㈠ 细胞外泌体是什么
外泌体——是一类有细胞释放的细胞外囊泡。外泌体的特点见正文。
细胞外囊泡——简称EV，是由细胞释放的各种具有膜结构的囊泡结构统称，这些囊泡的直径可以从30、40nm到8、9um。细胞外囊泡有不同的亚群，而目前研究最火热的是外泌体这个亚群。
然而由于目前很难纯化到非常纯的外泌体亚群，人们纯化到的通常是直径小于200nm的囊泡，因此越来越多的人开始称之为sEV（即 small extracellular vesicle，小细胞外囊泡）。为了严谨，所以今天我们也以细胞外囊泡来称呼这些膜泡结构。本文中没有特殊说明的情况下，细胞外囊泡主要指外泌体和微囊泡。
今天主要介绍内容包括细胞外囊泡的研究意义、细胞外囊泡的分类、细胞外囊泡含有的成分、细胞培养上清的制备、细胞外囊泡的保存、细胞外囊泡的鉴定实验要求。所有内容都参考目前已发表的综述，并非hzangs杜撰。所以请新朋友们放心学习。
细胞外囊泡的研究意义
目前，细胞外囊泡的功能还没有完全阐明。已有的报道认为它们能够调节宿主-病原体的相互作用，参与传染性和炎性疾、神经疾病和癌症等很多种疾病的病理过程，同时在正常的生理过程中也发挥着介导细胞间通讯的重要功能，已有文章报道细胞外囊泡在发育中也发挥着重要作用。细胞外囊泡在临床医学中也有十分光明的应用前景，主要是因为它们含有丰富的生物标志物，可用于监测临床状态，治疗反应，疾病进展等，同时由于它们具有递送生物分子的功能，因此它们还有发展成临床药物递送载体的潜力。
细胞外囊泡的分类
细胞外囊泡—这个词是由国际细胞外囊泡学会（ISEV）创造的术语，根据细胞外囊泡的生物合成或释放途径可以对囊泡进行分类：外泌体（exosomes）直径为30-150nm，起源于内吞途径，其密度约为1.11-1.19g mL-1；微粒/微囊泡（microparticles/microvesicles）直接从质膜释放，直径约100-1000nm；凋亡小体（apoptotic body/bleb）直径约为50nm-2μm，由细胞凋亡产生；肿瘤小泡（large oncosomes）直径约1-10μm，由肿瘤细胞释放产生；以及其他各种EV亚群。由于不同EV亚群的大小以及它们的所包含的生物分子存在差异，因此现在已经有几个小组开始表征EV亚群的组成。最近的论文声称，基于一般表面蛋白质组学分析或个别EV群体的转录谱，对细胞外囊泡进行了成功的亚群分类。目前可以通过差速离心、过滤、免疫亲和、层析、流式细胞分选、密度梯度离心选取不同密度区域等多种手段大致分离不同的细胞外囊泡亚群，但是这些方法都不能完全纯化到特定的亚群，分离到的通常是富集了某一个亚群同时带有其他细胞外囊泡亚群。
细胞外囊泡含有的成分
细胞外囊泡的组成成分并不是随机的，每一个细胞外囊泡都会携带特定的分子信息。 实际上，这些纳米尺寸的细胞外囊泡能够携带蛋白质，脂质，核酸和糖等生物活性分子在细胞间传递信号，并且其包装的独特分子构成决定了要传递给受体细胞的细胞外信号的类型。有一个复杂的分选系统来决定那些分子能够进入细胞外囊泡。
细胞培养上清的制备
目前有两个策略来制备细胞培养上清用于提取细胞外囊泡。使用去除细胞外囊泡的胎牛血清（FBS）培养基培养细胞和使用不含FBS的培养基培养细胞（血清饥饿细胞）。但是目前一些高水平的文章报道使用的方法通常是前者。另外，有些文章开始关注去除细胞外囊泡的胎牛血清中游离RNA对实验结果的影响，但是目前并没有形成共识。如果需要先储存培养上清，一定量后再用于细胞外囊泡分离，那需要预先去除体系中的死细胞和细胞碎片。
细胞外囊泡的保存
Lőrincz等人曾对中性粒细胞来源的细胞外囊泡做了不同条件的储存，之后再去分析这些囊泡的特性，他们发现虽然细胞外囊泡样品中囊泡数量和形态没有明显变化，但即使是储存在-20或-80摄氏度情况下的细胞外囊泡也存在磷酯酰丝氨酸外翻明显增多的情况；但他们同时也发现，尿液来源的细胞外囊泡并没有这些变化。Kalra等人分离了来自结直肠癌细胞的细胞外囊泡，不同条件保存一定时间后进行PKH67染色跟踪细胞外囊泡的摄取，分析发现这些囊泡依旧可以被细胞摄取。就目前的情况，学者们并未就储存条件对细胞外囊泡是否有影响达成共识。因此建议大家实验时分离细胞外囊泡后尽快用于实验，尽量减少储存过程。
