超滤血清

① 抗血清纯化都需要些什么设备阿

给你提供一个马血清制备过程，专利CN200510026317.3

1、一种马抗血清的制备纯化工艺，该工艺包括下述步骤： (1)消化步骤：用免疫血浆消化工艺将免疫血浆消化； (2)第一次沉淀过滤处理步骤：将上述处理的消化液中加入硫酸铵形成混悬液，并调节pH值为4.8-5.2，然后将混悬液加温并保持，再降温，过滤收集上清液，废弃沉淀； (3)第二次沉淀过滤处理步骤：将上述(2)步的上述清液pH值调整为7.0-7.4，加入硫酸铵进行第二次沉淀，静置后过滤取沉淀物，弃上清液； (4)明矾沉淀：即将上述(3)步的沉淀物稀释至蛋白含量不超过2g/L，再调整稀释液pH值为7.7-7.9，加明矾进行沉淀，静置后过滤取上清液，沉淀物废弃； (5)将上述上清液用硫酸铵沉淀法或超滤法浓缩制得抗血清原液； (6)离子交换剂吸附纯化： 1)用阴离子交换剂装柱，用pH值为7.0±0.2，0.15MNaCl，10mM磷酸盐缓冲液进行平衡； 2)将用0.45μm的膜进行澄清过滤的抗血清原液通过上样泵加入柱体上部，用 pH值为7.0±0.2，0.15MNaCl，10mM磷酸盐缓冲液洗柱，流速为3ml/min，收集穿透液，酸性杂质被吸附在层析介质上，F(ab)2流穿； 3)用2MNaCl清洗柱体后，用20％乙醇洗柱，使介质浸泡其中保存； 4)将穿透液超滤浓缩调整抗血清浓度，调整蛋白含量不超过170g/L，按调整后制品总量，加氯化钠使最终含量为750-950g/L，加三氯甲烷使最终含量不超过5g/L 或硫柳汞0.1g/L或间甲酚2.5g/L为防腐剂，调节pH至6.0-7.0，用0.22um滤膜除菌过滤。

② 超滤原理的超滤应用

超滤（Ultrafiltration）技术是一来种膜滤自法，也有错流过滤（Cross Filtration）之称。它能从周围含有微粒的介质中分离出10~100A的微粒，这个尺寸范围内的微粒，通常是指液体内的溶质。其基本原理是在常温下以一定压力和流量，利用不对称微孔结构和半透膜介质，依靠膜两侧的压力差作为推动力，以错流方式进行过滤，使溶剂及小分子物质通过，大分子物质和微粒子如蛋白质、水溶性高聚物、细菌等被滤膜阻留，从而达到分离、分级、纯化、浓缩目的的一种新型膜分离技术。

③ 单纯超滤的注意事项

（一） 患者血细复胞比容（制Hct）水平越高，越容易在单纯超滤过程中因血液浓缩、血液粘度上升而使血流阻力增加。因此对于Hct 较高的患者，应适当增加抗凝药物的剂量。
（二） 患者血清白蛋白水平越高，单纯超滤过程中血清蛋白成份越容易黏附于滤器膜上，而影响超滤效果；若血清白蛋白水平过低，血浆胶体渗透压下降，可以导致单纯超滤过程中患者组织间隙中的水分回流入血减少，血管再充盈不足，容易发生低血压而难以完成超滤目标，此类患者在单纯超滤过程中是否补充血清白蛋白制剂，应依据临床实际情况做出判断。
（三） 温度过低将增加血液粘度，影响超滤效果。因此，单纯超滤过程中应注意给患者保温。
（四） 单纯超滤过程中，血液中电解质成份将随水分等比例清除，因此超滤结束后患者体内各种电解质的总量、尤其是钠离子总量将降低；而超滤引起的有效循环血容量的下降，将刺激交感神经兴奋，促使钾离子从细胞内移向细胞外，因此，超滤结束后患者血清钾水平可能升高。
（五） 选择高通量滤器，有助于完成目标超滤量；但超滤过程中氨基酸等营养物质的丢失也会因此而增多。

