westerna液過濾

❶ Western Blot試驗方面的問題在哪裡可以找到詳細介紹，誰能告訴我一些的生物科技論壇

樓主可以到生物幫那裡了解這方面的信息的。生物幫擁有覆蓋所有實驗領域的精品技術文件，圖文並茂的提供生物領域的學科知識、實驗技術方法與技巧等，協助解決科研工作中相關技術問題。 Western印跡要想做的好，當然每個步驟都不能馬虎 配膠 這些小孔的孔徑隨 「雙丙烯醯胺～丙烯醯胺」 比率的增加而變小，比率接近 1：20 時孔徑達到最小值。SDS聚丙烯醯胺凝膠大多按「雙丙烯醯胺～丙烯醯胺」為1：29 配製，試驗表明它能分離大小相差只有3% 的蛋白質。 分離膠及濃縮膠均可事先配好(除AP及TEMED外)，過濾後作為儲存液避光存放於4℃，可至少存放1個月，臨用前取出室溫平衡(否則凝膠過程產生的熱量會使低溫時溶解於儲存液中的氣體析出而導致氣泡，有條件者可真空抽吸3分鍾)，加入10%AP(0.7~0.8:100, 分離膠濃度越高AP濃度越低，15%的分離膠可用到0.5:100)及TEMED(分離膠用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，濃縮膠用0.8：1000) PAGE配膠的試劑和配方比例對電泳結果的質量當然有決定性的影響，這個配膠的比例，在《分子克隆》上有詳細的論述，相信大家都不難查到。容易忽視的問題主要在於過硫酸銨(AP)一定要新鮮——最好用小指管配AP(寫日期)保存在-20度，超過2周的AP扔掉算了，或者已經反復打開使用多次的AP都別用， 灌入2/3的分離膠後應立即封膠，膠濃度<10%時可用0.1%的SDS封，濃度>10%時用水飽和的異丁醇或異戊醇，也可以用0.1%的SDS。封膠後切記，勿動。 如用醇封膠需用大量清水及ddH2O沖洗干凈，然後加少量0.1%的SDS，目的是通過降低張力清除殘留水滴 10%的AP最好現配現用，如在4℃存放勿超過兩周。30%的丙烯醯胺如有沉澱，最好棄掉 過硫酸銨(APS)(10%;w/v) 取3g過硫酸銨，溶於去離子水，至終體積為30mL。此溶液4℃下在短暫的數日內是穩定的，但建議，對每一組新膠均應新鮮配製 但搖動溶液時不要過於劇烈以免引入過多地氧氣 可以到生物幫那裡詳細的了解一下，我找到了相關專題，可以幫到你。 please click to connect www.bio1000.com/zt/protein/214560.html . can help you 樣品處理 先制備蛋白樣品，後灌注壓縮膠，壓縮膠灌注後應在20~40min內使用。 上樣前蛋白樣品最好離心，上樣量不宜過多，以免看結果時，每個條帶都彎彎地「笑」你貪多嚼不爛哦。其他的操作，按照說明控制電流，不要過多重復使用電泳Buffer(別小氣，重復使用會降低緩沖能力的)，好像基本不會出問題了。當預染的Marker告訴你，你要分辨的蛋白已經到達最佳分辨區——分離膠的2/3處，OK，電泳結束了。 