水和废水中叶绿素的测定方法

① 测叶绿素的方法

叶绿素含量的测定方法主要有紫外分光光度法、荧光分析法、活体叶绿素仪法、光声光谱法和高效液相色谱法。不过目前应用最为广泛的还是分光光度法。叶绿素提取液的吸收光谱表明：有两个强吸收峰，分别在红光区和蓝紫区，不同提取溶剂和原料所得的叶绿素溶液的吸收光谱比较相似。叶绿素a、叶绿素b的红区最大吸收峰分别在663nm、645nm附近，在蓝紫区分别为429nm、453nm附近。由于提取溶剂和原料不同，对叶绿素提取液进行光谱扫描后，所得的最大吸收值可能有较小范围的浮动。高效液相色谱(HPLC)定量检测叶绿素含量准确率较高，效果很好。用甲醇和丙酮作为流动相，体积比为80：20时，同时在流动相中加入质量分数为0.1%的冰醋酸，流速为1.0mL/min。利用每一种色素的色谱峰面积进行定量，叶绿素a、叶绿素b的定量可通过外标法由工作曲线求得。[8]稳定性影响因子光在活体植物中，叶绿素得到了很好的保护，既可以发挥光合作用，又不会发生降解。但离体叶绿素对光照很敏感，光和氧气作用可导致叶绿素不可逆的分解。在自然条件或以胶态分子团存在的水溶液中，叶绿素在有氧的条件下，可进行光氧化而产生自由基，因此一些研究人员认为叶绿素的光氧化降解必需有氧分子参与，而且其降解速率随氧分子浓度的升高而加快。单线态氧和羟基自由基是叶绿素光化学反应的活性中间体，可与叶绿素吡咯链作用而进一步产生过氧自由基和其他自由基，最终可导致卟啉环和吡咯链的分解既而造成颜色的褪去。当然影响光氧化的因素有很多，比如体系中的水分、温度、光照时间、光照强度、光的波长范围等等，在这些影响因素中主要有光照时间、光照强度、光的波长范围、氧的浓度。目前在此方面的研究主要集中在自然光(复合光)对色素的影响而且大多数研究不是很深人。对于单色光(不同波段的光)对叶绿素稳定性的影响研究方面的报道却较少。叶绿素酶已有研究表明，叶绿素酶是一种糖蛋白。叶绿素酶催化叶绿素结构中的植醇键而水解生成脱植叶绿素，是叶绿素降解中的关键酶。叶绿素酶是以叶绿素作为底物的，它是一种酯酶。脱镁叶绿素也是叶绿素酶的底物，酶促反应的产物是脱镁脱植叶绿素。叶绿素酶的最适反应温度在60～80℃范围，实验证明，叶绿素酶在80℃以上其活性下降，100%时已完全失活。温度一些研究表明，叶绿素提取液在不同受热温度下，其降解速率曲线有明显的拐点，叶绿素在80℃以下，降解速度较慢，90℃以上降解速度急剧加快。总体而言，随着温度的升高，叶绿素降解的速率是逐渐加快的，只是较低的温度下降解速率不明显。pH值

② 怎样测叶绿素a 以及怎样进行蓝藻计数

欲知封闭水域会否出现藻类疯长，如蓝藻爆发等现象，应监测水域中的藻类数量以及水质，由于对藻类等浮游植物采用计数的方法测定误差较大，耗时费力，对检测人员的工作经验要求相对较高，一般可测定水中的叶绿素a含量代替藻类测定。当水中的叶绿素a含量突然增高，而且水中含有大量氮、磷等营养物质，加上阳光照射强烈，气候炎热等因素，该水域极有可能发生藻类疯长，可通知各有关部门尽早采取应对措施。

因为藻类是一类含叶绿素的、光合自养的、无胚的原植体植物，在浮游藻类里叶绿素a的含量大约占有机物比重的1～2%，是估算藻类生物量的较好指标。可预先测定藻类计数和叶绿素含量的相关关系，以叶绿素a的含量来推算藻类的数量，即通过测定水中的叶绿素来快速了解藻类的大致数量。

