de52阴离子交换柱层析

『壹』 纤维素DE-52的提取方法

纤维素DE-52提取法纯化多克隆抗体
该法提取IgG简便，既可小量提取，也可大量制备。
1．批量提取法 称取DEAE-纤维素(DE52)50g，置于1000ml烧杯中，先以蒸馏水漂浮除去细颗粒，再经酸碱处理后，用0.01～0.05mol/L，pH8.0左右的磷酸盐缓冲液(PB)平衡。将水分抽干，或用布氏滤斗(内放两层滤纸)过滤，收集湿纤维素，以降低其离子强度。按1ml血清加湿重5g DE52，经过充分搅拌，置4℃吸附1h。上清液可再如此处理一次，即获得较纯的IgG。该法提取IgG简便，既可小量提取，也可大量制备。
2．Tris-Cl离子交换层析法(Ion-exchange chromatography)
【材料和试剂】
（1）DE52纤维素。
（2）HCl；NaOH；0.01～0.05mol/L，pH8.0 PB；0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl；0.5mol/L NaCl。
（3）待纯化标本：杂交瘤腹水或培养上清，免疫血清或饱和硫酸铵粗提品。
（4）1.5×50cm 层析柱；透析袋；紫外分光光度计及其他透析和层析所需的试剂和器材。
【操作步骤】
（1）DE52纤维素的处理：DE52经酸、碱处理，0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl平衡。
（2）装柱：将层析柱固定于滴定架上，柱底垫一圆形尼龙纱，出口接一细塑料管并关闭出水。将浸泡于0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl中的DE52沿玻璃棒倒入柱中，待DE52自然沉降3～5cm高时，吸除0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl，或松开出水口螺旋夹，控制流速1～2ml/min，同时连续加入DE52至所需高度。待DE52完全沉降后，柱面放一圆形滤纸片。
（3）平衡：松开出水口螺旋夹，以0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl平衡，控制流速为15滴/min，待流出液与洗脱液之pH值达到一致时，停止平衡。
（4）待提取样品的准备：将蛋白装入透析袋里，置4℃冰箱，对0.01mol/L pH8.6 Tris-Cl透析过夜。
（5）加样、洗脱与收集：用吸管吸去柱面液体，以毛细吸管沿柱壁加入样品，样品体积相当于柱床体积的1%～2%，蛋白浓度为50～70mg。启开出水口螺旋夹使样品缓慢进入柱床内，并用少量洗脱液清洗柱壁；待液体进入柱床后，以0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl洗脱，控制流速为14～16滴/min。分部收集器收集，紫外监测，或人工收集，以紫外分光光度计分别测定每管280nm OD值，描绘洗脱液峰。
（6）浓缩：将洗脱液的280nm OD上峰段与下峰段各管分别合并，装入透析袋，以PEG浓缩至所需体积。
Tris-PO4离子交换层析法
该法在上述方法的基础上稍加改良，即通过梯度洗脱，可用于血清中IgG和IgM的提取。
【材料和试剂】
（1）DE52纤维素。
（2）待纯化标本：杂交瘤腹水或培养上清，免疫血清或饱和硫酸铵粗提品。
（3）1.5×50cm 层析柱；透析袋及其他透析和层析所需的试剂和器材。
（4）梯度洗脱液包括：0.005 mol/L，pH8.6 Tris-PO4；0.055mol/L，pH6.0 Tris-PO4；.5mol/L，pH5.1 Tris-PO4。
【操作步骤】
（1）蛋白标本对0.005mol/L，pH8.6 Tris-PO4透析。
（2）DE52装柱，并以0.005mol/L，pH8.6 Tris-PO4平衡。
（3）加样，以0.005mol/L，pH8.6 Tris-PO4洗脱，紫外监测直至洗脱液280nm OD回到基线。这一步骤可除去血清中其他蛋白。
（4）以350ml 0.055mol/L，pH6.0 Tris-PO4洗脱，这一步骤可用于纯化血清IgG和IgM。
（5）以125ml 0.055mol/L，pH6.0 Tris-PO4和125ml 0.5mol/L，pH5.1 Tris-PO4梯度洗脱，总量收集250ml；重复步骤（5）。
（6）根据280nm峰值合并蛋白峰，透析浓缩和保存同上。
用过的DE52可用0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl和0.5mol/L NaCl、0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl梯度洗脱回收。再用蒸馏水洗至中性，加入0.02%叠氮钠于4℃保存备用。