细胞外囊泡的鉴定及实验要求
根据国际细胞外囊泡协会于2014年发表的一个指导手册（MISEV），鉴定外泌体首先需要通过WB来鉴定细胞外囊泡的标志蛋白是否存在于样品中，通过电子显微镜来观察样品中细胞外囊泡的形态特征，通过NTA等手段来分析样品中细胞外囊泡的群体特征（粒子浓度、直径分布等）。
今天就先介绍到这里。细胞外囊泡领域作为生物学研究中的一个新兴领域越来越受到学者和生物公司的关注，也有越来越多的研究报道出现。但是我们也要清楚的认识到该领域的研究技术依旧不完善，对细胞外囊泡的认识依旧不充分，细胞外囊泡研究依旧处于一个起始阶段，要走的路还很长。
㈡ 外泌体保存液是什么
外泌体(exosomes)是一种由活细胞分泌，直径在30-150nm，具有双层脂质膜结构的小囊泡，它在机体内广泛存在，如外周血、腹水、尿液、唾液、脑脊液等各种体液中，内含丰富的蛋白质、脂质以及核酸等生物活性成分。外泌体参与物质运输，还携带和传递重要的生物信息，在介导免疫抗原递呈、树突状细胞的活化、神经退行性疾病发生、肿瘤细胞抗原的转移及肿瘤诊断治疗中发挥重要作用，吸引了很多科研人员的关注，在深入研究外泌体前，外泌体的提取纯化、鉴定及合理保存是首要的步骤，也是一切后续实验的基础，只有高活性、高稳定性的外泌体才能确保后续实验的质量和可信度。
目前外泌体只能在2～8℃稳定保存3天，-20℃稳定保存1个月。长期保存需要-80℃低温，并且不能冻融，存储条件要求高，这些缺点影响了外泌体的深入研究。
由此，有效保持外泌体的完整性、生物活性和内含物稳定性的外泌体保存液仍有待开发。
㈢ 用血清超速离心法提取外泌体，能提取到多少
绝大多数培养基是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上，添加了氨基酸、维生素和其它与血清中浓度相似的营养物质。最广泛应用的培养基是Eearle`s MEM 的混合物，其中含有13种必须氨基酸、8种维生素。而Ham`s F12 也包括非必须氨基酸，维生素的范围亦很广，另外常规含有无机盐和代谢添加剂（例如核苷酸）。MEM/F12 这两种培养基各取1/2，形成神经生物学最通用的培养基。Dulbecco`s改良培养基——DMEM，现应用于快速生长的细胞，同MEM含有相同的营养成分，但浓度高出2~4倍
㈣ 样品直接提取microrna和通过外泌体提取microrna有什么区别
首先要了解microRNA的分布，例如在血浆中microRNA有三种分布形式：游离状态、与蛋白结合形成复合体、包涵在囊泡中（外泌体是囊泡的一种）。
这样就清楚了，直接提是提全部，外泌体提取只针对一部分。
㈤ 什么是外泌体保存液
Exosome样本是进行有关外泌体的实验的基础，很多童靴认为这是最简单的。如果你真的这么认为，那么就大错特错了。收集样本有不同的要求，一个比一个重要。那该如何去选择我们的实验样本？取样的时候又该注意些什么？分离好后的外泌体又如何保存呢？
一、外泌体样本的选择和注意事项
实验样本不同在收集的时候需要注意的点不同。你研究的是哪种样本，需要特别注意哪些方面呢？看以下阐述：
1、细胞上清
选用细胞培养上清作为分离外泌体的实验材料不会像血样等存在样本量限制的问题，而且操作简单，直接离心即可。但在细胞培养过程中需注意污染、培养时间、细胞死亡率及FBS的问题。和所有的细胞实验一样，培养过程中不允许有污染，但有些培养细胞本身带有病毒基因组，在培养过程中会释放出病毒颗粒，这就要衡量病毒颗粒是否会影响后续实验。