测定叶绿素a的仪器和方法有许多种，分光光度法测定叶绿素a是一简便易行的测定方法，水样经离心或过滤浓缩、研磨、丙酮提取后，定容，取上清液分别测量750nm、645nm、663nm、652nm等几个波长下的吸光度值，根据经验公式可分别计算出叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量。

分光光度法测定叶绿素a，与测定其他物质稍有不同，如：测磷只需测定单一波长的吸光度值，再以该吸光度值代入由标准溶液测得的校准曲线计算含磷量。而叶绿素a无法使用校准曲线，需用几个波长下的吸光度值，根据经验公式来分别计算出各项指标的含量。因为叶绿体色素由叶绿素a、叶绿素b等物质组成，试液是多组分的混合溶液，在试液中分离这几类物质的难度较大，且无必要。叶绿素a在645nm和663nm 处均有吸收，在645nm处吸光系数较小，为16.75，在663nm 处较大，为82.04；叶绿素b 在645nm和663nm 处亦都有吸收，但在645nm处吸光系数较大，为45.60，在663nm 处较小，为9.27。由此可知：叶绿素a的吸收峰值出现在663nm 处，该吸收曲线延伸到645nm处，在此波长处的吸收系数不如在663 nm 处大，因此在计算公式中求算叶绿素a的含量时，需扣除叶绿素b在663nm和645nm 处的吸光度值，再进行计算。

标准分析方法要求，叶绿体色素提取液不可浑浊，在710nm或750nm波长下测量吸光度，其值应小于叶绿素a吸收峰的吸光度值的5％，否则应重新过滤。假定样品在663nm处的吸光度值为0.03，则在750nm处的吸光度值不得大于0.0015，对试液的清澈程度要求很高，测量710nm或750nm的目的是避免悬浮物质的干扰，一般测量水中的浑浊度所采用的波长为680nm，为避免在680nm处仍有叶绿素a产生的吸收值，故将测量浑浊度的波长选在710nm以上。在计算公式中，凡参与计算的各吸光度值都应减去710nm处的吸光度值，以扣除悬浮物质的干扰。

采用分光光度法测定叶绿素含量，对测量仪器分光光度计的波长精确度要求较高。如果波长与原吸收峰波长相差1nm，则叶绿素a的测定误差为2％，叶绿素b为19％，使用前必须对分光光度计的波长进行校正。校正方法除按仪器说明书外，还应以纯的叶绿素a和b来校正。

③ 叶绿素含量测定

常用叶绿素提取试剂： 丙酮 、乙醇、 N，N-二甲基甲酰胺(DMF)
提取方法：研磨、浸泡
丙酮法测定叶绿素含量
乙醇:丙酮:H2O = 4.5:4.5:1 (体积比)
提取方法对比：
常规方法是研磨提取
改进方法是浸泡提取
提取注意事项：

叶绿素a = (12.72A663-2.59A645) × v/w × 1,000
叶绿素b = (22.88A645-4.67A663) × v/w × 1,000
叶绿素总含量 = (20.29A645+8.05A663) × v/w × 1,000

④ 如何测量水体叶绿素浓度，蓝藻浓度，微囊藻浓度

可以使用仪器。。请你看以下的内容

因为水藻中也有叶绿体，所以可以检测到湖泊里的藻类。

SPAD-502 叶绿素仪可以即时测量植物的叶绿素相对含量或“绿色程度”，从而可以了解植物真实的硝基需求量并且帮助您了解土壤硝基的缺乏程度或是否过多地施加了氮肥。您可以通过这种仪器来增加氮肥的利用率，并可保护环境（防止施加过多的氮肥而使环境特别是水源受到污染）。

原理：

SPAD-502 叶绿素仪通过测量叶片在两种波长范围内的透光系数来确定叶片当前叶绿素的相对数量。
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当然是PAM-2100和MINI-PAM了！