『贰』 deae-阴离子纤维素的使用方法

DEAE－纤维素的处理及装柱
（1）处理
本实验采用的是DEAE－纤维素DE 52 是弱酸型阴离子交换剂，具体处理方法为：先将DE52阴离子交换剂干粉浸泡于蒸馏水中，去除杂质；再在0.5N的HCL溶液中浸泡1－2h,再用无离子水或蒸馏水洗至pH值中性或PH4以上，并将其在抽滤漏斗中抽干；将抽干的离子交换剂浸泡在0.5N的NaOH溶液中1－2h，再用无离子水或蒸馏水将其洗至中性。
（2）装柱
将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中装有适宜浓度的柱材，轻轻倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降再层析柱底部，凝胶沉积直到离层析柱上端1.5－2cm处，停止装柱。层析柱上端进液口连接恒流泵，下出口连接蛋白质监测仪，待层析柱的平衡。
（3）平衡
在柱层析上样前必须对层析柱进行平衡，所谓平衡就是将层析柱中的溶液用层析过程的缓冲液（洗脱液）置换出来，使层析柱中的缓冲系统与柱层析过程中的系统一致。其方法是：利用层析柱上端的恒流泵将平衡缓冲液泵入到层析柱内，打开层析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，当下出口流出液的PH值与平衡缓冲液的PH值一致时，层析柱达到了平衡。在本实验中，用0.002M Tris-HCL缓冲液PH7.4(内含0.0001M EDTA)，预先将DE-52柱进行平衡。

『叁』 DE-52纤维素再生中，使用 NaOH洗脱吸附的球蛋白，洗下来的球蛋白是原来的结构还是已经变性

DEAE-纤维素 DEAE cellulose DEAE-纤维素 DEAE cellulose 为二乙氨乙基纤维素。是阴离子交换纤维素之一。 DEAE—纤维素的活化：称取IgDEAE32或52，放入5ml量筒中，加蒸馏水浸泡过夜，观察溶胀后DEAE的体积。根据所需层析柱的柱床体积计算所需DEAE的用量，称取所需DEAE用蒸馏水浸泡过夜，其间换几次水，每次除去细小颗粒。抽干，改用0.5ml/LNaOH溶液浸泡1h以上，抽干（可用布氏漏斗），用无离子水漂洗，使pH至8左右（用pH试纸检查）。再改用0.5ml/LHCl溶液浸泡1h以上，去酸溶液，用无离子水洗至pH6左右。本实验中在用前应以0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液，浸泡平衡后使用。 用过的离子交换剂可以反复使用，使其恢复原状的方法俗称“再生”。再生并非每次用酸、碱反复处理，通常只要“转型”处理即可。所谓转型就是使交换剂带上所希望的某种离子，如希望阳离子交换剂带上NH+4则可用NH4OH浸泡，如希望阴离子交换剂带上Cl—则用NaCl溶液处理。本实验中DEAE—纤维素在酸碱处理后，用0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲溶液浸泡即可转型，以HPO4取代DEAE中的OH—。一般由于DEAE—纤维素使用后因带有大量杂蛋白，所以再生时，先用0.5ml/L NaOH浸洗，用无离子洗至pH8左右，再转型，即可再使用。

『肆』 DEAE-52纤维素柱求助

DEAE-纤维素复 DEAE cellulose DEAE-纤维素 DEAE cellulose 为二乙氨乙基纤制维素。是阴离子交换纤维素之一。 DEAE—纤维素的活化：称取IgDEAE32或52，放入5ml量筒中，加蒸馏水浸泡过夜，观察溶胀后DEAE的体积。根据所需层析柱的柱床体积计算所需DEAE