④ 超滤膜以什么为截流指标

超滤膜的3项标准中，关于截留性能的测试，都采用标准HY/T050—1999的方法。在该标版准中，权规定用于超滤膜截留性能的测量的基准物质为以下几种：聚乙二醇(分子质量为6000、10000、20000u)；细胞色素C(分子质量为13000u)；卵清蛋白(分子质量为45000u)；牛血清蛋白(分子质量为67000u)。

详细可见:网页链接

⑤ 全血分离获得血清的方法及步骤 谢谢

材料与方法

1.1 血清采集 MG患者全血来自～2005年就诊于辽宁中医学院附属医院的门诊患者。根据典型临床表现、新斯的明试验、低频重复电刺激及单纤维肌电图等确诊，无其他自身免疫性疾病，未经其他免疫抑制治疗，并参照1994年版《中医病证诊断疗效标准》辨证为脾肾虚型。正常人血清取自同时期健康志愿者。-70 ℃冰箱冷冻保存备用。

1.2 主要试剂 固相pH梯度干胶条IPG strip（Amersham公司产品， 非线性pH 3～10， 7 cm）。3-〔3-（胆酰胺基丙基）二甲氨基〕丙磺酸盐｛3-〔（3-cholamidopropyl） dimethylamino〕-1-propanesul-fonate， CHAPS｝，二硫苏糖醇（DL-dithiothreitol， DTT），三丁基膦（tributyl phosphine， TBP），尿素，硫脲，碘乙酰胺（iodoacetamide， IAA），丙烯酰胺（acrylamide）、甲双丙烯酰胺（N， N'-methylenebi-sacrylamide），四甲基乙二胺（N， N， N， N-tetram-ethyl-ethylenediamine， TEMED），过硫酰胺（am-monium persulfate， APS），三羟甲基氨基甲烷〔tris （hydroxymethyl） aminomethane〕、甘氨酸（glycine， Gly）和十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate， SDS）均为Bio-Rad公司产品。琼脂糖为华美生物公司产品。其他试剂均使用国产分析纯试剂。所有溶液均用MilliQ水配制。

1.3 主要仪器 高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司产品;EttanTMIPGphorⅡ，Amersham Biosci-ences公司产品;P-2000分光光度仪，Hitachi公司产品;SE-600电泳仪，Amersham公司产品;纯水装置，Millipore公司产品;GS-710光密度扫描仪，Bio-Rad公司产品;冷却水循环系统，Cole-Parmer公司产品;Bruker-Daltonics AutoFlex TOF-TOF LIFTMass Spectrometer，美国Bruker-Daltonics公司产品;LCQ Deca XP Plus，美国Thermo Finnigan公司产品。

1.4 双向电泳

1.4.1 血清总蛋白质的提取及定量 血清-70 ℃反复冻融4次后，用Agilent Multiple Affinity Re-moval Column处理去除高丰度蛋白。使用Agilent 5K超滤管进行浓缩除盐，冻干回收的样品，-70 ℃保存。用裂解液（9 mol/L 尿素、4% CHAPS、 65 mmol/L DTT和cocktail酶抑制剂）进行复溶，并采用考马斯亮蓝法进行蛋白质定量。

1.4.2 等电聚焦 自-20 ℃取出的胶条，室温下平衡10 min，以500 μg上样量在每份样本中加入上样缓冲液（8 mol/L尿素、2% CHAPS、1% Bio-lyte和1% TBP）以及标准蛋白质分子，上样于泡胀槽中，加入矿物油覆盖。程序设置如下:30 V 12 h，500 V 1 h，1 000 V 1 h，8 000 V 6 h。恒温20 ℃。等电聚焦电泳后IPG胶条在平衡液1（Tris-base 50 mol/L 、尿素 6 mol/L、甘油 30%、SDS 2%、溴酚蓝0.002%和DTT 100 mg）中于振荡器上振荡 15 min; 然后置入平衡液2（成分同平衡液1，用 400 mg 碘乙酰胺代替100 mg DTT）同样于振荡器上振荡15 min。