1983年，WALZ公司首席科学家、德国乌兹堡大学的Ulrich Schreiber教授设计制造了全世界第一台调制荧光仪——PAM-101/102/103，使在自然光下测量叶绿素荧光成为现实，解决了科学界近50年的技术瓶颈。PAM-101/102/103迅速在植物生理、生态、农学、林学、水生生物学等领域得到广泛应用，出版了大量高水平研究文献。但该仪器比较笨重，不易带到野外。

1992年，WALZ公司首席科学家、调制荧光仪发明人、德国乌兹堡大学的Ulrich Schreiber教授设计制造了全世界第一台便携式调制荧光仪——PAM-2000，并且在植物生理生态学等科研领域得到广泛应用，此后十几年中成为全球最畅销的调制荧光仪。

1996年，WALZ公司在浓缩PAM-2000功能的基础上，设计制造了一台更加方便携带的超便携式调制荧光仪——MINI-PAM。该仪器对PAM-2000的功能进行了浓缩，更加适合野外操作，同时价格也更加便宜。

2003年，WALZ公司在保留PAM-2000所有功能和优点的基础上，结合最新技术，将PAM-2000升级到了PAM-2100。

PAM-2100

系统描述
PAM-2100采用了独特的调制技术和饱和脉冲技术，从而可以通过选择性的原位测量叶绿素荧光来检测植物光合作用的变化。PAM-2100的调制测量光足够低，可以只激发色素的本底荧光而不引起任何的光合作用，从而可以真实的记录基础荧光Fo。PAM-2100具有很强的灵敏度和选择性，使其即使在很强的、未经滤光片处理的环境下（如全日照甚至是10000 μmol m-2 s-1的饱和光强下）也可测定荧光产量而不受到干扰。因此，PAM-2100不但适合在实验室人工控制的环境下测量，还可以在自然环境中甚至是强烈的全光照条件下开展野外科学研究。

PAM-2100是非常便携、强大的测量系统，它将各种光学和电子元件组装在一个24 cm×10.5 cm×11 cm的外壳中。测量光由655 nm的发光二极管（LED）发出，可在低频（600 Hz）和高频（20 kHz）间自动切换。光化光（光合生物实际可吸收利用进行光合作用的可见光）由卤素灯（白光）或红光LED（655 nm）提供。远红光（735 nm，促进光系统I迅速消耗掉在PQ处累积的电子）由LED发出。

PAM-2100的按键操作非常简单。基础测量只需单健操作。数据在内置电脑中自动分析、存储并且在显示屏上显示。除了“参数窗”外，在“动力学窗”还可显示曲线的实时变化。

PAM-2100利用光纤进行信号传输。光适应叶夹2030-B（专利产品）上配备微型光量子/温度传感器，可在记录荧光信号的同时，同步记录光合有效辐射（PAR）和温度变化。

PAM-2100内设10个标准Run（预先编好的间隔一定时间并按一定顺序执行特定命令的程序），用户只需一次按键就可进行复杂的实验。用户还可对这些标准Run进行编辑得到自己的User-Run（数量不限），来满足特殊的实验需要。
PAM-2100主机可以直接连接电脑（圆口）键盘，在野外现场，可以根据实验需要，不需电脑就可以进行特殊程序的编辑。

PAM-2100还可以设定单机操作软件DA-2100自动间隔一定时间执行某个Run或User-Run，而Run是可以无限扩展的，因此，可以说PAM-2100的功能几乎可以无限扩展。只要将主机和叶夹（均可固定在三角架上）固定好，按一次按键，（人不在现场看守）仪器可以自动进行非常复杂的测量过程。

