3、貯藏溫度要求低，大多數在0度左右冰箱保存，有的則要求更低，應視不同物質而定。
㈢ 蛋白質脫鹽有哪些方法
常用的脫鹽方法有透析法、電透析法和凝膠過濾法。透析法及電透析法耗時長，樣品稀釋度大，不易放大進行大規模生產，所以工業生產中應用較少。凝膠過濾層析脫鹽過程中鹽分子和蛋白質分子大小差異巨大，蛋白質溶液中小分子的鹽分子隨著層析流動相進入孔徑較小的固定相，使其在層析中的遷移速率小，而蛋白質因分子尺寸較大，不能隨流動相進入固定相中，因此在層析柱中的遷移速率大，首先從層析術中流出，實現脫鹽。
用凝膠過濾法脫鹽時，為了使鹽同蛋白質充分地分離，除了應選用足夠長的層析柱之外，還應對樣品的體積加以限制。樣品的體積如果過大就導致蛋白質帶同鹽帶不能分開。一般來就，樣品體積不超過床體積的30%。這一數據的確定是根據鹽和蛋白質的分離體積（Vsep）決定的。兩種物質分離體積的定義為，當兩種物質的混合物在凝膠過濾層析柱上能夠完全分離時的最小體積。
㈣ 生物分離高手進
這寫起來復雜了....... 很多地方都有這樣的實驗步驟啊，我看了一下 下面這個，還可以
酶的分離簡單，就是麻煩，時間挺長的
酶的分離純化方法簡介
生物細胞產生的酶有兩類：一類由細胞內產生後分泌到細胞外進行作用的酶，稱為細胞外酶。這類酶大都是水解酶，如酶法生產葡萄糖所用的兩種澱粉酶，就是由枯草桿菌和根酶發酵過程中分泌的。這類酶一般含量較高，容易得到；另一類酶在細胞內產生後並不分泌到細胞外，而在細胞內起催化作用，稱為細胞內酶，如檸檬酸、肌苷酸、味精的發酵生產所進行的一系列化學反應，就是在多種酶催化下在細胞內進行的，在類酶在細胞內往往與細胞結構結合，有一定的分布區域，催化的反應具有一定的順序性，使許多反應能有條不紊地進行。
酶的來源多為生物細胞。生物細胞內產生的總的酶量雖然是很高的，但每一種酶的含量卻很低，如胰臟中期消化作用的水解酶種類很多，但各種酶的含量卻差別很大。
因此，在提取某一種酶時，首先應當根據需要，選擇含此酶最豐富的材料，如胰臟是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、澱粉酶和脂酶的好材料。由於從動物內臟或植物果實中提取酶制劑受到原料的限制，如不能綜合利用，成本又很大。目前工業上大多採用培養微生物的方法來獲得大量的酶制劑。從微生物中來生產酶制劑的優點有很多，既不受氣候地理條件限制，而且動植物體內酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，產酶量又豐富，還可以通過選育菌種來提高產量，用廉價原料可以大量生產。
由於在生物組織中，除了我們所需要的某一種酶之外，往往還有許多其它酶和一般蛋白質以及其他雜質，因此為製取某酶制劑時，必須經過分純化的手續。
酶是具有催化活性的蛋白質，蛋白質很容易變性，所以在酶的提純過程中應避免用強酸強鹼，保持在較低的溫度下操作。在提純的過程中通過測定酶的催化活性可以比較容易跟蹤酶在分離提純過程中的去向。酶的催化活性又可以作為選擇分離純化方法和操作條件的指標，在整個酶的分離純化過程中的每一步驟，始終要測定酶的總活力和比活力，這樣才能知道經過某一步驟回收到多少酶，純度提高了多少，從而決定著一步驟的取捨。
酶的分離純化一般包括三個基本步驟：即抽提、純化、結晶或制劑。首先將所需的酶從原料中引入溶液，此時不可避免地夾帶著一些雜質，然後再將此酶從溶液中選擇性地分離出來，或者從此溶液中選擇性地除去雜質，然後製成純化的酶制劑。下面就酶的分離純化的常用方法作一綜合介紹：
一、預處理及固液分離技術
1.細胞破碎（cell disruption）
高壓均質器法：此法可用於破碎酵母菌、大腸菌、假單胞菌、桿菌甚至黑麴黴菌。將細胞懸浮液在高壓下通入一個孔徑可調的排放孔中，菌體從高壓環境轉到低壓環境，細胞就容易破碎。菌懸液一次通過均質器的細胞破碎率在12%-67%。細胞破碎率與細胞的種類有關。要達到90%以上的細胞破碎率，起碼要將菌懸液通過均質器兩次。最好是提高操作壓力，減少操作次數。但有人報道，當操作壓力達到175Mpa時，破碎率可達100%。當壓力超過70Mpa時，細胞破碎率上升較為緩慢。高壓均質器的閥門是影響細胞破碎率的重要因素。絲狀菌會堵塞均質器的閥門，尤其高濃度菌體時更是如此。在豐富培養基上比在合成培養基上生長的大腸菌更難破碎。
容菌酶處理法：蛋清中含有豐富的溶菌酶，價格便宜，常用來裂解細胞。具體做法是：溶壁微球菌(micrococcus lysodeikticus)43kg，置於0.5%的氯化鈉溶液中，使細胞濃度為5%（乾重），在35℃用0.68kg（乾重）的蛋清處理20min，得到的細胞碎片用相同體積的乙醇處理，用離心機將細胞碎片和胞內蛋白質除去，再將乙醇濃度提高到75%（體積分數），可以得到純度為5%的過氧化氫酶1500g。