一般培养24-48h后细胞即可分离外泌体，在特殊情况下，如在培养基中添加特殊的化学物质，培养15-60min即可收集。因细胞死亡会分泌小体，所以在研究外泌体时细胞的死亡率一定要控制 5% 之内。未经处理的FBS中含有大量的外源外泌体，所以细胞培养一定要用经过处理不含外泌体的FBS。
2、唾液
唾液的成分会因取样的位置和时间不同而不同，所以同血样一样需定点定时。唾液主要由舌下腺，颌下腺及腮腺3个腺体分泌，所以不同位置的唾液成分不同，在收集的时候需固定位置或是收集所有的唾液。不同时间段的唾液成分也会不一样，所以也需定时取。其他如吸烟进食都是禁止的，一般建议采样1h之内不能有进食行为，包括饮料，且不要剧烈运动，在平息状态下取样。最后一点，不能刷牙。
3、血液
在第一次外泌体课程的时候，就有许多同学问到关于血清和血浆选择的问题，那到底应该选哪个呢?血浆=血液-血细胞 血清=血浆-纤维蛋白原-凝血因子
分不清楚两者的弄清血清的来源就能牢牢记住啦。血清是血液凝固之后收集的液体，所以其中少了纤维蛋白原，凝血因子，以及多了很多凝血产物。纤维蛋白原可转化为纤维蛋白，具有凝血功能。在凝血过程中血小板会分泌大量的外泌体，有研究发现血清中有接近50%的外泌体来自额外的分泌。所以一般实验选择血浆，在特殊情况下，如研究与血小板相关的疾病的时候，当然是血清更适合。
受限于样本，血样一般取2ml。那取血样的时候有什么注意的地方呢？在外泌体的血样研究中，经常被忽略的一个问题就是针头的大小。在抽血过程中，血液流经针头的时候会产生剪切力，若针头太细，剪切力较大，会使细胞破碎或刺激血小板分泌外泌体，从而影响后续的实验。有些文献报道21号针头的大小比较合适作为外泌体研究的血样收集。其他诸如采血的位置，人的生理周期，饮食周期及时间周期（24h）等都会影响样品中的外泌体。所以取样的时候尽量定点定时。最后还需注意，尽量在采血30min内处理样本，因血液收集在收集管中时，血细胞和血小板还会分泌外泌体。
4、鼻涕
研究鼻涕有一个特殊的价值，其可以探索治疗性外泌体。啥是治疗性外泌体？在脑部的疾病治疗中，药物可以外泌体的方式注射到鼻腔，这样药物就可以避开血脑屏障。鼻涕的收集与许多环境因素相关，如年龄、季节、性别 、城市、过敏史及职业风险。鼻涕的收集方法没有统一标准，只需保证所有样本取样方法一致即可。
5、尿液
在尿液的取样中，除性别、年龄、进食等影响外，还有一个特殊的点即是尿液的新鲜程度，这个新鲜度指的是尿液在膀胱中存在的时间。
6、乳汁
乳汁中存在的外泌体、抗体等会影响新生儿的发育，具有较大的研究价值。泌乳的阶段、 胎次、膳食、泌乳量、是否是母乳喂养、母亲的健康状态、精神状态等都会影响外泌体的分泌。需要注意的是乳汁中含有大量的脂蛋白，会对后面分离外泌体产生影响。
7、脑脊液
脑脊液研究面临的困难主要在样本的获取及样本中外泌体丰度少，有木有一种雪上加霜的感觉。那这个问题如何解决？国外可购买商业正常样本或者使用其他疾病样本作为对照。
二、外泌体的保存
对于外泌体的保存，和其他分子样品一样，提取的外泌体低温保存即可，短时间（一周之内）可放4度，长时间放-20或-80。也有人认为放4度更好，怕低温冻融会影响外泌体的完整性，但目前还没有一个定论，而且大部分文献认为没有影响。那到底放几度呢？有一招，分装放-20或-80，是不是妥妥的。
㈥ 什么是外泌体保存液，外泌体保存液介绍
外泌体(exosomes)是一种由活细胞分泌，直径在30-150nm，具有双层脂质膜结构的小囊泡，它在机体内广泛存在，如外周血、腹水、尿液、唾液、脑脊液等各种体液中，内含丰富的蛋白质、脂质以及核酸等生物活性成分。外泌体参与物质运输，还携带和传递重要的生物信息，在介导免疫抗原递呈、树突状细胞的活化、神经退行性疾病发生、肿瘤细胞抗原的转移及肿瘤诊断治疗中发挥重要作用，吸引了很多科研人员的关注，在深入研究外泌体前，外泌体的提取纯化、鉴定及合理保存是首要的步骤，也是一切后续实验的基础，只有高活性、高稳定性的外泌体才能确保后续实验的质量和可信度。
