㈠ 超濾離心管怎麼使用
蛋白濃縮和換Buffer通常使用的超濾管，常用Millipore的Amicon-Ultra-15超濾管（MWCO10kD）。也有其它型號的、不同體積大小和超濾管可選，視目的蛋白的分子量與濃縮前體積、濃縮目標體積而定。可重復使用。
1、選擇合適的超濾管，主要考慮MWCO和濃縮體積，通常應截留分子量不應大於目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量為35kDa，就可以選擇10kDa截留分子量的超濾管。若目的蛋白分子量為10kD左右，則可以用截留分子量3kD的超濾管。
2、新買來的超濾是乾燥的，使用前加入MilliQ水，水量完全過膜，冰浴或冰箱里預冷幾分鍾。然後將水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超過管頂的白線為准。操作要輕，加入蛋白液前，超濾管需要插在冰上預冷。
3、平衡。質量和重心二者都要達到平衡。注意轉速和加速度不可太快，否則直接損壞超濾膜。開始離心超濾（離心機預冷至4度）。膜與轉軸的方向根據說明書調整（角轉離心機的情況是膜與軸垂直）。在實際使用中，一般轉速開的比說明書里的要低，這樣可以延長離心管的使用壽命。
4、當濃縮到剩下1ml時，【取50ul國產Bradford溶液，加入10ul流穿，看有沒變藍色，以此判斷超濾管是否漏掉蛋白。如果管漏了，將上層和流穿重新倒入新管中開始超濾。要精確判斷是否漏管，用5mg/ml的BSA離心10min，再取流穿，跑蛋白膠或Bradford粗測】，繼續加入剩下的蛋白液濃縮（在冰上操作，防止蛋白受熱），直到所有濃縮液都加完為止。離心過程中注意是否發生蛋白沉澱，導致堵管。若發生沉澱，要確定沉澱的具體原因，是蛋白濃度過高還是Buffer不合適；前者可用多根超濾管同時超濾，降低濃度的辦法解決，後者的方法是換不同的Buffer，直到蛋白不發生沉澱為止。
5、前面幾步用以濃縮蛋白，如果要換Buffer，在總蛋白液濃縮至1ml左右的時候，輕輕加入新的Buffer（經0.22um超濾膜超濾），再濃縮至1ml左右，連續三次，最後一次的濃縮終體積根據需要的蛋白濃度而定，一般不多於500ul，也有濃縮至200ul以內的情況。按照每次至少10倍左右的體積濃縮算，三次達到1000倍以上，基本上可以達到換buffer的目的。
6、取出最終蛋白濃縮液的操作在冰上操作，用黃槍頭（200ul）取，輕輕順著邊緣插入槍頭，輕輕吹打、混勻蛋白液，注意不要碰到超濾膜，然後吸取濃縮液，每次吸接近200ul，直到吸完。管底剩下的最後一點濃縮液不必吸取，否則難度太大，有可能損壞超濾膜。最後加入MilliQ水到超濾管中，沒過超濾膜，防止膜失水變干。
7、以下是處理超濾管，重復利用超濾管的步驟。
8、倒出超濾管里的水，用milliQ水輕輕潤洗幾次，【若管底有可見的蛋白沉澱，可以先加入水，然後用槍頭吹打，注意不要碰到膜，吹打至沉澱懸起，然後倒掉，不可用自來水猛沖】然後加入0.2M的NaOH溶液，室溫放置20min，期間平衡超濾管。再離心10min。倒出殘留的NaOH溶液，將管芯浸入MilliQ水的燒杯(1或2L)中,放置幾個小時,再換新的水,放置幾個小時，不斷稀釋NaOH濃度。50ml管和蓋子用自來水洗，內壁再用MilliQ水洗干凈。
9、取出浸沒的管芯，加至接近滿的MilliQ水，50ml管也加滿MilliQ水，將管芯慢慢放入50ml
離心管，排出部分水，然後蓋上蓋子，放4度保存，直到下次使用。一般來說，按照上述步驟和注意事項，每根管用三四年不會壞。
㈡ 【星耀小課堂】純化基操篇｜大腸桿菌與內毒素的愛恨情仇——人類【純化】花式「勸分」方法解析
內毒素的去除在生物製品純化過程中至關重要，本文將詳細介紹內毒素的結構、去除方法以及不同層析技術和切向流膜過濾法在去除樣品內毒素污染中的應用策略。內毒素源於革蘭氏陰性細菌的細胞壁外膜脂多糖（LPS），主要由O-特異性側鏈、核心多糖和類脂A（lipid A）構成，類脂A在通常條件下帶有部分負電荷，具有強疏水性和弱親水性雙相性，能結合帶正電和疏水性的分子。
內毒素的結構穩定，單體質量約為10-20KDa，聚合體質量可達300-1000KDa或更大，且具有良好的熱穩定性。內毒素的去除是確保生物製品安全性的關鍵步驟。FDA等法規對內毒素控制和降低到安全水平提出明確要求。為了有效去除內毒素，需從源頭消除外源性內毒素的污染，確保與樣品直接接觸的設備、容器具、儲液袋、原輔料、耗材等無內毒素污染。
