怎樣過濾血清

⑴ 全血分離獲得血清的方法及步驟 謝謝

材料與方法

1.1 血清採集 MG患者全血來自～2005年就診於遼寧中醫學院附屬醫院的門診患者。根據典型臨床表現、新斯的明試驗、低頻重復電刺激及單纖維肌電圖等確診，無其他自身免疫性疾病，未經其他免疫抑制治療，並參照1994年版《中醫病證診斷療效標准》辨證為脾腎虛型。正常人血清取自同時期健康志願者。-70 ℃冰箱冷凍保存備用。

1.2 主要試劑 固相pH梯度干膠條IPG strip（Amersham公司產品， 非線性pH 3～10， 7 cm）。3-〔3-（膽醯胺基丙基）二甲氨基〕丙磺酸鹽｛3-〔（3-cholamidopropyl） dimethylamino〕-1-propanesul-fonate， CHAPS｝，二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol， DTT），三丁基膦（tributyl phosphine， TBP），尿素，硫脲，碘乙醯胺（iodoacetamide， IAA），丙烯醯胺（acrylamide）、甲雙丙烯醯胺（N， N'-methylenebi-sacrylamide），四甲基乙二胺（N， N， N， N-tetram-ethyl-ethylenediamine， TEMED），過硫醯胺（am-monium persulfate， APS），三羥甲基氨基甲烷〔tris （hydroxymethyl） aminomethane〕、甘氨酸（glycine， Gly）和十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate， SDS）均為Bio-Rad公司產品。瓊脂糖為華美生物公司產品。其他試劑均使用國產分析純試劑。所有溶液均用MilliQ水配製。

1.3 主要儀器 高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司產品;EttanTMIPGphorⅡ，Amersham Biosci-ences公司產品;P-2000分光光度儀，Hitachi公司產品;SE-600電泳儀，Amersham公司產品;純水裝置，Millipore公司產品;GS-710光密度掃描儀，Bio-Rad公司產品;冷卻水循環系統，Cole-Parmer公司產品;Bruker-Daltonics AutoFlex TOF-TOF LIFTMass Spectrometer，美國Bruker-Daltonics公司產品;LCQ Deca XP Plus，美國Thermo Finnigan公司產品。

1.4 雙向電泳

1.4.1 血清總蛋白質的提取及定量 血清-70 ℃反復凍融4次後，用Agilent Multiple Affinity Re-moval Column處理去除高豐度蛋白。使用Agilent 5K超濾管進行濃縮除鹽，凍干回收的樣品，-70 ℃保存。用裂解液（9 mol/L 尿素、4% CHAPS、 65 mmol/L DTT和cocktail酶抑制劑）進行復溶，並採用考馬斯亮藍法進行蛋白質定量。

1.4.2 等電聚焦 自-20 ℃取出的膠條，室溫下平衡10 min，以500 μg上樣量在每份樣本中加入上樣緩沖液（8 mol/L尿素、2% CHAPS、1% Bio-lyte和1% TBP）以及標准蛋白質分子，上樣於泡脹槽中，加入礦物油覆蓋。程序設置如下:30 V 12 h，500 V 1 h，1 000 V 1 h，8 000 V 6 h。恆溫20 ℃。等電聚焦電泳後IPG膠條在平衡液1（Tris-base 50 mol/L 、尿素 6 mol/L、甘油 30%、SDS 2%、溴酚藍0.002%和DTT 100 mg）中於振盪器上振盪 15 min; 然後置入平衡液2（成分同平衡液1，用 400 mg 碘乙醯胺代替100 mg DTT）同樣於振盪器上振盪15 min。

1.4.3 SDS-PAGE垂直電泳 採用12.5%的均勻SDS2聚丙烯醯胺凝膠（水23.2 ml，30%丙烯醯胺溶液32.46 ml，1.5 mol/L Tris-HCl緩沖液pH 8.8 20 ml，10% SDS 0.8 ml，10% APS 0.4 ml，TEMED 3.76 μl，膠總體積80 ml）。將平衡後的IPG膠條移至凝膠的上方，膠條一端放入低分子量蛋白質標准，0.5%的瓊脂糖封膠。上下槽加入電極緩沖液（Tris 5 mmol/L，Gly 192 mmol/L和SDS 0.1%）。初始電流為每塊膠40 mA，電泳20 min，然後以每塊膠60 mA電流，直至溴酚藍前沿。

