A. 請問,液相色譜中如何選擇正確的緩沖鹽
在色譜分析過程中常常需要使用緩沖鹽來調節流動相的pH 值,緩沖鹽的不當使用對色譜柱可能造成柱壓升高、柱效下降以及使化合物的保留時間發生變化等影響:
1)柱壓升高;
原因:緩沖鹽使用不當導致緩沖鹽析出,堵塞塞板和鍵合相顆粒之間的孔隙,阻礙流動相傳質,引起柱壓升高。
2)相同化合物的保留時間發生變化;
原因:如果沒有沖洗干凈就進行進樣,色譜柱內含有的鹽會使化合物的保留時間發生變化。
3)柱效下降;
原因:
i 有些緩沖鹽會滲入到鍵合相的深處,損害硅膠基體,導致色譜柱鍵合相流失,柱床變松,柱效下降;
ii 凝結在鍵合相表面,使C18 碳鏈難以舒展,對物質的保留能力下降,導致柱效下降。因此用過緩沖鹽後需要對色譜柱進行沖洗,水中緩沖鹽濃度較大時應特別引起注意。
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B. 某蛋白質等電點為8.14,如採用離子交換色譜法來純化,如何選擇填料和緩沖體系
我的話,第一步會選擇pH7.0-7.4左右過陰離子交換,讓大多數雜蛋白(大多數雜蛋白pI在6左右)、核酸、色素等雜質結合,收集流穿液,此時蛋白溶液的純度和澄清度會大大提高,再校pH7.0或更低pH過陽離子交換進行純化。講究一點的話,在緩沖選擇上可以區分一下陰陽離子緩沖,多數情況影響不大,不必糾結。
C. 離子交換層析的具體操作
對於離子交換纖維素要用流水洗去少量碎的不易沉澱的顆粒,以保證有較好的均勻度,對於已溶脹好的產品則不必經這一步驟。溶脹的交換劑使用前要用稀酸或稀鹼處理,使之成為帶H+或OH-的交換劑型。陰離子交換劑常用「鹼-酸-鹼」處理,使最終轉為-OH-型或鹽型交換劑;對於陽離子交換劑則用「酸-鹼-酸」處理,使最終轉為-H-型交換劑。
洗滌好的纖維素使用前必須平衡至所需的pH和離子強度。已平衡的交換劑在裝柱前還要減壓除氣泡。為了避免顆粒大小不等的交換劑在自然沉降時分層,要適當加壓裝柱,同時使柱床壓緊,減少死體積,有利於解析度的提高。
柱子裝好後再用起始緩沖液淋洗,直至達到充分平衡方可使用。 加樣:
層析所用的樣品應與起始緩沖液有相同的pH和離子強度,所選定的pH值應落在交換劑與被結合物有相反電荷的范圍,同時要注意離子強度應低,可用透析、凝膠過濾或稀釋法達此目的。樣品中的不溶物應在透析後或凝膠過濾前,以離心法除去。為了達到滿意的分離效果,上樣量要適當,不要超過柱的負荷能力。柱的負荷能力可用交換容量來推算,通常上樣量為交換劑交換總量的1%-5%。 已結合樣品的離子交換前,可通過改變溶液的pH或改變離子強度的方法將結合物洗脫,也可同時改變pH與離子強度。為了使復雜的組份分離完全,往往需要逐步改變pH或離子強度,其中最簡單的方法是階段洗脫法,即分次將不同pH與離子強度的溶液加入,使不同成分逐步洗脫。由於這種洗脫pH與離子強度的變化大,使許多洗脫體積相近的成分同時洗脫,純度較差,不適宜精細的分離。最好的洗脫方法是連續梯度洗脫,洗脫裝置見圖16-6.兩個容器放於同一水平上,第一個容器盛有一定pH的緩沖液,第二個容器含有高鹽濃度或不同pH的緩沖液,兩容器連通,第一個容器與柱相連,當溶液由第一容器流入柱時,第二容器中的溶液就會自動來補充,經攪拌與第一容器的溶液相混合,這樣流入柱中的緩沖液的洗脫能力即成梯度變化。第一容器中任何時間的濃度都可用下式進行計算:
C=C2-(C2-C1)(1-V)A2/A1
式中A1、A2分別代表兩容器的截面積:C1、C2分別表示容器中溶液的濃度;V為流出體積對總體積之比。當A1=A2時為線性梯度,當A1>A2時為凹形梯度,A1>A2時為凸形梯度。
洗脫時應滿足以下要求:
①洗脫液體積應足夠大,一般要幾十倍於床體積,從而使分離的各峰不至於太擁擠。
②梯度的上限要足夠高,使緊密吸附的物質能被洗脫下來。
③梯度不要上升太快,要恰好使移動的區帶在快到柱末端時達到解吸狀態。目的物的過早解吸,會引起區帶擴散;而目的物的過晚解吸會使峰形過寬。
洗脫餾份的分析按一定體積(5-10ml/管)收集的洗脫液可逐管進行測定,得到層析圖譜。依實驗目的的不同,可採用適宜的檢測方法(生物活性測定、免疫學測定等)確定圖譜中目的物的位置,並回收目的物。
離子交換劑的再生與保存離子交換劑可在柱上再生。如離子交換纖維素可用2mol/:NaCl淋洗柱,若有強吸附物則可用0.1mol/LNaOH洗柱;若有脂溶性物質則可用非離子型去污劑洗柱後再生,也可用乙醇洗滌,其順序為:0.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20%NaOH-水。保存離子交換劑時要加防腐劑。對陰離子交換劑宜用0.002%氯已定(洗必泰),陽離子交換劑可用乙基硫柳汞(0.005%)。有些產品建議用0.02%疊氮鈉。
D. 如何選擇離子交換層析的離子交換劑和緩沖液
離子交換層析是根據蛋白質所帶電荷的差異進行分離純化的一種方法。
蛋白質的帶電性是由蛋白質多肽中帶電氨基酸決定的。
由於蛋白質中氨基酸的電性又取決於介質中的pH,所以蛋白質的帶電性也就依賴於介質的pH。
E. 將四種核苷酸吸附於陰離子交換柱上時,應將溶液調到什麼 ph
① 電泳分離4種核苷酸時應取pH3.5 的緩沖液,在該pH時,這4種單核苷酸之間所帶負電荷版差異較大權,它們都向正極移動,但移動的速度不同,依次為:UMP>GMP>AMP>CMP;
② 應取pH8.0,這樣可使核苷酸帶較多負電荷,利於吸附於陰離子交換樹脂柱。雖然pH 11.4時核苷酸帶有更多的負電荷,但pH過高對分離不利。
③ 當不考慮樹脂的非極性吸附時,根據核苷酸負電荷的多少來決定洗脫速度,則洗脫順序為CMP>AMP> GMP > UMP,但實際上核苷酸和聚苯乙烯陰離子交換樹脂之間存在著非極性吸附,嘌呤鹼基的非極性吸附是嘧啶鹼基的3倍。靜電吸附與非極性吸附共同作用的結果使洗脫順序為:CMP> AMP > UMP >GMP。
F. 過離子交換柱時,pH梯度洗脫緩沖液一般用什麼緩沖液
如果不限定純化方法,可以考慮親和層析或離子交換,但根據你問題的意思,是選定離子交內換。
此時就容要考慮你蛋白的等電點了,如果等電點在你穩定pH之上,就用陽離子交換柱:
設計陽離子交換層析:將你的樣品置換到你所指的穩定pH的running buffer。同時裝柱,平衡,然後上樣,平衡,洗脫(因為你的pH不穩定,建議鹽洗脫),收峰。得你的蛋白;
如果你的等電點在穩定pH之下,就用陰離子交換柱,其步驟如上,只是改變柱子類型。
G. 蛋白純化陰離子交換,緩沖液帶什麼電荷
既然是陰離子交換,就要讓目標蛋白帶負電,那麼緩沖液PH就要大於等電點。緩沖體系的選擇也很重要,一般用TRIS-HCl,特別是弱陰離子柱不可選用帶負電強的磷酸鹽緩沖液,否則上樣液中被交換的將是磷酸根而不是目標蛋白。一般用NaCl平衡後上樣進行離子交換,然後再用較強的陰離子洗脫。