2.離心
離心分離過程可分為離心過濾、離心沉澱、離心分離3種類型，所使用的設備有過濾式離心機、沉降式離心機和離心機。過濾式離心機的轉鼓壁上開有小孔，壁上有過濾介質，一般可用於處理懸浮固體顆粒較大、固體含量較高的場合。沉降式離心機用於分離固體濃度較低的固液分離，如發酵液中的菌體，用鹽析法或有機溶劑處理過的蛋白質等。分離機用於分離兩種互不相溶的、密度有微小差別的乳濁液或含微量固體微粒的乳濁液。
在生物領域採用的離心機系統，除了應具備離心機的一般要求外，還應滿足生物生產的技術要求，這包括滅菌、冷卻、密封，以保證產品不受污染並不污染環境。現代哦離心機裝置包括以下三個步驟，並進行程序控制：離心、離心系統的滅菌及就地清洗。如阿法-拉伐公司離心機產品的裝置，具有雙重軸向密封，密封由裝在轉筒主軸上下的碳化硅動環和固定環組成，密封由水連續冷卻和潤滑，可防止產品被污染，也可防止生產過程中排出的廢物對環境的污染。該離心機又如一個密閉的壓力容器，可在121℃溫度下進行蒸汽滅菌，該離心設備設有環繞離心機轉筒的冷卻夾套，對懸浮液和濃縮的固體都能進行充分的冷卻，並能有效地控制溫度，這對於生物製品是非常重要的。如BTPX205型離心機可用於細胞收集、培養液的凈化和細胞碎片的分離，可用於疫苗、酶制劑等的提取。該機的其他輔助系統及控制系統也較為完善，如設有壓力指示器、力量計、溫度感測器和液面感測器。
3.膜分離技術
在蛋白質純化過程中主要用到的膜分離技術多為超濾。在靜壓作用下降溶液通過孔徑非常小的濾膜，使溶液中分子量較小的溶質透過薄膜，而大分子被截留於膜表面。大多數超濾膜是由一層非常薄的功能膜與較厚的支撐膜結合在一起而組成的。功能膜決定了膜的孔徑，而支撐膜提供機械強度以抵抗靜壓力。超濾濃縮的優點是：操作條件溫和，無相變化，對生物活性物質沒有破壞。
超濾系統主要由料液貯罐、泵、超濾器、透過液收集罐組成，料液經泵打入超濾器，水及低分子量物質排出超濾器外，被濃縮的料液在料液貯罐、泵、及超濾器中循環。當料液濃縮至一定的倍數後即可作為進一步處理的濃縮料液。
超濾應用於蛋白質類物質的濃縮和脫鹽過程中時應注意以下問題：第一，在超濾循環過程中，由於泵和葉輪與料液的摩擦放熱作用，料液的溫度會逐漸升高，會造成蛋白質分子的損失。因此，料液貯罐應加冷卻系統，並安裝自動測溫及控制系統。第二，某些酶的輔助因子散失為問題：一些酶含有輔助因子，其分子量小，超濾時易從透過液中排除掉，因而在超濾前或超濾後要添加一定濃度的的輔助因子。
還可將超濾與親和層析相結合以提高分離純度。其工作原理是：當溶液中欲被分離的蛋白質不受阻礙地通過超濾膜的孔隙時，如果在膜的一側結合著親和配基，該蛋白質就會與配基結合因而結聚在膜的這一側。不與配基結合的其他物質就將穿過孔而被帶走。再用適宜的洗脫劑將該蛋白質洗脫下來，洗脫液用於進一步的分離純化。
4.泡沫分離
原理：將氣體通入含多種組分的溶液中，由於這些組分的表面活性由差異，因此在溶液的表面，某些組分將形成泡沫，泡沫的穩定性取決於操作條件及溶液的生物學特性。泡沫中含有更多的表面活性成分，故泡沫的組分種類及其含量與溶液中的不相同。這樣，溶液中的組分舅得以分離。
蛋白質較易吸附與氣液界面，這有利於其結構的穩定。泡沫分離過程是：蛋白質從主體溶液中擴散到氣液界面，該過程可能是可逆的也可能是不可逆的；分子發生重排，一般認為在空氣-水界面會形成兩種類型的膜，一種是稀膜，另一種是濃膜，可能會發生由多個分子聚集在一起的現象。在氣液界面形成的蛋白質膜可以是單層的也可以是多層的。膜的類型取決於主體溶液及氣液界面上蛋白質的特性、結構和濃度。
泡沫分離的目的，一方面提高酶蛋白的富集率（泡沫中蛋白質的濃度/最初溶液中蛋白質濃度），另一方面提高酶蛋白的提取率（泡沫中蛋白質的提取率/最初的蛋白質質量），或使多組分混合物中某一組分的分配系數最大。
二、抽提
沉澱
1. 鹽析
常用的鹽析劑是硫酸銨，其溶解度大、價格便宜。硫酸銨沉澱蛋白質的能力很強，其飽和溶液能使大多數的蛋白質沉澱下來。對酶沒有破壞作用。
pH的控制：應從酶的溶解度與穩定性兩個方面考慮，在酶等電點時其溶解度最小易沉澱，但有些酶再等電點時穩定性較差，因此要選擇最佳pH值.一般要求在酶最穩定的pH值的前提下再考慮最適宜酶沉澱的pH值。在操作中一旦確定最佳pH值後，在添加硫酸銨之前甲酸或鹼調節好酶液的pH值，要盡量避免溶液pH值的波動以免破壞酶的穩定性。在添加硫酸銨時要注意攪拌，並注意硫酸銨的加入速度，一般是由少到多，緩慢加入，硫酸銨盡可能磨成細粉。
溫度的控制：有些酶在較高溫度下穩定性能較好，可在常溫下進行鹽析操作，而對於大多數酶，盡可能在低溫下操作。
酶液的凈置：加完硫酸銨後，酶液要靜置一段時間，使酶蛋白完全沉澱下來，酶靜置後，就不要再加以攪拌。