對於樣品中內源性內毒素污染，去除方法主要涉及石棉及活性炭吸附、化學降解、相分離法和超濾法等。其中，石棉及活性炭吸附法利用吸附原理去除內毒素；化學降解法則通過強酸、強鹼或氧化劑等使內毒素降解；相分離法利用相似相溶的萃取原理，在低溫條件下，Triton X-114溶解度高，內毒素溶解於其中；隨溫度升高溶解度降低，形成沉澱並去除內毒素。超濾法則基於分子量差異去除內毒素，常用300KDa超濾膜，適用於去除水中或小分子溶液中的內毒素。
層析法是內毒素去除的常用方法，包括離子交換層析、疏水層析、分子篩層析、親和交換層析、復合模式層析等。例如，離子交換層析基於內毒素的低等電點特性，適合去除中性和鹼性蛋白中的內毒素，通過調整緩沖液的電導率、pH值等參數優化純化過程。疏水層析利用內毒素在高鹽條件下聚集成復合體，以流穿形式去除，適用於對鹽濃度變化不敏感的蛋白。凝膠過濾層析則利用內毒素與目標蛋白在水溶液中形成不同大小的分子聚集體的差異進行分離。復合模式層析通過層析柱骨架上復合的化學基團，實現內毒素雜質的有效去除。
切向流膜過濾法是一種有效的內毒素去除技術，基於膜孔徑小於內毒素分子量的原理，實現內毒素被截留，而目標樣品透過膜孔。該方法考慮目標分子的大小分布、內毒素與目標分子的相互作用、目標蛋白質濃度以及是否添加相應的洗滌劑等因素，以優化內毒素去除效率。通過將大腸桿菌表達的細菌樣品稀釋後，使用100 kDa膜進行過濾，內毒素去除效率范圍從28.9%到99.8%。在過濾過程中，添加非離子去污劑Triton X-114和精氨酸等添加劑，有助於解離內毒素與樣品分子的相互作用，進一步降低終產物內毒素含量。
總結內毒素去除策略，結合不同生物製品和工藝特點，採用復合工藝條件，如層析方法和切向流膜過濾法，以及非離子去污劑和添加劑的使用，能有效降低工藝過程中的內毒素雜質，提高產品安全性。耀海生物作為生物醫葯產業的CRO/CDMO/MAH服務提供商，通過多年深耕微生物表達體系CDMO服務，為國內外製葯公司提供從工藝開發到商業化生產的全生命周期CDMO服務，推動客戶新葯項目順利推進，為中國生物醫葯產業的發展持續賦能。
㈢ 超濾膜10kda是什麼意思
截留率。超濾膜上標的10KD、30KD，都是指截留率單位越大，超濾得改瞎到的物質分子也越大。10kDa的超濾膜就是該超悶殲卜濾膜對10kDa的葡螞穗聚糖截留率為90。
㈣ 超濾法提取外泌體的原理和操作要點是什麼
外泌體是細胞分泌的一種微小囊泡，具有重要的生物學功能。超濾法是提取外泌體的常用方法之一，以下是其原理和操作要點：
原理
超濾法是利用超濾膜對不同大小分子進行選擇性分離的技術。超濾膜具有一定的孔徑范圍，當含有外泌體的生物樣品通過超濾膜時，小於膜孔徑的物質如小分子代謝物、鹽離子、緩沖液等可以自由通過膜孔，而外泌體的粒徑通常在 30 - 150nm 之間，大於超濾膜的孔徑，因此被截留在膜的一側，從而實現外泌體與其他雜質的分離和濃縮。
操作要點
樣品准備
確保生物樣品的新鮮度，盡量減少外泌體的降解和聚集。例如，對於血液樣本，應在採集後盡快離心分離血清或血漿，並避免反復凍融。
對樣品進行預處理，如過濾或低速離心，以去除細胞碎片、大的蛋白質聚集體等雜質，防止它們堵塞超濾膜。
選擇合適的超濾膜
根據外泌體的大小和特性，選擇具有合適孔徑的超濾膜。一般來說，截留分子量為 100 - 300kDa 的超濾膜較為常用，對應的孔徑可有效截留外泌體。
考慮超濾膜的材質，如聚醚碸（PES）、再生纖維素等，材質應具有良好的生物相容性、化學穩定性和低蛋白吸附性，以減少對外泌體的吸附和破壞。
超濾操作
將預處理後的樣品加入到超濾裝置中，注意避免氣泡的產生，因為氣泡可能會影響超濾效果並導致外泌體損失。
選擇合適的超濾方式，如攪拌式超濾或切向流超濾。攪拌式超濾適用於小體積樣品，通過攪拌可以減少濃差極化現象；切向流超濾則更適合大規模樣品的處理，能有效提高超濾效率和膜的使用壽命。
控制超濾的壓力和流速，避免過高的壓力導致外泌體變形或破裂。一般來說，操作壓力應控制在 0.5 - 2 bar 之間，流速根據具體裝置和樣品體積進行調整。
在超濾過程中，可適時補充緩沖液或生理鹽水，以維持樣品的滲透壓和體積，防止外泌體因濃縮過度而發生聚集。
外泌體收集和保存
超濾完成後，小心收集截留在外泌體濃縮液，避免污染。
如需長期保存，應將外泌體濃縮液分裝成小份，避免反復凍融，可在 - 80℃冰箱中保存。同時，可加入適量的保護劑如甘油、BSA 等，以穩定外泌體的結構和功能。
在整個超濾法提取外泌體的過程中，要嚴格遵守無菌操作原則，防止微生物污染，同時注意操作的溫和性，以保持外泌體的完整性和生物學活性。
㈤ 分離22KD的蛋白質選擇什麼型號的超濾膜
如果是分離22kDa及分子量遠小於它的小蛋白，推薦用millipore的超濾管，截留分子量10kDa，體積1-15ml都有。主要還是看你的目的蛋白是集中於濃縮液部分，還是濾液部分，從而選擇合適的截留分子量