此外，PAM-2100主机还可以连接电脑显示器或投影仪放大显示，非常适合进行教学使用。

特点
1) 声誉卓著的PAM-2000的升级版
2) 精巧、准确、迅速、操作简便的高级光合作用检测设备
3) 可单机操作（采用内置电脑，DA-2100软件记录），可连接外置电脑操作（Windows操作软件PamWin）
4) 便携式设计，带大屏幕液晶显示屏（可显示曲线变化）和20个按键
5) 强大的数据收集、分析和存贮功能
6) 可以预先编写和设定程序，进行特殊研究目的测量
7) 内置锂电池可满足长时间野外工作需要，并可连接外置12 V电池
8) 多种叶夹可供选择，专利设计的光适应叶夹2030-B可同时记录PAR和温度变化
9) 光源选择：自然光，内置光源（提供测量光、光化光、饱和脉冲和远红光），可选外置卤素灯光源（特别适合野外研究）

功能
1) 可测荧光诱导曲线的快速上升动力学O-I-D-P相和O-J-I-P相
2) 可测荧光诱导曲线的慢速下降动力学并进行淬灭分析（Fo, Fm, Fv/Fm, F, Fm, Fo’, dF/Fm’, qP, qN, NPQ, rETR等）
3) 可测光响应曲线和快速光曲线（RLC）
4) 仪器内置一系列标准实验（Run1～Run10），用户可对其进行编辑建立自己的User-Run
5) 可在线检测植物、微藻、地衣、苔藓等的光合作用变化
6) 单机操作功能强大，特别适合野外操作，实验室内单机操作时可连接电脑显示器或投影仪放大显示

应用领域
仪器设计特别适合野外使用，可用于研究光合作用机理、各种环境因子（光、温、营养等）对植物生理状态的影响、植物抗逆性（干旱、冷、热、涝、UV、病毒、污染、重金属等）、植物的长期生态学变化等。在植物生理学、植物生态学、植物病理学、农学、林学、园艺学、水生生物学、环境科学、毒理学、微藻生物技术、极地植物光合作用研究等领域有着广泛应用。

10个标准Run
Run 1：测量实际量子产量Yield（ΔF/Fm’）
Run 2：测量最大量子产量Fv/Fm
Run 3：记录诱导曲线并进行淬灭分析（采点率10 ms/点）
Run 4：记录诱导曲线并进行淬灭分析（采点率30 ms/点）
Run 5：qN 的驰豫动力学
Run 6：快速诱导动力学O-I-D-P相（线性时间）
Run 7：快速诱导动力学O-J-I-P相（对数时间）
Run 8：光响应曲线（需76 min）（稍加编辑即可测量快速光曲线）
Run 9：光响应曲线（需33 min）（稍加编辑即可测量快速光曲线）
Run 10：仪器自检

用户可根据实验需要，自行修改或编制程序。

MINI-PAM

MINI-PAM采用了独特的调制技术和饱和脉冲技术，从而可以通过选择性的原位测量叶绿素荧光来检测植物光合作用的变化。MINI-PAM的调制测量光足够低，可以只激发色素的本底荧光而不引起任何的光合作用，从而可以真实的记录基础荧光Fo。MINI-PAM具有很强的灵敏度和选择性，使其即使在很强的、未经滤光片处理的环境下（如全日照甚至是10000 μmol m-2 s-1的饱和光强下）也可测定荧光产量而不受到干扰。MINI-PAM是野外光合作用研究的强大工具。
超便携式调制叶绿素荧光仪MINI-PAM的特点在于快速、可靠的测量光合作用光化学能量转换的实际量子产量。此外，MINI-PAM秉承了WALZ公司PAM系列产品的一贯优点，通过应用调制测量光来选择性的测量活体叶绿素荧光。基于创新性的光电设计和高级微处理器技术，MINI-PAM在达到超便携设计的同时可以得到灵敏、可靠的结果。同时，MINI-PAM的操作非常简单。
测量光合量子产量只需一个按键（START）操作即可，仪器会自动测量荧光产量（F）和最大荧光（Fm），并计算光合量子产量（Y＝ΔF/Fm），得到的数据会在液晶显示屏上显示同时自动存储。此外MINI-PAM还有许多模式（MODE）菜单，包括荧光淬灭分析（qP、qN和NPQ）和记录光响应曲线等，以满足用户的特殊需要。
连接光适应叶夹2030-B后，可以测量光合有效辐射（PAR）、叶片温度和相对电子传递速率（rETR）。内置电池可以满足1000次量子产量测量的需要，仪器内存可以存储4000组数据。
Windows操作软件WinControl可以进行数据传输、数据分析和遥控操作。
标准版的MINI-PAM采用红光作为测量光。根据用户需要，我们也可提供以蓝光（470 nm）作为测量光的MINI-PAM。