目前外泌体只能在2～8℃稳定保存3天，-20℃稳定保存1个月。长期保存需要-80℃低温，并且不能冻融，存储条件要求高，这些缺点影响了外泌体的深入研究。
由此，有效保持外泌体的完整性、生物活性和内含物稳定性的外泌体保存液仍有待开发。
㈦ 提取组织中的rna，会把外泌体中的rna也提出来了吗
细胞外的RNA 通常是miRNA了，血浆可做，培养上清也可以，但RNA的提取需要特殊试剂盒，细胞外RNA通常在外泌体，不过看你要做哪方面的实验，一般来说检测培养上清中的RNA没有太大意义
㈧ 一般从血中能提取到多少ug的外泌体
看书
㈨ 外泌体添加化妆品里是多少单位
ml是体积单位，g是重量单位。
重量单位和体积单位的关系式为：质量=体积×密度。在不知道化妆品的密度的情况下，无法准确计算出质量。
以水的密度来看，1ml=1g，而大多液体护肤品以ml来计算，乳液、霜用g来计算，这是根据不同状态来区分的，所以化妆品会有ml和g两种单位。
9月21日下午，国家药监局于官网发布《化妆品标签管理办法（征求意见稿）》，消息甫出，业界哗然。其中争论的核心问题仍在于成分标注引发的功效宣称问题，这也是新《化妆品监督管理条例》（下称新《条例》）颁布带来的后遗症。
更多人认为，法规“意见稿”才是真正需要行业媒体表达声音的时候。《化妆品报》综合多位业内专家意见，帮助行业更好的理解法规最新动向。
1、微量添加等于概念性添加？
《办法》引发争议最多的是第12条关于微量成分标注的规定。
按照《办法》，“化妆品配方中存在含量不超过0.1%（w/w）的成分的，所有不超过0.1%（w/w）的成分应当以“其他微量成分”作为引导语引出另行进行标注，可不按照配方含量的降序列出。”
立刻就有人问，添加低于0.1%的成分就能起作用的化妆品怎么办？起到功效的成分还被列入了其他微量成分，这让品牌怎么宣传？
某原料公司的工程师告诉记者，从药品来讲，0.1%就能表达功效的成分是存在的，但在化妆品领域，对一般的美白、抗衰等功效而言，低于0.1%的含量就能起效的成分几乎没有。低于0.1%的添加还能发挥功效的，就只有防腐剂，它在低于0.1%的剂量下就可以起到防腐功效，但没有化妆品会去宣称自己的防腐功效。
对于业内盛传的 ppm级别（百万分之一）就能发挥化妆品功效的成分，该工程师告诉记者，他找不到这样的成分。但复配是个个例。他举例，化妆品的防晒或美白等功效通常需要通过多种防晒剂的组合添加方能奏效。以防晒为例，每个防晒剂都只有0.05%的含量，但这些成分复配起来，其总含量就超过了0.1%的可能性，但这些依然要被列在其他微量成分里。
除了复配的功效成分，被业界热议的主要是活性成分——在化妆品中，添加微量即能起到功效的成分主要是活性成分提取物。不过，在活性成分的添加含量之外，还有一个活性物的纯度问题。换言之，纯度和活性都会影响产品的功效。譬如许多日本的厂商将原料买回去后，都会进行二次处理，目的就是提纯，利用高纯度的活性成分提高产品功效。
有人认为，《办法》看起来更像是在鼓励企业购买低成本低纯度的活性成分。而那些添加了高纯度活性物的化妆品，却要被当做概念性化妆品加以打击。新《办法》似乎只强调了含量而未提及纯度，这一看法显然不够全面。实际上，今年8月推出的《化妆品注册与备案资料规范》（征求意见稿）和《化妆品新原料注册与备案资料规范》（征求意见稿），已经对化妆品原料和成分做出了详细的说明规定——要求化妆品企业在备案的时候，提交每个原料和成分的质量规格，也就是说，纯度问题在产品上市之前的注册和备案环节，就已经被“关照”到位。
对于一开始就奔着钻法规空子，利用低成本低纯度的成分，存心虚假宣传的品牌和企业来说，概念性添加的这扇门是严严实实地关上了，而对于真正想要认真做好品牌，拿真材实料严谨宣称的企业和品牌来说，新《办法》实际上是保护了他们。换言之，新《办法》对越规范的厂商越友好，尤其是本来就很注重法规不越界的品牌方。
