免疫組化樹脂封片

❶ 免疫組化封片劑是什麼

DAB顯色的石蠟切片免疫組化封片用中性樹膠或者中性快乾膠，AEC顯色的用水溶性的封片劑就可以，免疫熒光的話需要專門的防脆變的封片劑或者用甘油也行（但是保存時間很短）。

❷ 我只想知道做免疫組化要多久才出結果

建議：你好病理科一般做免疫組化需要一周時間，主要時間用在前提切片的製作，後期抗體的加入及顯色，封片等過程。

❸ 免疫組化封片後有白色絮狀物，原因是什麼

脫蠟和水化的目的和原理不一樣，但都是利用酒精既溶於水又溶於有機溶劑的特性。組織脫水的目的是通過酒精的媒介讓有機溶劑滲透入組織，再讓石蠟置換有機溶劑，從而使組織包埋在石蠟中。而水化是組織切片經二甲苯脫蠟後，用酒精洗去二甲苯，所以必須從高濃度酒精開始，讓後再利用酒精的媒介入水。不知說明白沒？

❹ 免疫組化用中性樹脂才用二甲苯透明嗎

二甲苯的作用是脫脂和透明，如果不用可能會產生組織染色效果差，細胞腫脹，鏡下觀察組織結構模糊，染色過程易產生掉片的現象。

❺ 請教免疫組化的具體步驟！

一 免疫組化（ LP 法）操作步驟 ：

1． 切片常規脫蠟至水。如需抗原修復，可在此步後進行

2. 緩沖液洗 3min/2 次。

3. 為了降低內源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色 , 將切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分鍾。

4. 緩沖液洗 5min/2 次。

5. 滴加 Ultra V Block ， 在室溫下孵育 5 分鍾以封閉非特異性的背景染色。

（註：孵育不要超過 10 分鍾，否則會導致特異性染色降低。如果一抗的稀釋液中含有 5 － 10% 正常羊血清，這一步可以省略。）

6. 緩沖液洗 5min/2 次。

7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小時。（具體孵育時間和溫度由試驗者最終決定）

8. 緩沖液洗 5min/2 次。

9 ． 滴加 Primary Antibody Enhancer( 增強子 ) , 在室溫下孵育 20 分鍾。

10 ．緩沖液洗 5min/2 次。

11 ．滴加 HRP Polymer( 酶標二抗 ) ，在室溫下孵育 30 分鍾。

（註： HRP Polymer 對光敏感，應避免不必要的光暴露並儲存在不透明的小瓶中。）

12 ．緩沖液洗 5min/2 次。

13 ．向 1ml DAB Plus Substrate ( 或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen ） , 混勻後滴加到切片上，孵育 3 － 15 分鍾。（具體時間由染色深淺決定。）

14 ．自來水充分沖洗 , 復染，脫水 , 透明 , 封片。

二．免疫組化 ( 三步法 ) 操作步驟 ：

（ 1 ）、石蠟切片脫蠟至水。

（ 2 ）、 3%H 2 O 2 室溫孵育 5-10 分鍾，以消除內源性過氧化物酶的活性。

（ 3 ）、蒸餾水沖洗， PBS 浸泡 5 分鍾 x2 （如需抗原修復，可在此步後進行）。

（ 4 ）、 5-10% 正常山羊血清（ PBS 稀釋）封閉，室溫孵育 10 分鍾，傾去血清，勿洗。滴加 一抗 工作液， 37 ℃ 孵育 1-2 小時或 4 ℃ 過夜。

（ 5 ）、 PBS 沖洗， 5 分鍾 x3 次。

（ 6 ）、滴加適量 生物素標記二抗 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分鍾。

（ 7 ）、 PBS 沖洗， 5 分鍾 x3 次。

（ 8 ）、滴加適量的 辣根酶或鹼性磷酸酶標記的鏈霉卵白素 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分鍾。

（ 9 ）、 PBS 沖洗， 5 分鍾 x3 次。

（ 10 ）、顯色劑顯色 3-15 分鍾（ DAB 或 NBT/BCIP ）

（ 11 ）、自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。

三. 冰凍切片免疫組化染色步驟：

冰凍切片 4-8um ，室溫放置 30 分鍾後，入 4 ℃丙酮固定 10分鍾，PBS洗，5分鍾x3，用過氧化氫孵育5-10分鍾，消除內源性過氧化物酶的活性。以下同石蠟切片免疫組化

❻ 免疫組化 如何復染（免疫組化，蘇木精，鹽酸，石

（一）、儀器設備

1）18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或醫用微波爐；2）水浴鍋

（二）、試劑

1）PBS緩沖液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L.