2．有機溶劑沉澱
有機溶劑選擇：可用於酶蛋白沉澱的有機溶劑包括醇類物質等，如甲醇、乙醇、異丙醇。乙醇的親水性能較好，可防止蛋白質的變性，酶蛋白在其中的溶解度也較低。
有機溶劑沉澱操作：有機溶劑一般都使蛋白質變性，當溫度較高時變性蛋白質分子就會變成永久失活。因此用有機溶劑處理時最好在0℃以下進行。用有機溶劑沉澱得到的酶蛋白不要放置過久，要盡快加水溶解。
3.聚合物絮凝劑沉澱
聚合物絮凝劑，如葡聚糖和聚乙二醇，與酶分子爭奪水分子，具有脫水作用使酶沉澱。聚乙二醇作為一種沉澱劑的優點是在水溶液中，其濃度可達到50%，濃度為6%-12%的蛋白質大都可以沉澱下來。這種試劑不需要低溫操作，而且對蛋白質的穩定還有一定的保護作用。聚乙二醇不會被吸附，故在離子交換吸附前不必去除。
4．用金屬離子和絡合物沉澱
酶和其他蛋白質都會形成金屬鹽，其溶解度較低。用金屬離子沉澱的缺點是酶與金屬離子相互作用後，可逆變化較差，尤其是用巰基衍生物，它結合的]金屬離子會催化酶變性而失活。
5．用特殊試劑沉澱法
用鏈黴素可選擇性去除核酸，從而使胞內酶沉澱出來。鏈黴素鹽（濃度為0.5-1.0mg/mg蛋白質）對於選擇性沉澱核酸的效果比錳離子還要好，酶不易失活。
6．親和沉澱
將親和反應的高度選擇性、低處理量特性與沉澱操作的大處理量、地選擇性有機結合形成了親和沉澱技術。將配基與可溶性載體偶聯後形成載體-配基復合物，該復合物與生物分子結合後在一定條件下可以沉澱出來。
配基-載體復合物可以選擇性地與蛋白質結合，溶液中的pH值、離子強度及蛋白質濃度等條件對親和結合的影響力並不大，只有競爭性的配基會降低產物與原配基的親和結合力，甚至使親和結合發生逆轉。
引導產生沉澱的方法有：離子交聯；加入帶相反電荷的聚合物；加入帶相反電荷的疏水基團；改變pH值，誘導產生疏水沉澱；溫度誘導產生沉澱。
親和結合：將親和配基加入到含有目的物蛋白質的溶液中，調節好有關沉澱的條件，使之有利於親和結合。
洗滌：為經過處理的粗製液中發生親和沉澱可能會發生非特異性結合，尤其是使用帶電的聚合物，離子交換的效應將使其他蛋白質共同沉澱，因此在分離目的物之前要洗滌沉澱物。其做法是：加入適當的清洗劑重新溶解沉澱，再沉澱；或在專一性洗脫之前，徹底清洗沉澱。在上述過程中要始終保持目的蛋白質與配基處於親和結合狀態。
配基-載體復合物與目的蛋白質的分離：分離結束之後，要確保回收目的蛋白質和配基-載體復合物，目的蛋白質要達到一定的純度，回收率要高。
㈤ 蛋白質層析、超濾常用技術手段
在分離分析特別是蛋白質分離分析中，層析是相當重要、且相當常見的一種技術，其原理較為復雜，對人員的要求相對較高，這里只能做一個相對簡單的介紹。
一、 吸附層析
1、 吸附柱層析
吸附柱層析是以固體吸附劑為固定相，以有機溶劑或緩沖液為流動相構成柱的一種層析方法。
2、 薄層層析
薄層層析是以塗布於玻板或滌綸片等載體上的基質為固定相，以液體為流動相的一種層析方法。這種層析方法是把吸附劑等物質塗布於載體上形成薄層，然後按紙層析操作進行展層。
3、 聚醯胺薄膜層析
聚醯胺對極性物質的吸附作用是由於它能和被分離物之間形成氫鍵。這種氫鍵的強弱就決定了被分離物與聚醯胺薄膜之間吸附能力的大小。層析時，展層劑與被分離物在聚醯胺膜表面競爭形成氫鍵。因此選擇適當的展層劑使分離在聚醯胺膜表面發生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的連續過程，就能導致分離物質達到分離目的。
二、 離子交換層析
離子交換層析是在以離子交換劑為固定相，液體為流動相的系統中進行的。離子交換劑是由基質、電荷基團和反離子構成的。離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應主要以離子交換方式進行，或藉助離子交換劑上電荷基團對溶液中離子或離子化合物的吸附作用進行。`
三、 凝膠過濾
凝膠過濾又叫分子篩層析，其原因是凝膠具有網狀結構，小分子物質能進入其內部，而大分子物質卻被排除在外部。當一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時，溶液中的物質就按不同分子量篩分開了。
四、 親和層析