1.4.3 SDS-PAGE垂直电泳 采用12.5%的均匀SDS2聚丙烯酰胺凝胶（水23.2 ml，30%丙烯酰胺溶液32.46 ml，1.5 mol/L Tris-HCl缓冲液pH 8.8 20 ml，10% SDS 0.8 ml，10% APS 0.4 ml，TEMED 3.76 μl，胶总体积80 ml）。将平衡后的IPG胶条移至凝胶的上方，胶条一端放入低分子量蛋白质标准，0.5%的琼脂糖封胶。上下槽加入电极缓冲液（Tris 5 mmol/L，Gly 192 mmol/L和SDS 0.1%）。初始电流为每块胶40 mA，电泳20 min，然后以每块胶60 mA电流，直至溴酚蓝前沿。

1.4.4 银染色 电泳结束后，采用硝酸银染色法，通过固定，硝酸银染色，显影，停显及脱色，至背景清晰。

1.5 图像分析 每个样品常规进行3次二维电泳，用GS-710光密度扫描仪对电泳后的胶图分别进行扫描，所得扫描图像输入计算机，采用Image-master软件对图像进行背景消减、蛋白质点检测和校正，获取蛋白质点的位置坐标和表达量等分析。选取 Ratio ≥1.5的蛋白质点认为有差异。所有数据的统计分析均采用SPSS 12.0软件，统计学分析采用 t 检验。

1.6 基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱分析 用手术刀片切下胶上目标条带，进行切胶、胶上胰蛋白酶酶解 20 h ，抽提酶解肽段，Zip Tip脱盐后点样，行基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry， MALDI-TOF-MS）分析（飞行管长2.7 m，加速电压 20 kV ，反射电压23 kV）。将第1级质谱得到的肽片段质量指纹图谱、肽质量指纹图谱与第2级质谱得到的肽序列信息一起用来检索蛋白质数据库，找出匹配的蛋白质。

1.7 数据库检索 将质谱鉴定所得的肽质量指纹谱（peptide mass fingerprinting， PMF）数据于Bio-Works（Thermo Finnigan， San Jose， CA）软件搜索相应的库。搜索使用的数据库为IPI human蛋白库（SEQUEST结果过滤参数为:当Charge+1，Xcorr≥1.9;当Charge+2，Xcorr≥2.2;当Charge+3，Xcorr≥3.75;其中DelCN≥0.1）以及NCBI上 Homo sapiens的非冗余蛋白库（rendant data-base）。检索参数为胰蛋白酶解;氨基酸固定修饰方式为脲甲基半胱氨酸;模式为单同位素峰;肽片断最大误差控制在100 ppm;肽片断最大分子量误差为±0.5 Da;每个肽允许有1个不完全裂解位点。

2 结果

2.1 脾肾虚型重症肌无力患者血清双向电泳图谱 的建立及分析 经2-DE技术及银染色后，得到了两组血清的双向凝胶电泳图，并于相同的条件下重复实验3次。在正常对照组细胞蛋白质组双向电泳图谱上可观察到1 463±179个蛋白点，而脾肾虚型重症肌无力组可见到1 508±89个蛋白点

⑥ 哪些因素会影响超滤膜组件截留分子量

会影响超滤膜组件截留分子量的因素：

1、进水压版力对纳滤膜的影响

进水压力本身并权不会影响盐透过量，但是进水压力升高使得驱动纳滤膜的净压力升高，使得产水量加大，同时盐透过量几乎不变，增加的产水量稀释了透过膜的盐分，降低了透盐率，提高脱盐率。当进水压力超过一定值时，由于过高的回收率，加大了浓差极化，又会导致透过量增加，抵消了增加的产水量，使得脱盐率不再增加。

2、进水TDS含盐量对纳滤膜的影响

渗透压是水中所含盐粉或有机物浓度的函数，含盐量越高渗透压也增加，进水压力不变的情况下，净压力将减小，产水量降低。透盐率正比于膜正反两侧盐浓度差，进水含盐量越高，浓度差也越大，透盐率上升，从而导致脱盐率下降。

纳滤膜的应用非常广泛，在医疗、环保等等的行业都有所涉及，为了确保其应用性能的稳定性，应注意进水压力及进水TDS含盐量对纳滤膜的影响。