① 同一个超滤浓缩管可以用来纯化不同的蛋白吗
不可以的
不管是哪个公司生产超滤浓缩管使用后都会有蛋白残留在滤膜上,而不管是使回用氯化钠或答者氢氧化钠清洗都不能确保可以完全清理掉残留在膜上的蛋白。
如果不同的蛋白间混合使用,可能前一个蛋白会污染到后一个蛋白,甚至有些某些高活性的酶残留在上面会造成后一个蛋白被酶切降解,造成不必要的损失。
② SDS为什么可以去除DNA上结合的蛋白质
SDS是一种含大量负电荷的物质,可以改变蛋白质的空间结构,使蛋白质发生完全变性,与DNA分离。
③ 提取基因组dna过程中,如何去除蛋白质,多糖和脂类等生物大分子
提取基因组dna过程中,如何去除蛋白质,多糖和脂类等生物大分子
不同生物(植物、动物、微生物)的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同,分离方法也有差
异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时, 应考虑除去多糖和酚类物质。
本实验以水稻幼苗为材料,学习基因组DNA提取的一般方法。
DNA
一、材料
水稻幼苗
二、设备
移液器,冷冻高速离心机,台式高速离心机,水浴锅,陶瓷研钵,50ml离 心管(有盖)及5ml和1.5ml离心管,弯成钩状的小玻棒。
三、试剂
1、提取缓冲液?:100mmol/L Tris?Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L
NaCl, 1.5% SDS。
2、提取缓冲液?:18.6g葡萄糖,6.9g二乙基二硫代碳酸钠,6.0gPVP,240ul巯基乙醇,加水至300ml。
3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇
4、 RnaseA母液:配方见第一章。
5、其它试剂:液氮、异丙醇、TE缓冲液,无水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。
四、操作步骤:
(一)水稻幼苗或其它禾木科植物基因组DNA提取
1. 在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液?, 60?水浴预热。
2. 水稻幼苗或叶子5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热
的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60?水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高), 不时摇动。
3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤),室温下静置5-10分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。
4. 室温下5000rpm离心5分钟。
5. 仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。
6. 在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解于TE。
7. 如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟, 再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60?水浴放置15分钟以上,以帮助溶解。
8. 将DNA溶液3000rpm离心5分钟, 上清液倒入干净的5ml离心管。
9. 加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37? 10分钟, 除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响,可省略该步骤)。
10. 加入1/10体积的3mol/L NaAc及2×体积的冰乙醇,混匀,-20?放置20分钟左右,DNA形成絮状沉淀。
④ 超滤离心管能分离蛋白和聚乙二醇吗
超滤离心管可以用来分离蛋白和聚乙二醇的
聚乙二醇(PEG)是一种分子量内很小的试剂,而超滤管的容截留分子量一般是在3000道尔顿~10000道尔顿之间。绝大多数蛋白可以被截留在超滤管上层,而聚乙二醇可以穿透滤膜到达超滤管下层
所以超滤离心管可以用来分离蛋白和聚乙二醇的
⑤ 为什么要从蛋白样品中去除DNA脱氧核糖核酸酶与其有什么关系
因为DNA会干扰蛋白质的光学测定或化学反应。
脱氧核糖核酸酶可以消化样品中的DNA,提高蛋白质样品的纯度。
⑥ 醇是如何去除蛋白质的,然后是在DNA沉
氯仿除去蛋白:氯仿是非极性分子,水是极性分子,当蛋白水溶液与氯仿混合时,蛋白质分子之间的水分子就被氯仿挤去,使蛋白失去水合状态而变性.经过离心,变性蛋白质的密度比水的密度为大,因而与水相分离,沉淀在水相下面,从而与溶解在水相中的DNA分开.而酚与氯仿有机溶剂比重更大,保留在最下层.加入异戊醇能降低分子表面张力,能减少抽提过程中的泡沫产生.同时异戊醇有助于分相,使离心后的上层水相,中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定. 加预冷的乙醇:冷的乙醇沉淀能力更强.乙醇沉淀DNA的机理是,DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在,当加入乙醇时,乙醇会夺去DNA周围的水分子,使DNA失水而易于聚合. SDS:SDS只是阳离子表活性剂,是蛋白质,特别是膜蛋白的变性剂.在基因组DNA提取中,SDS只是起破碎细胞游离核酸的作用,无法使DNA与蛋白质分离的.只有在碱裂解法提取质粒DNA,通过高盐(醋酸钾或醋酸钠)及低pH(4.5左右)中和下,SDS会沉淀,SDS沉淀过程中使得变性的DNA共沉淀,而经过中和复性的质粒DNA则不会沉淀,再通过离心即可把质粒DNA与基因组DNA及蛋白质分离. RNase是RNA酶,能特定消化RNA,而不是蛋白质. 核酸分子(DNA或RNA)由于含有嘌吟环和嘧啶环的共轭双键,在260 nm波长处有特异的紫外吸收峰,其吸收强度与核酸的浓度成正比,这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础.蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质.吸收高峰在280nm 处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比.紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度,还可通过测定260nm和280nm的紫外线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度,纯的DNA制品的比值为1.8,RNA的比值为2.0, 若DNA高于1.8,则可能有RNA污染,低于1.8则有蛋白质污染. 现在试剂盒是很普及的,使用试剂盒基本上不再需要酚,氯仿等有机溶剂.国内很多厂家都有产,本人使用过广州捷倍斯生物产的感觉就很不错.
⑦ 蛋白质提取和分离过程中进行透析可除去溶液中的DNA。
透析用的是半透膜,只能去小分子,而DNA是大分子,透不过的。
⑧ 提取DNA时除去蛋白质的方法有哪些
酚氯仿反复抽提两次,既可有效的去除蛋白质残留。
⑨ 如何去除血清中的蛋白质,保留DNA
采用异丙醇,可以将蛋白变性,通过离心后,蛋白就会沉在下面的有机相,DNA在上面的水相。