親和層析的原理與眾所周知的抗原一抗體、激素一受體和酶一底物等特異性反應的機理相類似，每對反應物之間都有一定的親和力。正如在酶與底物的反應中，特異的廢物(S')才能和一定的酶(E)結合，產生復合物(E－S')一樣。在親和層析中是特異的配體才能和一定的生命大分子之間具有親和力，並產生復合物。而親和層析與酶一底物反應不同的是，前者進行反應時，配體(類似底物)是固相存在；後者進行反應時，底物呈液相存在。實質上親和層析是把具有識別能力的配體L(對酶的配體可以是類似底物、抑制劑或輔基等)以共價鍵的方式固化到含有活化基團的基質M(如活化瓊脂糖等)上，製成親和吸附劑M－L，或者叫做固相載體。而固化後的配體仍保持束縛特異物質的能力。因此，當把圍相載體裝人小層析柱(幾毫升到幾十毫升床體積)後，讓欲分離的樣品液通過該柱。這時樣品中對配體有親和力的物質S就可藉助靜電引力、范德瓦爾力，以及結構互補效應等作用吸附到固相載體上，而無親和力或非特異吸附的物質則被起始緩沖液洗滌出來，並形成了第一個層析峰。然後，恰當地改變起始緩沖 液的PH值、或增加離子強度、或加人抑③劑等因子，即可把物質S從固相載體上解離下來，並形成了第M個層析峰(見圖6－2)。顯然，通過這一操作程序就可把有效成分與雜質滿意地分離開。如果樣品液中存在兩個以上的物質與固相載體具有親和力(其大小有差異)時，採用選擇性緩沖液進行洗脫，也可以將它們分離開。用過的固相載體經再生處理後，可以重復使用。
上面介紹的親和層析法亦稱特異性配體親和層析法。除此之外，還有一種親和層析法叫通用性配體親和層析法。這兩種親和層析法相比，前者的配體一般為復雜的生命大分子物質(如抗體、受體和酶的類似底物等)，它具有較強的吸附選擇性和較大的結合力。而後者的配體則一般為簡單的小分子物質(如金屬、染料，以及氨基酸等)，它成本低廉、具有較高的吸附容量，通過改善吸附和脫附條件可提高層析的解析度。
五、 聚焦層析
聚焦層析也是一種柱層析。因此，它和另外的層析一樣，照例具有流動相，其流動相為多緩沖劑，固定相為多緩沖交換劑。
聚焦層析原理可以從PH梯度溶液的形成、蛋白質的行為和聚焦效應三方面來闡述。
1、PH梯度溶液的形成
在離子交換層析中，PH梯度溶液的形成是靠梯度混合儀實現的。例如，當使用陰離子 劑進行層析時，制備PH由高到低呈線性變化的梯度溶液的方法是，在梯度儀的混合室(這層析柱者)中裝高PH溶液，而在另一室裝低PH極限溶液，然後打開層析柱的下端出口，讓洗脫液連續不斷地流過柱體。這時從柱的上部到下部溶液的PH值是由高到低變化的。而在聚焦層析中，當洗脫液流進多緩沖交換劑時，由於交換劑帶具有緩沖能力的電荷基團，故PH梯度溶液可以自動形成。例如，當柱中裝陰離子交換劑PBE94(作固定相)時，先用起始緩沖液(配方見表了一2)平衡到PHg，再用含PH6的多緩沖劑物質(作流動相)的淋洗液通過柱體，這時多緩沖劑中酸性最強的組分與鹼性陰離子交換對結合發生中和作用。隨著淋洗液的不斷加人，住內每點的PH值從高到低逐漸下降。照此處理J段時間，從層析柱頂部到底部就形成了PH6～9的梯度。聚焦層析柱中的PH梯度溶液是在淋洗過程中自動形成的，但是隨著淋洗的進行，PH梯度會逐漸向下遷移，從底部流出液的PH卻由9逐漸降至6，並最後恆定於此值，這時層析柱的PH梯度也就消失了。
2．蛋白質的行為
蛋白質所帶電荷取決於它的等電點(PI)和層析柱中的PH值。當柱中的PH低於蛋白質的PI時，蛋白質帶正電荷，且不與陰離於交換劑結合。而隨著洗脫劑向前移動，固定相中的PH值是隨著淋洗時間延長而變化的。當蛋白質移動至環境PH高於其PI時，蛋白質由帶正電行變為帶負電荷，並與陰離子交換劑結合。由於洗脫劑的通過，蛋白質周圍的環境PH 再次低於PI時，它又帶正電荷，並從交換劑解吸下來。隨著洗脫液向柱底的遷移，上述過程將反復進行，於是各種蛋白質就在各自的等電點被洗下來，從而達到了分離的目的。
不同蛋白質具有不同的等電點，它們在被離子交換劑結合以前，移動之距離是不同的，洗脫出來的先後次序是按等電點排列的。
供靜脈注射的25%人胎盤血白蛋白（即胎白）通常是用硫酸銨鹽析法、透析脫鹽、真空濃縮等工藝制備的，該工藝流程硫酸銨耗量大，能源消耗多，操作時間長，透析過程易產生污染。改用超濾工藝後，平均回收率可達97.18%；吸附損失為1.69%；透過損失為1.23%；截留率為98.77%。大幅度提高了白蛋白的產量和質量，每年可節省硫酸銨6.2噸，自來水16000噸。目前國外生產超濾膜和超濾裝置最有名的廠家是美國的Milipore公司和德國的Sartorius公司。
隨著現代生物技術的發展, 通過基因工程生產蛋白質葯物在治療人類面臨的重大疾病如癌症等方面展示出巨大的潛力. 為滿足生物技術產品工業化生產的需要, 開發高通量、低成本、高效的分離純化方法已引起人們的高度關注. 超濾技術由於具有通量高, 操作條件溫和, 易於放大等特點, 特別適合生物活性大分子的分離. 在生物技術領域, 超濾技術目前已廣泛應用於細胞收集分離、除菌消毒、緩沖液置換、分級( fract ionatio n) 、脫鹽及濃縮[ 1] . 近年來越來越多的研究表明, 通過選擇適當的膜或膜表面改性,以及對分離過程進行優化, 充分利用和調控膜—蛋白質以及蛋白質—蛋白質之間的靜電相互作用, 可以實現分子量相近的兩種蛋白質的高選擇性超濾分離[2- 7] .