電泳樣品假如樣品緩沖液後,要在沸水中煮3-5分鍾使SDS與蛋白質充分結合形成SDS-蛋白質復合物 溴酚藍指示劑是一個較小的分子,可以自由通過凝膠孔徑,所以它顯示著電泳的前沿位置,當指示劑到達凝膠底部時,即可停止電泳. 另外樣品處理液中也可加入適量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加樣時樣品溶液可以沉入樣品加樣槽底部. 樣品制備是關鍵步驟，要求盡可能的獲得所有蛋白質，應注意以下問題： 1：在合適的鹽濃度下，應保持蛋白質的最大溶解性和可重復性。 2：選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價結合的蛋白質復合物和共價鍵二硫鍵，使其形成一個各自多肽的溶液。 3：盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子。 4：防止蛋白質在樣品處理過程中的人為的修飾，制備過程應在低溫下進行，以避免細胞破碎釋放出的各種酶類的修飾(建議加入合適的蛋白酶抑制劑) 5：樣品建議分裝成合適的量，然後冷凍乾燥或直接以液體狀態置-80℃中保存，但要注意不要反復凍融。 電泳 所有蛋白樣品調至等濃度後上樣，樣品兩側的泳道用等體積的1×loading buffer上樣，Marker也用1×loading buffer調整至與樣品等體積 低電壓短時間的預電泳(恆壓10-20V,20-30min)，清除凝膠內的雜質，疏通凝膠孔徑以保證電泳過程中電泳的暢通 以初始電壓為45V時的電流強度進行穩流電泳，當電壓達65V時改為穩壓電泳 注意加樣時間要盡量短，以免樣品擴散，為避免邊緣效應，可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液 凝膠上所加電壓為8V/cm。當染料前沿進入分離膠後，把電壓提高到15V/cm 轉膜 由於轉膜過程中的氣泡問題對於實驗結果有很大的影響 切記：每層之間用滴管將其中的氣泡全部趕出，決不允許氣泡存在。 將PVDF膜先在甲醇中浸泡幾分鍾,再轉移到轉膜緩沖液中處理15min。 PVDF膜，125-200 ug/cm2(適合於SDS存在下與蛋白質的結合) 另外提醒一句：由於NC膜上結合的蛋白會因為一些去污劑而被代替，因此在封閉時最好使用較溫和的Tween20，而且濃度不要超過0.3%(據說0.05%效果最好) PVDF膜特別注意的是需要100%甲醇預處理(不超過15秒)再用緩沖液平衡，才能用 如果WB前沒有可參考的資料——比如不知道是否有表達，比如抗體少還要摸條件(稀釋度)，可以用剪膜剩下的邊角料來先做幾組點雜交摸條件，省點時間省點試劑; 切個小角是常用的方法。膜上要做好標記，識別正反面和上下 膜徹底浸潤後顏色會變深一點，任何白點或者斑都是沒有完全浸潤的標志，會影響轉膜的 半干電轉移要防止過熱 轉膜後，膜上其他的空白位置需要用封閉液封閉。Western的靈敏度某種程度上受限於封閉做的好不好 切記。封閉時間和封閉劑的量都要足夠。封閉不完全，後面就全白忙活了