1.4.4 銀染色 電泳結束後，採用硝酸銀染色法，通過固定，硝酸銀染色，顯影，停顯及脫色，至背景清晰。

1.5 圖像分析 每個樣品常規進行3次二維電泳，用GS-710光密度掃描儀對電泳後的膠圖分別進行掃描，所得掃描圖像輸入計算機，採用Image-master軟體對圖像進行背景消減、蛋白質點檢測和校正，獲取蛋白質點的位置坐標和表達量等分析。選取 Ratio ≥1.5的蛋白質點認為有差異。所有數據的統計分析均採用SPSS 12.0軟體，統計學分析採用 t 檢驗。

1.6 基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜分析 用手術刀片切下膠上目標條帶，進行切膠、膠上胰蛋白酶酶解 20 h ，抽提酶解肽段，Zip Tip脫鹽後點樣，行基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜（matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry， MALDI-TOF-MS）分析（飛行管長2.7 m，加速電壓 20 kV ，反射電壓23 kV）。將第1級質譜得到的肽片段質量指紋圖譜、肽質量指紋圖譜與第2級質譜得到的肽序列信息一起用來檢索蛋白質資料庫，找出匹配的蛋白質。

1.7 資料庫檢索 將質譜鑒定所得的肽質量指紋譜（peptide mass fingerprinting， PMF）數據於Bio-Works（Thermo Finnigan， San Jose， CA）軟體搜索相應的庫。搜索使用的資料庫為IPI human蛋白庫（SEQUEST結果過濾參數為:當Charge+1，Xcorr≥1.9;當Charge+2，Xcorr≥2.2;當Charge+3，Xcorr≥3.75;其中DelCN≥0.1）以及NCBI上 Homo sapiens的非冗餘蛋白庫（rendant data-base）。檢索參數為胰蛋白酶解;氨基酸固定修飾方式為脲甲基半胱氨酸;模式為單同位素峰;肽片斷最大誤差控制在100 ppm;肽片斷最大分子量誤差為±0.5 Da;每個肽允許有1個不完全裂解位點。

2 結果

2.1 脾腎虛型重症肌無力患者血清雙向電泳圖譜 的建立及分析 經2-DE技術及銀染色後，得到了兩組血清的雙向凝膠電泳圖，並於相同的條件下重復實驗3次。在正常對照組細胞蛋白質組雙向電泳圖譜上可觀察到1 463±179個蛋白點，而脾腎虛型重症肌無力組可見到1 508±89個蛋白點

⑵ 細胞培養基加了血清後還可以過濾么

1、血清要做滅活處理；
2、滅活後的血清要經過.45和.22慮膜過濾；
3、培養基是不可以紫回外照射的。
還要答注意一點的是血清一般不推薦直接過濾除菌的，如果懷疑血清染菌，過濾時要把血清按比例加入到培養液中，然後才可以過濾除菌！！

⑶ 如何獲取血清問題

serum，血清，詳細資料見網路http://ke..com/view/42775.htm?fr=aladdin

先糾錯，紅細胞是血細胞而非生物大分子。

嚴格的講，添加了抗凝劑的血液在高速離心機離心後得到的上清液為血漿而非血清，前者與後者相比含有多種凝血因子比如纖維蛋白原或纖維蛋白。離心的方法可以使血液分層，使血細胞（紅細胞、白細胞）、血液中的其他成分（血小板、血漿清蛋白、球蛋白等）沉澱於管底，從而獲取新鮮血漿。血清可以用離心新鮮膠凍狀血凝塊獲得。

常用的注射器過濾器一般是0.46um和0.22um兩種規格，可以過濾掉部分細菌、液體中的雜質等，理論上可以通過過濾方式得到血漿，但實際上沒人這么做——因為紅細胞直徑為6~9um很快就能堵塞過濾器濾孔，使得過濾沒法進行；手術中自體血液回輸機的過濾不同於普通的注射器過濾器。