為克服常規蛋白質超濾分離過程優化中存在的實驗蛋白質消耗多、工作量大、費時以及費用高等缺點, 我們相繼開發了脈沖進樣技術( Pulsed sampleinject ion technique ) [8]和參數連續變化超濾技術( Parameter scanning ultraf ilt ration) [9]. 並以此為基礎, 結合載體相超濾技術( Carrier phase ult rafil—t rat ion) [10]進一步提出了一種蛋白質超濾分離快速優化新方法[11], 實現了人血漿白蛋白—免疫球蛋白[12]、人源化單克隆抗體( A lemtuzumab) 單體— 二聚體[13]的超濾分離過程快速優化和高選擇性分離,並在膜的篩選及其適用性快速評估方面展現出巨大的潛力. 該方法的主要特徵是與AKTA Prime 系統聯用, 採用脈動進樣技術顯著減少了蛋白質的用量;而利用雙緩沖體系( 類似梯度洗脫) 的參數連續變化超濾技術, 在pH 或離子強度連續變化的情況下考查pH 或離子強度對蛋白質透過率或截留率的影響, 進一步縮短了實驗時間, 降低了蛋白質的用量,極大地減少了實驗量, 加快了過程優化進程; 另外,載體相超濾技術的應用則可保證超濾分離自始至終在設定的條件下進行, 從而最大限度地保證超濾過程的穩定性.
㈥ 什麼是柱層析 急急急
SephadexG-200
Sephadex是葡聚糖凝膠過濾層析技術。利用具有多孔網狀結構的凝膠顆粒的分子篩作用，根據分離樣品中分子量大小的差異進行洗脫分離的一項技術。每一種特定的凝膠介質都有特定的分子量分級范圍。根據其分級范圍，可以將溶質分子分為三類：全排阻分子、全滲透分子以及部分滲透分子。按照分子在層析凝膠中的保留時間長短逐步洗脫。SephadexG加一個數字，數字越小的介質交聯度越大，分級范圍越小，而數字越大的介質交聯度越小，分級范圍越大。G-200分離分子量范圍500-800 000
DEAE-纖維素52
就是陰離子交換層析，是按照離子強度對蛋白質進行分離， 離子交換層析法是以具有離子交換性能的物質作固定相，利用它與流動相中的離子能進行可逆的交換性質來分離離子型化合物的一種方法。
⒈ 離子交換劑預處理和裝柱 對於離子交換纖維素要用流水洗去少量碎的不易沉澱的顆粒，以保證有較好的均勻度，對於已溶脹好的產品則不必經這一步驟。溶脹的交換劑使用前要用稀酸或稀鹼處理，使之成為帶H+或OH-的交換劑型。陰離子交換劑常用「鹼-酸-鹼」處理，使最終轉為-OH-型或鹽型交換劑；對於陽離子交換劑則用「酸-鹼-酸」處理，使最終轉為H+型交換劑。洗滌好的纖維素使用前必須平衡至所需的pH和離子強度。已平衡的交換劑在裝柱前還要減壓除氣泡。為了避免顆粒大小不等的交換劑在自然沉降時分層，要適當加壓裝柱，同時使柱床壓緊，減少死體積，有利於解析度的提高。柱子裝好後再用起始緩沖液淋洗，直至達到充分平衡方可使用。
⒉ 加樣與洗脫 加樣：層析所用的樣品應與起始緩沖液有相同的pH和離子強度，所選定的pH值應落在交換劑與被結合物有相反電荷的范圍，同時要注意離子強度應低，可用透析、凝膠過濾或稀釋法達此目的。樣品中的不溶物應在透析後或凝膠過濾前，以離心法除去。為了達到滿意的分離效果，上樣量要適當，不要超過柱的負荷能力。柱的負荷能力可用交換容量來推算，通常上樣量為交換劑交換總量的1％-5％。
洗脫：已結合樣品的離子交換前，可通過改變溶液的pH或改變離子強度的方法將結合物洗脫，也可同時改變pH與離子強度。為了使復雜的組份分離完全，往往需要逐步改變pH或離子強度，其中最簡單的方法是階段洗脫法，即分次將不同pH與離子強度的溶液加入，使不同成分逐步洗脫。由於這種洗脫pH與離子強度的變化大，使許多洗脫體積相近的成分同時洗脫，純度較差，不適宜精細的分離。最好的洗脫方法是連續梯度洗脫，洗脫裝置見圖16-6。兩個容器放於同一水平上，第一個容器盛有一定pH的緩沖液，第二個容器含有高鹽濃度或不同pH的緩沖液，兩容器連通，第一個容器與柱相連，當溶液由第一容器流入柱時，第二容器中的溶液就會自動來補充，經攪拌與第一容器的溶液相混合，這樣流入柱中的緩沖液的洗脫能力即成梯度變化。第一容器中任何時間的濃度都可用下式進行計算：
C＝C2－（C2－C1）（1－V）A2/A1
式中A1、A2分別代表兩容器的截面積：C1、C2分別表示容器中溶液的濃度；V為流出體積對總體積之比。當A1＝A2時為線性梯度，當A1＞A2時為凹形梯度，A1＞A2時為凸形梯度。
洗脫時應滿足以下要求：①洗脫液體積應足夠大，一般要幾十倍於床體積，從而使分離的各峰不致於太擁擠。②梯度的上限要足夠高，使緊密吸附的物質能被洗脫下來。③梯度不要上升太快，要恰好使移動的區帶在快到柱末端時達到解吸狀態。目的物的過早解吸，會引起區帶擴散；而目的物的過晚解吸會使峰形過寬。
⒊ 洗脫餾份的分析 按一定體積（5-10ml/管）收集的洗脫液可逐管進行測定，得到層析圖譜。依實驗目的的不同，可採用適宜的檢測方法（生物活性測定、免疫學測定等）確定圖譜中目的物的位置，並回收目的物。
