A. 超滤离心管如何选择以及使用方法
超滤离心管在蛋白质、DNA和生物分子的浓缩、纯化和脱盐过程中被广泛应用。选择和使用超滤离心管时，需要理解其与微滤的区别。
微滤（Microfiltration）利用微孔膜介质去除溶液中尺寸为0.1 μm至10.0 μm的颗粒或生物体，广泛应用于生物制药预过滤和除菌过滤。微滤在细胞实验中常用于样品和培养基灭菌，以及从细胞裂解物中去除完整细胞和碎片，确保下游应用结果准确性。
超滤（Ultrafiltration）通过压力或浓度梯度使料液通过半透膜进行分离，能截留尺寸范围为1-1000kDa的分子，并允许盐和水等小分子通过。它广泛应用于蛋白质溶液的分离和纯化，以及核酸样品制备，如分子克隆和质粒纯化。与沉淀法相比，超滤更为温和，避免生物大分子失活。
超滤离心管是一种利用离心力驱动溶液通过超滤膜进行快速浓缩、渗滤和缓冲液置换的装置，由盖子、过滤装置和离心管组成。通过选择适合的膜孔径，可进行除热源、澄清和分离大分子污染物，或浓缩和脱盐目标分子。
选择超滤离心管时，需考虑样品起始量及超滤膜的截留分子量（MWCO）。样品体积决定离心管尺寸，而截留分子量则需根据目标大分子的分子量选择，通常选择比目标分子小2-3倍的膜。
使用超滤离心管涉及准备、加样、离心和回收步骤。准备阶段需冲洗设备以消除甘油残留，然后在离心前加入适量纯水或缓冲溶液。离心前确保离心机转子平衡，以保持稳定。回收时，从过滤装置或离心管中轻轻提取样品，注意不要接触或损坏超滤膜。
遵循上述步骤，正确选择和使用超滤离心管，将有效实现蛋白质、DNA和生物分子的高效浓缩、纯化和脱盐，为科学研究和工业应用提供可靠支持。
B. 外泌体的提取方法简介
外泌体的提取方法简介
外泌体在1983年首次在绵羊网织红细胞中被发现，是一种直径在30~150nm的类囊泡小体，属于细胞外囊泡的一种。它们存在于多种生物体液中，如动植物细胞培养上清液、血浆、血清、唾液、尿液、腹水等，且在形成过程中内含特异蛋白和核酸等物质，如微管蛋白、肌动蛋白、热休克蛋白以及信使RNA、微小RNA等。
外泌体作为药物递送载体具有三个显著优势：一是生物相容性好，免疫原性低，如未成熟的树突状细胞及间充质干细胞，有利于药效发挥和减少不良反应；二是外泌体包含特定的磷脂和功能性膜蛋白，通过膜融合和间隙连接等途径避开内涵体-溶酶体途径，高效率地将内含物递送到胞质中；三是外泌体具有一定的天然靶向性，能够参与机体免疫应答、抗体提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等过程，且作为纳米载体能够将基因或药物运至靶器官，在临床治疗中有较好的应用前景。
因此，分离和提取外泌体，分析其组成和功能具有重要意义。本文将对外泌体的提取方法进行介绍。
1.基于离心的方法
超速离心法是分离外泌体的经典方法，利用外泌体与污染物在大小和密度上的差异，通过梯度离心实现分离和富集。此法在4℃条件下进行多次离心，去除细胞与碎片后，通过100000g超速离心达到目的。虽然操作简单、获取外泌体数量较多，但设备成本大、每次处理样本数量有限、耗时长且存在外泌体聚集现象。在超高速离心基础上，使用蔗糖密度梯度离心可以得到更高纯度的外泌体，但前期准备工作繁琐，且外泌体中可能含有难以去除的化学物。
2.基于尺寸大小的方法
超滤离心法利用截留分子中最大分子的截留分子量（MWCO）进行分离，通过选择不同规格的超滤膜，使外泌体与其他大分子物质分离。这种方法简单、省时，不影响外泌体的生物活性，但纯度较低。
分子排阻色谱法（SEC）基于分子尺寸大小分离外泌体，样品在多孔固定相中流动时，较小的杂质进入多孔不易洗出，而粒径较大的外泌体较快流出，实现分离。利用这种方法的qEV试剂盒操作简单、获得外泌体纯度高，但上样体积有限，否则会降低分离效率。
3.基于免疫吸附的方法
免疫磁珠法利用外泌体表面特定抗原能与单克隆抗体结合的原理，通过抗体分离外泌体。具体步骤包括磁珠与外泌体共同孵育、离心收集、蒸馏水冲洗后重悬于缓冲液中。此法保证了外泌体的特异性良好和形态完整，操作简单、成本低，但溶剂pH和浓度影响外泌体生物活性，且磁珠成本高，普及受限。
4.基于聚沉的方法
聚乙二醇（PEG）沉淀法在过去几十年里被用于病毒的富集，利用PEG的亲水性改变外泌体的溶解度或分散性使其沉淀。此法操作简单、无需特殊设备，产量高，适合下游分析试验，但可能会沉淀非外泌体物质和大分子，纯度不高。在沉淀前预处理去除细胞碎片，加入沉淀剂在4℃过夜孵育后，再通过SEC、离心法或滤膜有效去除蛋白聚合物及大分子囊泡，可提高外泌体纯度。
5.基于微流控的方法
微流控技术利用微纳米管道处理流体，是一种基于外泌体物理和生物化学性质的微尺度分离方法。除了基于免疫亲和力、大小和密度的分离，还可以实现电泳和电磁操作等创新分选机制。然而，微流控技术缺乏标准化和大规模临床样本测试，缺少方法验证，难以实现大规模应用。
总结而言，超速离心法仍是分离外泌体最常用的方法之一，结合蔗糖密度梯度离心可以得到更纯净的外泌体。尽管如此，设备成本大、耗时、处理量小等问题仍需关注。随着外泌体相关研究的增加，更高效高产地分离纯净外泌体对推动外泌体相关制剂的研究和应用至关重要。