❷ 溶液過濾示意圖

過濾常用的儀器有玻璃棒、燒杯、鐵架台、漏斗，過濾時要注意以下幾點： 一貼，版即濾紙緊貼漏斗權內壁； 二低，即漏斗內濾紙邊緣低於漏鬥口邊緣，漏斗內液面低於濾紙邊緣． 三靠，即傾倒液體時，盛渾濁液的燒杯嘴緊靠玻璃棒；玻璃棒末端輕靠漏斗內三層濾紙處；漏斗下端緊靠承接濾液的燒杯內壁． 為了防止液體外流，要用玻璃棒引流，使液體沿玻璃棒緩慢倒入漏斗中；為了防止液體濺出，漏斗下端要緊靠燒杯內壁，這兩項在圖示可以看出． 故答案為：（1）鐵架台；燒杯；漏斗； （2）①未用玻璃棒引流；②漏斗下端未緊靠燒杯內壁． 分析： 依據過濾所用的儀器有鐵架台、燒杯、漏斗、玻璃棒；過濾時的注意事項（一貼、而低、三靠），再觀察圖示解答即可． 點評： 正確實驗的同時還要了解所用的儀器，圖示改錯首先考慮「三靠」，因為這些操作在圖中可以看出．

❸ western 的步驟

1）按廠商的使用指南用兩塊干凈的玻璃，平板和0.75mm墊片組裝電泳裝置中的玻璃平板夾層，並固定在灌膠支架上。
2）按表7.1配製分離膠液體並脫氣，然後加入10%的過硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌混勻。
表7.1 聚丙烯醯胺分離膠的配製
試劑成分 配製不同濃度分離膠所需試劑(ml)
5% 8% 10% 12% 15%
Acry:Bis (30:0.8) 2.50 4.00 5.00 6.00 7.50
4×Tris·Cl/SDS, pH8.8 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75
H2O 8.75 7.25 6.25 5.25 3.75
10%過硫酸銨 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
TEMED 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01
按所需分離的蛋白質分子大小選擇合適的丙烯醯胺百分比濃度，一般地，5%的凝膠可用於60～200kDa的SDS變性蛋白質分子的分離，10%用於16～70kDa，15%用於12～45kDa。
3）用一根巴斯德吸管立即將分離膠液體沿夾層中一條墊片的邊緣加入於玻璃平板夾層中，至凝膠約5cm高為止。樣品體積少於10μl不需灌制積層膠。
4）用另一根巴斯德吸管，先從一邊的墊片，再從另一邊墊片往夾層的液面頂部緩緩加入一層水飽和異丁醇（厚約1cm）。讓凝膠在室溫聚合30min。
聚合後，可見在頂層異丁醇與凝膠的界面間有一清晰的折光線，膠的聚合失敗往往問題在於過硫酸按或TEMED，或兩者都有。
5)傾去頂層的異丁醇，並以1×Tris-Cl/SDS, pH8.8緩沖液沖洗凝膠的頂部表面,盡量用吸水紙吸干。
6)按表7.2配製積層膠液體，用吸管將液體沿一條墊片加入到玻璃平板夾層，直至夾層的頂部。
表7.2 聚丙烯醯胺積層膠的配製
GEL%（3.9%) Total (10.05ml)
Acry:Bis(30:0.8) 1.30 ml
4×Tris·Cl/SDS, pH6.8 2.50 ml
H2O 6.10 ml
10%過硫酸銨 0.05 ml
TEMED 0.01 ml
7)將0.75mm厚的梳子插入夾層的積層膠液體中，必要時，再補加積層膠液體充盈剩餘空間。讓積層膠室溫聚合30min。