⒋ 離子交換劑的再生與保存 離子交換劑可在柱上再生。如離子交換纖維素可用2mol/: NaCl淋洗柱，若有強吸附物則可用0.1mol/L NaOH洗柱；若有脂溶性物質則可用非離子型去污劑洗柱後再生，也可用乙醇洗滌，其順序為：0.5mol/L NaOH-水-乙醇-水-20％NaOH-水。保存離子交換劑時要加防腐劑。對陰離子交換劑宜用0.002％氯已定（洗必泰），陽離子交換劑可用乙基硫柳汞（0.005％）。有些產品建立用0.02％疊氮鈉。
⒌ 離子交換層析的應用 離子交換層析技術已廣泛用於各學科領域。在生物化學及臨床生化檢驗中主要用於分離氨基酸、多肽及蛋白質，也可用於分離核酸、核苷酸及其它帶電荷的生物分子。
SephadexG-200食葡聚糖凝膠層析，G後面加一個數字，數字越小的介質交聯度越大，分級范圍越小，而數字越大的介質交聯度越小，分級范圍越大。這些是蛋白質分離技術提純的基本技術，就是分子篩，適合大量蛋白的提純，G-200一般就是分離分子量差距較大的混合物質。
替代方法可能會有超濾，也是截流分子量。HPLC高效液相色譜等分離方法，但是還是離子交換層析法是以具有離子交換性能的物質作固定相，利用它與流動相中的離子能進行可逆的交換性質來分離離子型化合物的一種方法。
⒈ 離子交換劑預處理和裝柱 對於離子交換纖維素要用流水洗去少量碎的不易沉澱的顆粒，以保證有較好的均勻度，對於已溶脹好的產品則不必經這一步驟。溶脹的交換劑使用前要用稀酸或稀鹼處理，使之成為帶H+或OH-的交換劑型。陰離子交換劑常用「鹼-酸-鹼」處理，使最終轉為-OH-型或鹽型交換劑；對於陽離子交換劑則用「酸-鹼-酸」處理，使最終轉為H+型交換劑。洗滌好的纖維素使用前必須平衡至所需的pH和離子強度。已平衡的交換劑在裝柱前還要減壓除氣泡。為了避免顆粒大小不等的交換劑在自然沉降時分層，要適當加壓裝柱，同時使柱床壓緊，減少死體積，有利於解析度的提高。柱子裝好後再用起始緩沖液淋洗，直至達到充分平衡方可使用。
⒉ 加樣與洗脫 加樣：層析所用的樣品應與起始緩沖液有相同的pH和離子強度，所選定的pH值應落在交換劑與被結合物有相反電荷的范圍，同時要注意離子強度應低，可用透析、凝膠過濾或稀釋法達此目的。樣品中的不溶物應在透析後或凝膠過濾前，以離心法除去。為了達到滿意的分離效果，上樣量要適當，不要超過柱的負荷能力。柱的負荷能力可用交換容量來推算，通常上樣量為交換劑交換總量的1％-5％。
洗脫：已結合樣品的離子交換前，可通過改變溶液的pH或改變離子強度的方法將結合物洗脫，也可同時改變pH與離子強度。為了使復雜的組份分離完全，往往需要逐步改變pH或離子強度，其中最簡單的方法是階段洗脫法，即分次將不同pH與離子強度的溶液加入，使不同成分逐步洗脫。由於這種洗脫pH與離子強度的變化大，使許多洗脫體積相近的成分同時洗脫，純度較差，不適宜精細的分離。最好的洗脫方法是連續梯度洗脫，洗脫裝置見圖16-6。兩個容器放於同一水平上，第一個容器盛有一定pH的緩沖液，第二個容器含有高鹽濃度或不同pH的緩沖液，兩容器連通，第一個容器與柱相連，當溶液由第一容器流入柱時，第二容器中的溶液就會自動來補充，經攪拌與第一容器的溶液相混合，這樣流入柱中的緩沖液的洗脫能力即成梯度變化。第一容器中任何時間的濃度都可用下式進行計算：
C＝C2－（C2－C1）（1－V）A2/A1
式中A1、A2分別代表兩容器的截面積：C1、C2分別表示容器中溶液的濃度；V為流出體積對總體積之比。當A1＝A2時為線性梯度，當A1＞A2時為凹形梯度，A1＞A2時為凸形梯度。
洗脫時應滿足以下要求：①洗脫液體積應足夠大，一般要幾十倍於床體積，從而使分離的各峰不致於太擁擠。②梯度的上限要足夠高，使緊密吸附的物質能被洗脫下來。③梯度不要上升太快，要恰好使移動的區帶在快到柱末端時達到解吸狀態。目的物的過早解吸，會引起區帶擴散；而目的物的過晚解吸會使峰形過寬。
⒊ 洗脫餾份的分析 按一定體積（5-10ml/管）收集的洗脫液可逐管進行測定，得到層析圖譜。依實驗目的的不同，可採用適宜的檢測方法（生物活性測定、免疫學測定等）確定圖譜中目的物的位置，並回收目的物。
⒋ 離子交換劑的再生與保存 離子交換劑可在柱上再生。如離子交換纖維素可用2mol/: NaCl淋洗柱，若有強吸附物則可用0.1mol/L NaOH洗柱；若有脂溶性物質則可用非離子型去污劑洗柱後再生，也可用乙醇洗滌，其順序為：0.5mol/L NaOH-水-乙醇-水-20％NaOH-水。保存離子交換劑時要加防腐劑。對陰離子交換劑宜用0.002％氯已定（洗必泰），陽離子交換劑可用乙基硫柳汞（0.005％）。有些產品建立用0.02％疊氮鈉。
⒌ 離子交換層析的應用 離子交換層析技術已廣泛用於各學科領域。在生物化學及臨床生化檢驗中主要用於分離氨基酸、多肽及蛋白質，也可用於分離核酸、核苷酸及其它帶電荷的生物分子。
替代方法也許超濾可以，但只能以此截流固定分子量。高效液相色譜，這個十分方便，但是儀器很貴，如果SephadexG-200等方法可以進行分離，還是比高效液相便宜的......