『伍』 纤维素de52使用时的孔径是多大

DEAE-纤维素 DEAE cellulose DEAE-纤维素 DEAE cellulose 为二乙氨乙基纤维素。是阴离子交换纤维素之一。 DEAE—纤维素的活化：称取IgDEAE32或52，放入5ml量筒中，加蒸馏水浸泡过夜，观察溶胀后DEAE的体积。根据所需层析柱的柱床体积计算所需DEAE的用量，称取所需DEAE用蒸馏水浸泡过夜，其间换几次水，每次除去细小颗粒。抽干，改用0.5ml/LNaOH溶液浸泡1h以上，抽干（可用布氏漏斗），用无离子水漂洗，使pH至8左右（用pH试纸检查）。再改用0.5ml/LHCl溶液浸泡1h以上，去酸溶液，用无离子水洗至pH6左右。本实验中在用前应以0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液，浸泡平衡后使用。 用过的离子交换剂可以反复使用，使其恢复原状的方法俗称“再生”。再生并非每次用酸、碱反复处理，通常只要“转型”处理即可。所谓转型就是使交换剂带上所希望的某种离子，如希望阳离子交换剂带上NH+4则可用NH4OH浸泡，如希望阴离子交换剂带上Cl—则用NaCl溶液处理。本实验中DEAE—纤维素在酸碱处理后，用0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲溶液浸泡即可转型，以HPO4取代DEAE中的OH—。一般由于DEAE—纤维素使用后因带有大量杂蛋白，所以再生时，先用0.5ml/L NaOH浸洗，用无离子洗至pH8左右，再转型，即可再使用。

『陆』 急！急！如何装阴离子交换柱，使用时候出现气泡怎么除去谢谢

可以用适量的有机溶剂润洗一下层析柱，柱子体积较小的话就用玻璃棒搅匀排除一下气泡。

不管是干柱和湿柱，都要加层析液，不能要求一开始就没有气泡的。要用洗脱剂不停的洗脱，就是用配置好的试剂一边一边对柱子进行洗脱，这样不但可以消除气泡，还可以使硅胶充分沉降，让层析效果更好。等柱子没有气泡后在上样用洗脱液进行层析。

若柱中留有气泡或各部分松紧不匀（更不能有断层）时，会影响渗透速度和显色的均匀。去除就是用玻璃棒搅拌，赶走气泡。

(6)de52阴离子交换柱层析扩展阅读：

水溶液中一些阳离子进入了反离子层，而原来的反离子层中的阳离子进入了水溶液。这种在正常浓度下，反离子层与水溶液之间的各向同性离子交换称为离子交换作用。

离子交换主要发生在扩散层与正常水溶液之间。由于粘土颗粒表面通常带有负电荷，离子交换主要是阳离子交换，所以又称阳离子交换。离子交换严格遵循等价定律，即进入反离子层的阳离子等价于从反离子层排开的阳离子等价。

『柒』 Deae52阴离子交换柱上样量怎么确定，想尽可能上很多样品，但是不会影响分离效果

阴离子交换器 又叫阴床，作用是用阴树脂中的氢氧根交换掉水中的其他阴离版子。离子交换器分为权:钠离子交换器、阴阳床、混合床等种类，。离子交换柱(器)外壳一般采用硬聚氯乙烯(PVC)、硬聚氯乙烯复合玻璃钢(PVC-FRP)、有机玻璃(PMMA)、有机玻璃复合透明玻璃钢(PMMA-FRP)、钢衬胶(JR)、不锈钢衬胶等材质。主要用于锅炉、热电站、化工、轻工、纺织、医药、生物、电子、原子能及纯水处理的前道处理，工业生产所需进行硬水软化、去离子水制备的场合，还可用于食品药物的脱色提纯，贵重金属、化工原料的回收，电镀废水的处理等。 有机玻璃离子交换装置耐腐蚀、无色透明、适用于食品、医药、制糖及电子工业小规模纯水制备。碳钢衬胶离子交换装置具有制水量大、强度高、成本低等特点，适用于大型锅炉软化水及大规模纯水制备。

『捌』 DEAE-52离子交换层析中怎样确定Nacl浓度范围

要是没有任何文献报道过的，预试验建议作全部的0%-100%，然后看最后的内OD值合并峰值附近的收集液SephadexG-25除盐，容然后测定活性，确定你要收集的峰。这样肯定不会漏掉你要的峰。然后你就可以重复实验了。

『玖』 纤维素DE-52的介绍

为中等碱性阴离子交换剂，柱层析用于吸附剂，用以分离提纯多糖、肽、核苷酸、酶、血清组分和病毒等各种生物高分子。

『拾』 怎样利用离子交换柱层析法分离不同的蛋白质

离子交换柱层析法的核心在于不同的蛋白质的等电点不同
所以说，利用离子交换柱层析法分离不同的蛋白质其实就是利用不同蛋白质不同的等电点来分离。比如目的蛋白等电点是5，那么在环境pH为8.0的情况下，目的蛋白可以结合阴离子交换层析，而杂蛋白可能不能结合或者结合能力比目的蛋白弱。通过不同的盐浓度的洗脱让结合能力不同的蛋白在不同的组分被洗脱出来，最终完成对目的蛋白和杂蛋白的分离。