特点
1）声誉卓著的PAM-2000的浓缩版
2）精巧、准确、迅速、操作简便的高级光合作用检测设备
3）可单机操作（采用内置电脑），可连接外置电脑操作（Windows操作软件WinControl）
4）超便携式设计，带液晶显示屏和8个按键
5）强大的数据收集、分析和存贮功能
6）能耗低，内置锂电池可满足长时间野外工作需要，并可连接外置12 V电池
7）多种叶夹可供选择，专利设计的光适应叶夹2030-B可同时记录PAR和温度变化
8）光源选择：自然光，内置光源（提供测量光、光化光和饱和脉冲），可选外置卤素灯光源（特别适合野外研究）

功能
1）可测荧光诱导曲线并进行淬灭分析（Fo, Fm, Fv/Fm, F, Fm', ΔF/Fm’, qP, qN, NPQ, rETR, PAR和叶温等）
2）可测光响应曲线和快速光曲线（RLC）
3）51个内置模式菜单，方便参数设置和标准测量
4）可在线监测植物、微藻、地衣、苔藓等的光合作用变化
5）功能强大，特别适合野外操作，实验室内利用WinControl控制时可自编程序

⑤ 叶绿素含量的测定

叶绿素含量的测定方法如下：

叶绿素含量跟光合作用速率、植物营养状况等指标密切相关，通常，我们会通过对叶绿素含量的测定，来了解植物的生长状况。一般，植物叶绿素含量测定有三种：分光光度法，活体叶绿素仪法和光声光谱法。其中分光光度法是应用最广泛的叶绿素含量测定方法。

叶绿素a,b的丙酮溶液在可见光范围内的最大吸收峰分别在663nm和645nm处。叶绿素a和b在663nm处的吸光系数分别为82.04和9.27；在645nm处的吸光系数分别为16.67和45.60。根据Lambert-Beer定律，我们可以列出方程：

D663 = 82.04Ca+9.27Cb

D645 = 16.67Ca+45.60Cb

根据以上方程组，可以求得：

Ca = 12.72D663 – 2.59D645

Cb = 22.88D645 – 4.67D663

然后我们又可求得叶绿素总量CT =（D652 × 1000）/ 34.5

95% 丙酮2乙醇(匀浆)的提取效果最佳，因此，我们在进行叶绿素含量测定的时候，可以考虑运用95% 丙酮2乙醇(匀浆)作为提取液。

目前已经发明了比较方便的用于测量叶绿素含量的仪器—叶绿素含量测定仪，它是通过测量植物的叶绿素相对含量来了解土壤的性能指标和植物的硝基需求量，并了解植物的生长状况。

⑥ 叶绿素含量的测定

叶绿素含量的测定方法：分光光度法。

分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。它具有灵敏度高、操作简便、快速等优点，是生物化学实验中最常用的实验方法。

许多物质的测定都采用分光光度法。在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便可得到与不同波长相对应的吸收强度。

基本原理：选择吸收

物质与光作用，具有选择吸收的特性。有色物质的颜色是该物质与光作用产生的。即有色溶液所呈现的颜色是由于溶液中的物质对光的选择性吸收所致。

由于不同的物质其分子结构不同，对不同波长光的吸收能力也不同，因此具有特征结构的结构集团，存在选择吸收特性的最大实收波长，形成最大吸收峰，而产生特有的吸收光谱。

即使是相同的物质由于其含量不同，对光的吸收程度也不同。利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质的存在（定性分析），或利用物质对一定波长光的吸收程度来测定物质含量（定量分析）的方法，称为分光光度法。