8)在具螺口蓋的微量離心管中，用2×SDS加樣緩沖液按1:1(v/v)稀釋待測蛋白質樣品，於100℃煮沸5-10min。如樣品是蛋白質沉澱物，加入50～100μl 1×SDS加樣緩沖液溶解之，並同樣在100℃煮沸5-10min。按供應商的使用指南用2×SDS加樣緩沖液溶解蛋白質分子量標准混合物。
對於0.3cm寬的加樣孔，推薦加樣體積以不超過20μl 為宜。用考馬斯亮藍染色法顯跡，成分很復雜的蛋白質混合物需加25～50μg，而樣品中只有一種或不多的幾種蛋白的話，只需1～10μg蛋白量。採用銀染顯跡時，樣品用量可減小10～100倍（按樣品的復雜程度在小於20μl的體積溶有0.01～0.5ng蛋白樣品不等）。
2×SDS加樣緩沖液(loading buffer)配製：
成分 體積 (ml)
0.5M Tris·Cl (pH6.8) 12.5
20%SDS 11.5
Glycerin 10
2% Blue-Bromo-phenol 2.5
β-mercaptoethanol * 5.0
加H2O至總體積50 ml，分裝
*β-mercaptoethanol 在臨用前加入。
9）小心拔出梳子，避免撕裂聚丙烯醯胺凝膠加樣孔。取出梳子後，以1×SDS電泳電泳緩沖液沖洗加祥孔，並以此緩沖液充滿之。
10）按廠商指南將凝膠板固定到電泳裝置的上緩沖液室（上槽），同時往下緩沖液室（下槽）加入推薦量的1×SDS電泳緩沖液。
11）將固定於上槽的凝膠板放入下槽中，並往上槽加入部分電泳緩沖液至剛好淹沒凝膠的加樣孔。
12）用帶平嘴針頭的50μl注射器將同樣濃度的蛋白質樣品等體積加入到樣品孔中，小心加樣使樣品在孔的底部成一薄層，對照孔加入蛋白質分子量標准樣品，如有空置的加樣孔，須加等體積的空白1×SDS樣品緩沖液，以防相鄰泳道樣品的擴散。
13)再往上槽加入餘下的1×SDS電泳緩沖液。此操作緩慢小心，以防沖起樣品孔中的樣品。
14）連接電源，對於0.75mm厚的垂直板電泳，先在60V下電泳至溴酚藍染料從積層膠進入分離膠，再將電壓調至120V繼續電泳至溴酚藍到達凝膠底部為止。
15）關閉電源並撤去連接的導線，棄去電泳緩沖液。連同上槽一起將凝膠夾層取出。
16）將凝膠定位以便識別加樣的順序，將凝膠板從上槽解離出來，放在一疊吸水紙或紙巾上。
17）小心將封邊的墊片抽出一半，並以此為杠桿橇起上面的玻璃平板，使凝膠暴露出來。
18）小心從下面的玻璃平板上移出凝膠，在凝膠的一角切去一小塊以便在染色及干膠後仍能認出加樣次序，接著就可進行蛋白質的檢測。
19)轉膜
將凝膠面與負極相連，硝酸纖維素膜與正極相連。（100V，1小時）要放於4℃。
20)、清洗
將硝酸纖維素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分鍾。搖床搖動。
21)、封閉
22)、一抗孵育
一抗用TBST1:1000稀釋，將硝酸纖維素膜放入其中，37℃孵育1.5小時，(或4℃過夜)搖床搖動。
23)、清洗
將硝酸纖維素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分鍾。
24)、二抗孵育
二抗用TBST1:8000稀釋，將硝酸纖維素膜放入其中，37℃孵育1小時，搖床搖動。
25)、清洗
同22，之後，用1X TBS在清洗2次，每次5分鍾，以洗去膜上的Tween 20，因為它可以阻礙底物的沉積。
26)、顯色
按如下配方配製顯色液：
1mL水+1滴（大約50微升）試劑A(之後混勻)+1滴試劑B+1滴試劑C
將硝酸纖維素膜放入其中孵育，一旦顯色，立即放入去離子水中終止反應。