更多人的理解是正面的——《办法》的主要作用是换种方式告诉大家不要乱来。拜尔斯道夫中国区企业事务及法务总经理雷开霆认为，为了一点点宣称，添加一点点的含量，其实难以保证功效，新的规定对于正规的企业是个好事情。“我想这也是监管部门从规范化妆品市场，让消费者拥有更多知情权、让品牌方真正做好产品的角度出发的吧。”
恩特科技总经理贾逸丹在接受记者采访时表示，“这需要行业上下共同对消费者进行教育，久而久之，消费者会明白，功效不取决于是否添加了某个成分，而是依据产品真实的功效验证。”贾逸丹认为，这将引导消费者去关注国家网站上公布的各个产品功效评价。
2、没有“偏向”进口品
反而增加了包材成本
有人说《办法》对进口品更友好，但也有人认为，《办法》实际上增加了进口品进入中国市场的成本。“标签的管理规定本身对国产和进口就是基本一致的，特别是中文体现的部分，不存在偏袒哪一方。如果一定要说的话，反而进口品的外文原包装也在一定程度上受到了监管，相当于是要按照中国的标准来了，要求是变严了，这在‘起草说明’ 里也有提到。”
比如，《办法》规定，直接接触内容物的产品包装容器上必须有中文名及保质期限的相关规定，也会对进口产品在原包装方面提出要求。众所周知，许多进口化妆品并未在接触内容物的产品包装上印有中文名和保质期限，特别是欧洲的产品，瓶身上很对只有产品批号，既没有中文标签，也没有保质期限。如果按照新《办法》，许多进口化妆品的包装都得更换，而这对企业来说无疑增加了很多成本。
此外，《办法》对产品原包装提出的要求，预计会引发一定的贸易关注，但考虑到《办法》只是对上位法《条例》相关内容的细化，且国外也有类似的管理规定，在继续坚持的同时，需要进一步做好沟通解释工作。
实际上，2014年《标签管理办法》对外征求意见时，引发最多贸易关注的部分就是借鉴药品的规定，必须专为中国设计中文包装。新《条例》在起草的过程中，对此条款进行了修订，规定可以加贴中文，但外文原包装的内容必须与加贴的中文标签一致，此做法较过去比相对宽松，但中文与外文一致，也强制了国外原包装必须符合中国的法规要求。也就是说，从《条例》到《办法》，法规对进口产品的监管也是同步趋严的，甚至可以说，对进口产品提出了更大的挑战。
3、冰点监管之下
化妆品行业或迎“跨境”潮
洗牌是必然的。“你去看新法规里面有多少规定，光是备案资料规范就有81页，我都还没看完，更不用说所谓的化妆品不良反应监管机制将跟接下来的续证挂钩，对质量负责人也有明文的专业及从业年资要求。”王楠预测，《办法》推出后，很多只会营销而不是真正专注做产品的品牌，尤其是现在一堆所谓互联网品牌，会在新一波法规实施后遇到很大的麻烦，甚至被洗牌。
《办法》意见稿推出的第二天，一家电子商务公司的则招聘启事引发了法规专业人士王楠（化名）的注意。在这个护肤产品经理的招聘上，明确要求产品经理要熟悉欧美系或日系产品开发动向。王楠说，这家企业对风向把控的很准——标准的电子商务公司要做跨境的节奏。
“跨境电商属于个人自用，民众自行负担风险，化妆品法规再严跟我（跨境电商）没有关系。”王楠说，未来一到两年内，大批的化妆品互联网公司将转向海外代工、加入跨境电商大军。
他还向记者透露，从2021年1月1日起，新的《化妆品监督管理条例》正式实施之际，各项配套法规或将逐条分批实施。
㈩ 外泌体提取用trizol可以吗
如何用癌细胞的细胞分泌外液中提取外泌体
小胶质细胞(microglia)是神经胶质细胞的一种，相当于脑和脊髓中的巨噬细胞，是中枢神经系统(CNS)中的第一道也是最主要的一道免疫防线。小胶质细胞大约占大脑中的神经胶质细胞的20%。小胶质细胞不停地清除着中枢神经系统中的损坏的神经，斑块及感染性物质。无数临床上和神经病理学研究表明激活的小胶质细胞在神经退化类疾病的发病机理中起到十分重要的作用，如帕金森病，多发性硬化和阿兹海默症等。但是过多激活或失控的小胶质细胞会引起神经毒性。他们是促炎因子和氧化应激的重要来源，如肿瘤坏死因子（TNF），一氧化氮，白介素等有神经毒性的物质