2）0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液（CB，pH6.0，1000ml）：檸檬酸三鈉 3g，檸檬酸 0.4g.

3）0.5mol/L EDTA緩沖液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH調至pH8.0，加水至1000ml.

4）1mol/L的TBS緩沖液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris鹼，用1N的HCl調至pH8.0，加水至1000ml.

5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2（pH7.8） 配製。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配製。

6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配製。

7）封裱劑：

a、甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.0～9.5）等量混合；

b、油和TBS（或PBS）配製。

8）TBS/PBS pH9.0～9.5，適用於熒光顯微鏡標本；pH7.0～7.4適合於光學顯微鏡標本。

（三）、操作流程

1、脫蠟和水化

脫蠟前，應將組織晶元在室溫中放置60分鍾或60℃恆溫箱中烘烤20分鍾。

1）組織晶元置於二甲苯中浸泡10分鍾，更換二甲苯後再浸泡10分鍾；

2）無水乙醇中浸泡5分鍾；

3）95%乙醇中浸泡5分鍾；

4）70%乙醇中浸泡5分鍾；

2、抗原修復

用於福爾馬林固定的石蠟包埋組織晶元。

1）抗原熱修復

（1）高壓熱修復 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）。蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子，但不進行鎖定。將玻片置於金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡5分鍾，然後將蓋子鎖定，小閥門將會升起來。10分鍾後，去除熱源，置入涼水中，當小閥門沉下去後打開蓋子。本方法適用於較難檢測或核抗原的抗原修復。

（2）煮沸熱修復 電爐或者水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）至95℃左右，放入組織晶元加熱10~15分鍾。

（3）微波熱修復 在微波爐里加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）至沸騰後將組織晶元放入，斷電，間隔5~10分鍾，反復1-2次。適用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。

2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預熱至37℃，切片也預熱至37℃，消化時間約為5~30分鍾；胃蛋白酶消化37℃時間為30分鍾。適用於被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。

3、免疫組織化學染色

SP法

1）脫蠟、水化；

2）PBS洗2～3次各5分鍾；

3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室溫靜置10分鍾；

4）PBS洗2～3次各5分鍾； 5）抗原修復；

6）PBS洗2～3次各5分鍾；

7）滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鍾。甩去多餘液體。

8）滴加Ⅰ抗50μl，室溫靜置1小時或者4℃過夜或者37℃1小時。

9）4℃過夜後需在37℃復溫45分鍾。

10）PBS洗3次各5分鍾；

11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室溫靜置，或37℃1小時；

12）II抗中可加入0.05%的tween-20.