❹ 熒光western blot應注意些什麼

熒光western blot注意事項

1. 抗體濃度應當優化，在幾種不同稀釋度的抗體中孵育膜。選擇信噪比最高的稀釋度。

2. 從化學發光轉到熒光檢測時，一抗濃度應當增加

3. 許多封閉液都成功用於熒光檢測。建議使用5% 酪蛋白、最多5%的脫脂奶粉，或最多3% BSA，溶於TBST中。

4. 緩沖液中的顆粒可能停留在膜上，並造成熒光假象。只使用高質量的試劑，並對所有緩沖液過濾滅菌。

5. 使用鈍的鑷子從邊緣操作。避免劃破膜或弄皺，這會在熒光檢測時造成假象。

6. 使用鉛筆來標記膜，因為許多墨水都會發出熒光。

7. 溴酚藍會發出熒光。確保染料與樣品已分開，切掉凝膠上包含染料的部分，或省掉樣品緩沖液中的溴酚藍。

8. 無需在暗處開展免疫檢測；正常的室內燈光不會使熒游標記的抗體發生光漂白。

9. 在處理膜時，使用無粉末的手套，以避免膜上出現假象或指紋。

❺ western blotting 的過程和原理

什麼理論過程？就是原理唄？
WesternBlot原理、顯色分類及操作步驟
一、原理
與Southern或Northern雜交方法類似，但WesternBlot採用的是聚丙烯醯胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，「探針」是抗體，「顯色」用標記的二抗。經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用於檢測蛋白水平的表達。既可以定性，又可以半定量的Western是初步鑒定蛋白質最方便也是最通用的方法。
western顯色的方法主要有以下幾種：
i.放射自顯影
ii.底物化學發光ECL
iii.底物熒光ECF
iv.底物DAB呈色
現常用的有底物化學發光ECL和底物DAB呈色，體同水平和實驗條件的是用第一種方法，目前發表文章通常是用底物化學發光ECL。只要買現成的試劑盒就行，操作也比較簡單，原理如下（二抗用HRP標記）：反應底物為過氧化物+魯米諾，如遇到HRP，即發光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。
二、操作步驟：
(一)配膠
1、注意一定要將玻璃板洗凈，最後用ddH2O沖洗，將與膠接觸的一面向下傾斜置於干凈的紙巾晾乾。
分離膠及濃縮膠均可事先配好（除AP及TEMED外），過濾後作為儲存液避光存放於4℃，可至少存放1個月，臨用前取出室溫平衡（否則凝膠過程產生的熱量會使低溫時溶解於儲存液中的氣體析出而導致氣泡，有條件者可真空抽吸3分鍾），加入10%AP（0.7~0.8:100,分離膠濃度越高AP濃度越低，15%的分離膠可用到0.5:100）及TEMED（分離膠用0.4:1000,15%的可用到0.3:1000，濃縮膠用0.8：1000）即可，如室溫較低可升高10%AP及TEMED濃度到《分子克隆》建議濃度。
2、封膠：
灌入2/3的分離膠後應立即封膠，膠濃度＜10%時可用0.1%的SDS封，濃度＞10%時用水飽和的異丁醇或異戊醇，也可以用0.1%的SDS。封膠後切記，勿動。
待膠凝後將封膠液倒掉，如用醇封膠需用大量清水及ddH2O沖洗干凈，然後加少量0.1%的SDS，目的是通過降低張力清除殘留水滴。片刻後倒掉SDS，將玻璃板倒立放置片刻控凈。
3、灌好濃縮膠後1h拔除梳子，注意在拔除梳子時宜邊加水邊拔，以免有氣泡進入梳孔使梳孔變形。撥出梳子後用ddH2O沖洗膠孔兩遍以去除殘膠，隨後用0.1%的SDS封膠。若上樣孔有變形，可用適當粗細的針頭撥正；若變形嚴重，可在去除殘膠後用較薄的梳子再次插入梳孔後加水拔出。30min後即可上樣，長時間有利於膠結構的形成，因為肉眼觀的膠凝時其內部分子的排列尚未完成。
(10%的AP最好現配現用，如在4℃存放勿超過兩周。30%的丙烯醯胺如有沉澱，最好棄掉.)
(二)樣品處理
1．培養的細胞（定性）：
⑴去培養液後用溫的PBS沖洗2~3遍（冷的PBS有可能使細胞脫落）。
⑵對於6孔板來說每孔加200~300μl，60~80℃的1×loadingbuffer。
⑶100℃，1min。
⑷用細胞刮刮下細胞後在EP管中煮沸10min，期間vortex2~3次。