綜上所述，用注射器過濾得到的血漿和離心機獲得的差異不大，但注射器過濾基本上是不可能實現的。

⑷ 細胞培養時，為什麼勿直接過濾血清

買來的就已經過濾過除菌了，如果污染了直接扔掉吧，血清過濾起來很費勁的

⑸ 血清是怎樣製作的

1、采血：達到放血完全，應選擇前腔動脈或靜脈放血，注意放血部位的消毒和器具的消毒。
2、析出血清：採用靜置自然析出方法，將析出的血清收集到經消毒的生理鹽水瓶內，一般裝到生理鹽水瓶容量的三分之二，為了更完全的分離血清，過夜後還會有血清析出，繼續收集。
3、殺滅病毒的處理：將收集好的血清，瓶口向上放入水浴鍋56℃水浴2小時，病毒經高溫後失活，而在該溫度時，抗體效價不下降。
4、殺滅細菌，每毫升加2000單位的鏈黴素和2000單位的青黴素，充分搖均，封口即可使用。
5、存放，不立即使用時，應冷凍保存。

⑹ 懷疑血清染菌，想用濾膜過濾一下，可否自己用0.22μm濾膜過濾

很難直接過濾，一般要加到培養基中再過濾。我們實驗室制備培養基時，都使用濾膜過濾，一般而言如果制備 1-2瓶培養基，一個濾膜及一支30ml注射器可以過濾50ml小牛

⑺ 用離心機分離血清要多長時間

一、要根據分離目標體和分離精度要求結合你的分離設備來確定的，一般分離血清常見的就是小型的試驗型離心機分離血清樣本。

1、普通生化檢查分離血清，這個是用低速離心機轉速在3000—3500轉。一般在3分鍾之內就可以了，分析分離效果，可以酌情調節轉速和時間。

2、試驗型離心機分離血清生產疫苗，這個有著嚴格的工藝規范，只能照做，不能隨意更改參數。

二、取血後，靜置1-2小時，置於離心機內以3000P/m離心15分鍾，用移吸管吸出分離的血清（上層乳黃色的上清液），置於4℃冰箱保存。測定時移至室溫下30分鍾解凍。剩下的應該是血漿了。淋巴細胞不可能從剩下的血漿分離了。

(7)怎樣過濾血清擴展閱讀：

分離方法：

一般情況下，室溫（37度）靜置半小時以上,打開離心機，3500-4000rpm離心5-10分鍾。分離得到血清。如果測酶等易降解的指標,按需要放4度靜置半小時以上，離心。（放置37度一段時間的目的是讓血液凝固,析出血清,因為血液凝固後,纖維蛋白收縮,血清就能析出。）

注意事項

離心速度過大,易造成溶血

動物取血,盡量不要粘到毛什麼的,易溶血.

為了確保安全和離心效果，儀器必須放置在堅固水平的檯面上，工程塑料蓋門上不得放置任何物品;樣品必須對稱放置，並在開機前確保已擰緊螺母。

使用前應檢查轉子是否有傷痕、腐蝕等現象，同時應對離心杯做裂紋、老化等方面的檢查，發現有疑問立即停止使用，並與廠方聯系；開機運轉前請務必擰緊轉頭的壓緊螺帽，以免高速旋轉的轉頭飛出造成事故。

轉速設定不得超過最高轉速，以確保機器安全運轉。

使用中如果出現0.00或其他數字，機器不運轉，應關機斷電，10秒後重新開機，待所設轉速顯示後，再按運轉鍵，機器將照常運轉。

⑻ 如何用活性炭處理的血清

我找到的方法如下「
1 活性炭使用前先用預冷的消毒水洗兩遍
2 用0.5%右旋糖苷T70配置5%的活性炭懸浮液
3 與血清同體積混合
4 1000g 離心10分鍾
5 吸取上清（一部分血清與活性炭顆粒混合）
6 56℃，30分鍾，每分鍾4次混合這些混合物
7 1000g 20分鍾離心這些懸液
8 重復離心兩次，取上清液
9 0.22um濾器過濾，-20凍存
但是右旋糖苷T70價格很讓人心疼啊，而且我就用一次。

⑼ 請問細胞培養中胎牛血清過濾的詳細步驟,

胎牛血清買回來先化開，然後56度半小時滅活，在正常過濾就行。如果你用一次性濾器，內那就先准備容20或50ml的注射器，用注射器抽取，拔掉針頭，再把一次性濾器插入注射器出口，把濾出的血清放滅過菌的容器就行，我一般放50ml離心管中，用時也方便，否則血清反復凍融不好，也容易染菌。

⑽ 人和動物血清應該要如何滅菌

酶溶液，可用無菌的過濾器過濾滅菌，根據你的溶液性質和滅菌要求，有0.45um,
0.22um等不同規格的濾器
動物血清可用射線消毒滅菌
主要使用6oco、x射線進行消毒滅菌