13）PBS洗3次各5分鍾；

14）DAB顯色5～10分鍾，在顯微鏡下掌握染色程度；

15）PBS或自來水沖洗10分鍾；

16）蘇木精復染2分鍾，鹽酸酒精分化；

17）自來水沖洗10～15分鍾；

18）脫水、透明、封片、鏡檢。

SABC法

1）脫蠟、水化。

2）PBS洗兩次各5分鍾。

3）用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2，室溫封閉5～10分鍾，蒸餾水洗3次。

4）抗原修復。

5）PBS洗5分鍾。

6）滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鍾。甩去多餘液體。

7）滴加Ⅰ抗，室溫1小時或者4℃過夜或者37℃1小時（4℃過夜後在37℃復溫45分鍾）。

8）PBS洗三次每次2分鍾。

9）滴加生物素化二抗，20℃～37℃20分鍾。

10）PBC洗3次每次2分鍾。

11）滴加試劑SABC，20℃～37℃20分鍾。

12）PBS洗4次每次5分鍾。

13）DAB顯色：DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色（鏡下掌握顯色程度）。

14）蒸餾水洗。蘇木素復染2分鍾、鹽酸酒精分化。

15）脫水、透明、封片、鏡檢。

❼ 細胞爬片染色免疫組化法步驟是什麼

師兄用的晶安生物的細胞爬片。
晶安生物細胞爬片免疫組化法： 1 胰酶消化細胞，收集至離心管；調整樣本細胞數為1×106 /ml； 2 將單細胞懸液滴加至平皿內無菌載玻片表面，置於37℃ 5%的加濕CO2孵箱中過夜，使細胞爬片。 3 吸棄平皿內培養上清，加入新鮮培養基，用無菌培養基洗3次； 4 PBS沖洗相應方案的載玻片3次； 5 將載玻片置於95%乙醇中固定約1h； 6 倒置相差顯微鏡下觀察，並劃定載玻片上細胞爬片密集區； 7 在相應區域滴加按一定比例稀釋後一抗，4℃冰箱內過夜濕孵。陰性對照以PBS緩沖液代替一抗。 8 先暫復溫30min，後PBS沖洗載玻片3次； 9 滴加二抗，室溫濕孵30min；後PBS沖洗載玻片3次； 10 DAB顯色：將配置好的DAB溶液滴加至載玻片上，室溫下孵育3min至載玻片略顯黃色； 11 清水充分沖洗載玻片，蘇木素復染核3-5min，清水沖洗，鹽酸酒精分化20s，清水沖洗，氨水返藍3min，清水沖洗，後置於75%-80%-95%-無水酒精中脫水，每步驟約2min； 12 將載玻片置於1、2、3道二甲苯中，各約15min，中性樹脂封片，置於陰涼通風處風干。

❽ 免疫組化和 western blot 有什麼區別

1、原理不同：

免疫組化利用抗體和抗原之間的結合具有高度的特異性。先將組織或細胞中的某種化學物質提取出來，以此作為抗原或半抗原，通過免疫動物後獲得特異性的抗體，再以此抗體去探測組織或細胞中的同類的抗原物質。

western blot也是利用抗體和抗原之間的結合具有高度的特異性。經過聚丙烯醯胺凝膠電泳分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應。

2、組織定位不同：

免疫組化在組織定位和定性上比較准確，但是在定量上不夠准確。western blot因為有內參標定，所以在定量上要更加准確，但是在組織定位上不如免疫組化。

(8)免疫組化樹脂封片擴展閱讀：

一、 免疫組化（SP法）操作步驟：

1、切片常規脫蠟至水。如需抗原修復，可在此步後進行。

2、緩沖液洗 3min／2 次。

3、為了降低內源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色，將切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10－15 分鍾。

4、緩沖液洗 5min／2 次。

5、滴加 Ultra V Block ， 在室溫下孵育 5 分鍾以封閉非特異性的背景染色。

6、緩沖液洗 5min／2 次。

7、滴加一抗工作液 37 ℃孵育1 － 2 小時。

8、緩沖液洗 5min／2 次。

9、 滴加 Primary Antibody Enhancer（增強子），在室溫下孵育 20 分鍾。

10、緩沖液洗 5min／2 次。

11、滴加 HRP Polymer（酶標二抗） ，在室溫下孵育 30 分鍾。

12、緩沖液洗 5min／2 次。

13、向 1ml DAB Plus Substrate （或 AEC Plus Substrate） 中滴加 1－2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen），混勻後滴加到切片上，孵育 3 － 15 分鍾。

14、自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。

二、 western blot操作步驟：

1、SDS－PAGE試劑：見電泳實驗。

2、勻漿緩沖液：1．0M Tris－HCl（pH 6．8）1．0ml；10％SDS 6．0ml；β－巰基乙醇 0．2ml；ddH2O 2．8ml。

3、轉膜緩沖液：甘氨酸 2．9g；Tris 5．8g；SDS 0．37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。

4、0．01M PBS（pH7．4）：NaCl 8．0g；KCl 0．2g；Na2HPO4 1．44g；KH2PO4 0．24g；加ddH2O至1000ml。

5、膜染色液：考馬斯亮蘭 0．2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml。包被液（5％脫脂奶粉，現配）：脫脂奶粉1．0g 溶於20ml的0．01M PBS中。

6、顯色液：DAB 6．0mg；0．01M PBS 10．0ml；硫酸鎳胺 0．1ml；H2021．0μl。

❾ 免疫組化脫水的目的

免疫組化顯完色後，封片前的脫水過程是為了下一步的二甲苯透明封片。免疫組化的試劑我們一般都是用徠卡novocastra系列的，配合後來的脫水和封片成片效果也很好。