⑸用干凈的針尖挑絲，如有團塊則將團塊棄掉，如果沒有團塊但有拉絲現象，則可以將EP管置於0℃後在14000~16000g離心2min，再次挑絲。若無團塊也無絲狀物但溶液有些粘稠，可通過使用1ml注射器反復抽吸來降低溶液粘滯度，便於上樣。
⑹待樣品恢復到室溫後上樣。
2．培養的細胞（定量）：
⑴去培養液後用溫的PBS沖洗2~3遍（冷的PBS有可能使細胞脫落）。
⑵加入適量的冰預冷的裂解液後置於冰上10~20min。
⑶用細胞刮刮下細胞，收集在EP管後超聲（100~200w）3s，2次。
⑷12000g離心，4℃，2min。
⑸取少量上清進行定量。
⑹將所有蛋白樣品調至等濃度，充分混合沉澱後加loadingbuffer後直接上樣最好，剩餘溶液（溶於1×loadingbuffer）可以低溫儲存，-70℃一個月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上樣前98℃，3min。
3．組織：
⑴勻漿對於心肝脾腎等組織可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手動或電動勻漿。注意盡量保持低溫，快速勻漿。
⑵12000g離心，4℃，2min。
⑶取少量上清進行定量。
⑷將所有蛋白樣品調至等濃度，充分混合沉澱加loadingbuffer後直接上樣最好，剩餘溶液（溶於1×loadingbuffer）可以低溫儲存，-70℃一個月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上樣前98℃，3min。
(裂解液配方：Tris-Cl(pH7.4)20mM，EDTA1mM
由於蛋白酶抑制劑可影響蛋白定量，且新鮮蛋白很少降解，故可不加，如加按建議比例即可。提取磷酸化的蛋白還需加Na3VO40.1mM及NaF25mM）。
1×loadingbuffer配方：10%甘油，50mMTris•Cl(pH6.8)，2%β-巰基乙醇，0.2~0.5‰溴酚藍，2%或5%的SDS。Buffer可配成2×~5×，注意SDS終濃度勿超過10%。
對於心臟，肌肉等碎屑較多的組織可用5%的SDS，肝腎等組織2%即可。)
(三)電泳
1．上樣前將膠板下的氣泡趕走。
2．所有蛋白樣品調至等濃度後上樣，樣品兩側的泳道用等體積的1×loadingbuffer上樣，Marker也用1×loadingbuffer調整至與樣品等體積。
2．以初始電壓為45V時的電流強度進行穩流電泳，當電壓達65V時改為穩壓電泳。
3．在目的蛋白泳動至距膠下緣1cm以上結束。
電泳液配方：Tris-base3g,glycine14.4g,0.1%SDS（10ml10%SDS）/L
Tris-base1.5g,glycine7.2g,0.1%SDS（5ml10%SDS）/0.5L
(四)轉膜
1．電泳結束前20分鍾左右戴上手套開始准備：
濕轉使用常規電轉液：Tris3.0g，Gly14.4g，M-OH200ml，加去離子水至1,000ml。干轉則取此轉移液，每50ml加入10%SDS180ul。
浸泡NC膜：將NC膜平鋪於去離子水面，靠毛細作用自然吸水後再完全浸入水中10min以排除氣泡，隨後浸泡入轉移液中。PVDF膜則在M-OH中浸泡20min以上後轉入轉移液中。將濾紙也浸入轉移液中。
2．取膠：
將膠卸下，保留30-100KD或分子量范圍更廣些的膠（以便以後雜其他感興趣的蛋白），左上切角，在轉移液中稍稍浸泡一下，置於潔凈玻璃板上，按順序鋪上膜與每側一張（干轉每側三張）濾紙。注意用玻棒逐出氣泡，剪去濾紙與膜的過多部分（尤其是干轉，以防止短路）
3．轉膜：
濕轉：電轉槽用去離子水淋洗晾乾，加入1,000ml電轉液。將膠平鋪於海綿上，滴加少許電轉液再次驅趕氣泡，封緊後放入電轉槽，注意膜在正極一側。降溫，將電泳槽置於冰水混合物中。恆流100mA過夜，或400mA，4h。注意不同蛋白的要求不同。
干轉：用電轉液淋洗石墨電極，濾紙吸干，鋪上膠，再滴少許電轉液，以1.5mA/cm2凝膠面積轉移1-2小時。負載電壓不宜超過1V/cm2膠面積。
電轉液配方：Tris-base3g,glycine14.4g,200ml甲醇/1L
(五)封閉及雜交
1．封閉：