㈦ 蛋白質分離方法有哪些它們的特點各是什麼
據蛋白質分子大小不同進行分離的方法主要有透析、超濾、離心和凝膠過濾等回。
透析和超濾是答分離蛋白質時常用的方法。
透析是將待分離的混合物放入半透膜製成的透析袋中,再浸入透析液進行分離。超濾是利用離心力或壓力強行使水和其它小分子通過半透膜,而蛋白質被截留在半透膜上的過程。
這兩種方法都可以將蛋白質大分子與以無機鹽為主的小分子分開。
它們經常和鹽析、鹽溶方法聯合使用,在進行鹽析或鹽溶後可以利用這兩種方法除去引入的無機鹽。
由於超濾過程中,濾膜表面容易被吸附的蛋白質堵塞,以致超濾速度減慢,截流物質的分子量也越來越小。所以在使用超濾方法時要選擇合適的濾膜,也可以選擇切向流過濾得到更理想的效果。
㈧ 蛋白質純化所用的柱子有幾種，分別有什麼作用
一、沉澱法
1、 鹽析
實驗原理：中和蛋白質表面電荷並破壞水化膜。
蛋白質易溶於水，因為其分子的-COOH -NH2和-OH都是親水基團，這些基團與極性水分子相互作用形成水化層，包圍於蛋白質分子周圍形成1~100 nm大小的親水膠體，從而削弱了蛋白質分子之間的作用力。當大量鹽加到蛋白質溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的 SO42- 和NH4+）有很強的水化力，可奪取蛋白質分子的水化層，使之"失水"，於是蛋白質膠粒凝結並沉澱析出。
2、等電點沉澱法：
實驗原理：利用蛋白質在等電點時溶解度最低而各種蛋白質又具有不同等電點的特點進行分離的方法。
在等電點時，蛋白質分子以兩性離子形式存在，其分子凈電荷為零(即正負電荷相等)，此時蛋白質分子顆粒在溶液中因沒有相同電荷的相互排斥，分子相互之間的作用力減弱，其顆粒極易碰撞、凝聚而產生沉澱，所以蛋白質在等電點時，其溶解度最小，最易形成沉澱物。
注意點：不同的蛋白質，具有不同的等電點。同一種蛋白質在不同條件下，等電點不同。
3、有機溶劑沉澱法
實驗原理：加入有機溶劑使水溶液的介電常數降低，因而增加了兩個相反電荷基團之間的吸引力，促進了蛋白質分子的聚集和沉澱。
有機溶劑引起蛋白質沉澱的另一種解釋認為與鹽析相似，有機溶劑與蛋白質爭奪水化水，致使蛋白質脫除水化膜，而易於聚集形成沉澱。
影響因素：(一)有機溶劑的選擇 (二)溫度的控制 (三)pH值 (四)離子強度
用此法析出的沉澱一般比鹽析法易過濾或離心沉降，分離後的蛋白質沉澱應立即用水或者緩沖液溶解，以達到降低有機溶劑的濃度的目的。此法在血液製品的制備過程中較多使用。
二、層析
1、離子交換柱層析
實驗原理：以離子交換劑為固定相，依據流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。是發展最早的層析技術之一，目前已成為蛋白質分離純化最常用的手段，是基於蛋白質電荷不同的分離技術。
離子交換層析中，基質是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱之陰離子交換樹脂；而帶有負電荷的稱之陽離子樹脂。陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質，所以這類蛋白質被留在柱子上，然後通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質洗脫下來。結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質，結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。
2、疏水相互作用層析
實驗原理：根據分子表面疏水性差別來分離蛋白質和多肽等生物大分子的一種較為常用的方法。
蛋白質和多肽等生物大分子的表面常常暴露著一些疏水性基團，我們把這些疏水性基團稱為疏水補丁，疏水補丁可以與疏水性層析介質發生疏水性相互作用而結合。不同的分子由於疏水性不同，它們與疏水性層析介質之間的疏水性作用力強弱不同，疏水作用層析就是依據這一原理分離純化蛋白質和多肽等生物大分子的。
3、親和層析
實驗原理：利用蛋白質能和某些專一分子可逆結合的特性，
當蛋白質溶液通過層析柱時，其中可與親和載體配基相互作用的受體被吸附劑結合，不被吸附的無關成分則可隨流出液通過柱體，從而將吸附蛋白與其他蛋白質分開。此法特異性強，收率高。
4、凝膠層析
實驗原理：根據分子大小分離蛋白混合物的最有效的方法之一。混合物隨流動相流經裝有凝膠固定相的層析柱時，其中各物質因分子大小的的不同而被分離的技術。
三、離心
1、速率區帶離心法
實驗原理根據分離的粒子在離心力作用下，因其在梯度液中沉降速度的不同，離心後具有不同沉降速度的粒子處於不同的密度梯度層內，形成幾條分開的樣品區帶，達到彼此分離的目的。
由於此法是一種不完全的沉降，沉降受物質本身大小的影響較大，一般是應用在物質大小相異而密度相同的情況。容量小，只能用於少量的制備。
2、差速離心法
實驗原理：利用樣品中各組分沉降系數的差異，對不同的微粒施以不同的離心力，經過多次離心，離心速度逐步加大，將不同的微粒依次沉降，從而實現離心分離。
四、膜分離
1、超濾法