將膜從電轉槽中取出，去離子水與PBST或TTBS稍加漂洗，浸沒於封閉液中緩慢搖盪一小時。必要時可先用麗春紅染色（2%乙酸，0.5%麗春紅的水溶液）觀察蛋白條帶，再用去離子水和TTBS將麗春紅洗脫後封閉，如用蛋白marker則可省略此步。
2．結合一抗：
一抗的准備：使用反貼法時每張3×9cm2膜約需2ml一抗稀釋液。
反貼法的操作：含一抗的封閉液滴加於搖床的塑料膜上，將Western膜從封閉液中取出，濾紙貼角稍吸干，正面朝下貼在一抗上，注意不要留下氣泡，室溫下輕搖孵育一小時或4℃靜置過夜。在反應體系外面罩一濕潤平皿以防止液體過多蒸發。
3．洗滌：
一抗孵育結束後，用PBST或TTBS漂洗膜後再浸洗三次，每次5-10min。
4．結合二抗：
根據一抗來源選擇合適的二抗，根據鑒定方法選擇HRP或AP標記的抗體，按相應比例稀釋（1:1000~1:10000），室溫輕搖一小時。
5．洗滌：
二抗孵育結束後，用PBST或TTBS漂洗膜後再浸洗三次，每次5-10min。
PBST：1×PBSTTBS：Tris-HCl20mM,pH7.4(25℃)
Tween-200.01%~0.02%NaCl150mM
Tween-200.05%
封閉液與抗體溶劑均為含5%脫脂奶粉的PBST或TTBS，臨用時取200mlPBST或TTBS加入10g脫脂奶粉即為封閉液。
(六)發光鑒定
一般使用辣根過氧化物酶HRP-ECL發光法或鹼性磷酸酶AP-NBT/BICP顯色法。
1．HRP-ECL發光法：
將A、B發光液按比例稀釋混合。膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆於A、B混合液滴上，熄燈至可見淡綠色熒光條帶（5min左右）後濾紙貼角吸干，置於保鮮膜內固定於片盒中，迅速蓋上膠片，關閉膠盒，根據所見熒光強度曝光。取出膠片立即完全浸入顯影液中1-2min，清水漂洗一下後放在定影液中至底片完全定影，清水沖凈晾乾，標定Marker，進行分析與掃描。
2．AP-NBT/BICP顯色法：
每片NBT/BICP可溶解於30ml水中，使用前將一片分裝在30個EP管中，每張3×9cm的膜取一管配成1ml即可。將PBST或TTBS洗滌過的膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆於NBT/BICP溶液液滴上，並用不透明物體（如報紙）遮擋光線，顯色20s後每10s觀察一次，至條帶明顯或有本底出現時將膜揭起置去離子水中漂洗後放濾紙上晾乾即可觀察與掃描。
背景深淺與一抗的質量及二抗的量有關，當然如果暴光時間長達半小時，出現背景是正常的。
三、注意事項：
增強敏感性
若目的條帶未出現，或很淡，可試用以下方法增強發光強度：
用清水漂洗膜數分鍾，重加發光液進行曝光，可延長曝光時間。
將膜在PBST或TTBS中洗滌30min或更長，期間至少換2次液。
封閉40~60min
一抗雜交，室溫1h。37℃1h會更強，但可能增加非特異條帶。
PBST或TTBS洗膜20min，期間換2次液。
二抗雜交，37℃1h。
PBST或TTBS洗膜20min，期間換2次液。
發光鑒定。
若條帶仍未出現或很淡，可以再用PBST或TTBS洗滌膜20min，期間換2次液。
10．三抗雜交，室溫1h。37℃1h會更強，但可能增加非特異條帶。三抗即抗二抗的二抗，比如二抗用羊抗兔，此時三抗可以選擇兔抗羊或鼠抗羊等。
11．PBST或TTBS洗滌膜20min，期間換2次液。
12．發光鑒定。
一抗溶液中加入0.2%疊氮鈉後可4℃存放至少2周（一個月我也用過，沒問題，再長時間還沒試）
(七)NC膜的多次使用
一張NC膜可使用多次，對多種蛋白進行雜交，步驟與「七．增強敏感性」相近。
如前次雜交結果條帶距離本次雜交的蛋白的預計位置差別較大則只需用PBST洗滌掉發光液（10min×3次）後從一抗雜交開始，後續步驟同前。
如前次雜交結果條帶距離本次雜交的蛋白的預計位置較近則需更強的洗滌，可用strip液（可用雜交袋）於室溫搖動洗滌30min~60min，然後用PBST洗滌10min×3次，再從封閉開始，後續步驟同前。
對於雜交若干次的膜，如果常規洗滌方法不易去掉眾多條帶，可用強度更強的自配的strip液（可用雜交袋）於50℃洗滌30min，然後用PBST洗滌10min×3次，再從封閉開始，後續步驟同前。

❻ 有人有western blot的Tris-乙酸膠的配方嗎還有相關電泳液的配方急！急！急！非常感謝！

一、SDS-PAGE電泳所用溶液：

1）30 %聚丙烯醯胺溶液 (100 mL)

丙烯醯胺 (Arc) 29 g

N,N』-亞甲雙丙烯醯胺 (Bis) 1 g

用雙蒸水定容至100mL，過濾備用，4℃存放

丙稀醯胺29.2g，N-N-甲叉雙丙稀醯胺0.8g，加入去離子水定容至100mL，pH值不能超過7.0，過濾於棕色玻璃瓶中4℃貯存。

2）5×Tris-甘氨酸緩沖液 (1 L)

Tris鹼 15.1 g

甘氨酸(電泳級) 94 g

10 %SDS 50 mL

使用時稀釋5倍使用

3）2×SDS凝膠加樣緩沖液(10mL)

0.5 mol/L Tris-Cl (pH 6.8) 2 mL

10％(W/V)SDS 4 mL

甘油 2 mL

β-巰基乙醇 1.0 mL

(DTT（二硫蘇糖醇） 0.31g)

溴酚蘭 0.02g

雙蒸水 0.5 mL

室溫存放備用

4）考馬斯亮藍染色液

考馬斯亮藍R-250 （G-250） 1.0 g

甲醇 450 mL

冰醋酸 100 mL

ddH₂O 450 mL

0.2g考馬斯亮藍R250+84mL 95％乙醇+20mL冰醋酸，定容至200mL，過濾備用

5）考馬斯亮藍脫色液（甲醇脫色液效果好，但有毒性）

甲醇 100 mL

冰醋酸 100 mL

ddH₂O 800 mL

醫用酒精：冰醋酸：水=4.5：0.5：5(V：V：V)

二、SDS-PAGE所需溶液:

A液——30％丙稀醯胺（W/V）：丙稀醯胺29.2g，N-N-甲叉雙丙稀醯胺0.8g，加入去離子水定容至100mL，pH值不能超過7.0，過濾於棕色玻璃瓶中4℃貯存。B液——1.5mol/L Tris·HCl，pH8.8：18.17g（9.09g）Tirs鹼，溶於80mL（40mL）去離子水中，加入約3mL(1.5mL)以上的濃鹽酸調節pH值至8.8，定容至100mL（50mL）。C液——1.5mol/L Tris·HCl，pH6.8：12.1g（6.05g）Tirs鹼，溶於80mL（40mL）去離子水中，加入約7mL(3.5mL)以上的濃鹽酸調節pH值至6.8，定容至100mL（50mL）。D液——10％SDS：10g (2g)SDS溶於去離子水中，定容至100mL(20mL)，加熱至68℃助溶。E液——10％過硫酸銨：5g(0.5g)過硫酸銨，溶於50mL(5mL)去離子水中；現配現用或分裝至0.5mL離心管中冷凍備用。

F液——TEMED(N-N-N`-N`－四甲基乙二胺)原液，室溫保存。

三、配製Tris-甘氨酸SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳分離膠所用溶液

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