是利用加壓膜分離技術，在一定的壓力下，使小分子溶質和溶劑穿過一定孔徑的特製薄膜，大分子溶質滯留，從而使大分子物質得到部分的純化。常和離子交換，凝膠過濾聯合使用。
2、透析
是利用小分子經過半透膜擴散到水( 或緩沖液) 的原理，將無機鹽等小分子與生物大分子分開的一種分離純化技術，常和鹽析，鹽溶等方法聯合使用。
㈨ 蛋白質的純化實驗
一、儀器設備
色析管柱 （Pharmacia C column, 1.6×100 cm）、鐵架、鐵夾及水平儀；部分收集器（fraction collector, 需准備干凈試管約100 支）；濃縮用離心機 （低速5,000 rpm）；濃縮用離心管Centriprep-30 （Amicon 4322） 請注意其使用方法。
二、葯品試劑
膠體Sephacryl S-300 （Pharmacia）：a. 預先以緩沖液buffer A-150 平衡好，並且使完全沈降後的膠體體積，佔全部體積的七至八成；要先預估好膠體的使用量。b. 膠體溫度要與操作場所的溫度一致，否則溫度變化會產生氣泡。c. Sephacryl 系列膠體有相當大的吸附力，因此要在緩沖液加入0.15 M 以上的NaCl 以除去非專一性吸附。Buffer A-150:注意使用時的溫度要與管柱膠體的溫度一致標準分子量組合 （Bio-Rad 151-1901）：溶於1 mL 後每組取0.4 mL.含有thyroglobulin （670 kD）， bovine gamma globulin （158 kD）， chicken ovalbumin （44 kD）， equine myoglobin （17 kD）， vitamin B12 （1 350）。
三、管柱裝填
1. 以純水沖洗玻璃管柱 （以純水上下沖洗即可，嚴禁使用試管刷）；並請了解管柱的構造與拆裝方法，垂直架好管柱，以軟管連接部分收集器，並以bufferA-150 試看管路是否通暢；可以用止血鉗或長尾文書夾夾住出口軟管，則可控制溶離的進行。 注意系統的擺設要適當，不要裝置於交通要沖。
2. 依預估量取出Sephacryl 膠體，注意膠體的溫度與緩沖液是否已平衡；將瓶中的膠體上下震盪，使的完全懸浮，但勿產生太多氣泡。
3. 在管柱內加入約10 cm 高緩沖液，然後將膠體慢慢沿著管壁倒入管柱，一直加到管柱頂端，開始流洗後膠體沈降很快。當膠體上方的液面逐漸降低時，可於頂端添加膠體，以達所要高度；膠體高度約90 cm。
4. 膠體完全沈降後，小心以buffer A-150 加滿管柱，關閉出口，裝上頂端端蓋並連通緩沖液瓶，打開出口以重力流洗。 調整緩沖液瓶高度，使流速約每五~六秒一滴，並設定收集體積為2.5 mL/tube。
5. 膠柱流洗約100 mL 後，關閉出口，拆開頂端端蓋，先以滴管吸出膠體上方的溶液到剩約1 cm 高，注意勿破壞膠體表面平整； 然後打開出口，使液面下降至膠體面，再關閉出口，准備注入樣本。
四、樣本色析進行
1. 以微量移液器或滴管吸取樣本 （樣本體積不得超過膠體總體積的3%），沿著膠體上方管壁緩慢加入，注意切勿破壞膠體的平整表面。
2. 打開出口，同時開啟部分收集器；當樣本完全沒入膠體時，關閉出口，緩緩加入與樣本相等體積的buffer A-150，打開出口待其慢慢進入膠體中，如此重復二次。不得擾動膠體表面，造成凹陷。
3. 暫時關閉出口，將液面高度加滿至管柱頂端，並把頂端端蓋鎖上；然後打開出口開始溶離，調整緩沖液瓶的高度，使流速為6 s 一滴。
4. 要留心觀察前面幾個分劃，確定整個系統運轉無礙，小心部分收集器最容易出問題。管柱預計將流洗過夜，收集約80 管。
10） 收集試管，進行蛋白質定量分析以及GUS 活性測定，並請作圖。
5. 收集GUS 活性區，以Centriprep-30 濃縮至10 mL 後，加buffer A-0 稀釋至20 mL，保留100 μL。
6. 管柱請再以buffer A-150 流洗100 mL 後，小心放置一旁，准備以後進行分子量測定。
五、分子量測定
1. 進行分子量測定前一天，請先以buffer A-150 流洗100 mL，並檢查膠柱內有無氣泡產生，若有嚴重的氣泡或乾裂，必須重新裝填管柱。
2. 取標準分子量溶液0.4 mL,加上純質目標酶0.5 mL （以親和層析法所得的AF 部份），如上法注入管柱中，立刻開始進行膠體過濾，並收集各分劃。請依循上述所有管柱及分劃收集器的操作要點。
3. 收集所得，進行蛋白質定量分析，可定出數個蛋白質尖峰，以作為分子量依據；另以目測法，決定紅色高峰的管數，則可定出vitamin B12的溶離管數。利用以上數據，可畫出分子量與溶離管數間的直線關系，作為分子量判定的標准校正線。
4. 同樣的一批分劃，請進行酶活性分析 （GUS），則可定出酶的溶離體積，對照上述標准校正線，則可求出酶的分子量。
六、拆除管柱及保存膠體
1. 若管柱長期不用，應當自管柱中取出膠體，以緩沖液清洗後，置冷藏室中保存，但絕對不要放在冷凍箱中。膠體若裝填太緊，有時可能不易取出，要有耐心地以緩沖液慢慢沖出來。
2. 膠體可以加0.01% NaN3防止黴菌生長，但使用前記得要洗去；再度使用時，請檢查膠體中有無灰黑色黴菌顆粒，若有結塊而不易打散者，也不要使用。