H. 離子交換怎麼試驗
離子交換法是一種藉助於離子交換劑上的離子和廢水中的離子進行交換反應而除去廢水中有害離子的方法。離子交換是一種特殊吸附過程,通常是可逆性化學吸附;其特點是吸附水中離子化物質,並進行等電荷的離子交換。
離子交換劑分無機的離子交換劑如天然沸石,人工合成沸石,及有機的離子交換劑如磺化煤和各種離子交換樹脂。
在應用離子交換法進行水處理時,需要根據離子交換樹脂的性能設計離子交換設備,決定交換設備的運行周期和再生處理。通過本實驗希望達到下述目的:
1) 加深對離子交換基本理論的理解;學會離子交換樹脂的鑒別;
2) 學會離子交換設備操作方法;
3) 學會使用手持式鹽度計,掌握pH計、電導率儀的校正及測量方法。
二、實驗內容和原理
由於離子交換樹脂具有交換基因,其中的可游離交換離子能與水中的同性離子進行等當量交換。 用酸性陽離子交換樹脂除去水中陽離子,反應式如下:
nRH + M+n → RnM + nH+
M——陽離子 n——離子價數
R——交換樹脂
用鹼性陰離子交換樹脂除去水中的陰離子,反應式如下:
nROH + Y−n → RnY + nOH-
Y——陰離子
離子交換法是固體吸附的一種特殊形式,因此也可以用解吸法來解吸,進行樹脂再生。
本實驗採用自來水為進水,進行離子交換處理。因為自來水中含有較多量的陰、陽離
子,如Cl¯, NH4+,Ca,Mg,Fe,Al,K,Na等。在某些工農業生產、科研、醫療衛生等工作中所用的水,以及某些廢水深度處理過程中,都需要除去水中的這些離子。而採用離子交換樹脂來達到目的是可行的方法。
I. 緊急求助,離子交換色譜的一個小問題
離子交換色譜法(ion exchange chromatography,IEC)
離子色譜分析法出現在20世紀70年代,80年代迅速發展起來,以無機、特別是無機陰離子混合物為主要分析對象.
離子交換色譜利用被分離組分與固定相之間發生離子交換的能力差異來實現分離.離子交換色譜的固定相一般為離子交換樹脂,樹脂分子結構中存在許多可以電離的活性中心,待分離組分中的離子會與這些活性中心發生離子交換,形成離子交換平衡,從而在流動相與固定相之間形成分配.固定相的固有離子與待分離組分中的離子之間相互爭奪固定相中的離子交換中心,並隨著流動相的運動而運動,最終實現分離.
表達式
離子交換色譜的分配系數又叫做選擇系數,其表達式為:
K_s=\frac{[RX^+]}{[X^+]}
其中[RX + ]表示與離子交換樹脂活性中心結合的離子濃度,[X + ]表示游離於流動相中的離子濃度
分離原理
離子交換色譜(ion exchange chromatography,IEC)以離子交換樹脂作為固定相,樹脂上具有固定離子基團及可交換的離子基團.當流動相帶著組分電離生成的離子通過固定相時,組分離子與樹脂上可交換的離子基團進行可逆變換.根據組分離子對樹脂親合力不同而得到分離.
陽離子交換:
陰離子交換:
式中"--"表示在固定相上,Kxy和Kzm是交換反應的平衡常數,Z+和X-代表被分析的組分離子.M+和Y-表示樹脂上可交換的離子團.
離子交換反應的平衡常數分別為:
陽離子交換:
陰離子交換:
平衡常數K值越大,表示組分的離子與離子交換樹脂的相互作用越強.由於不同的物質在溶劑中離解後,對離子交換中心具有不同的親合力,因此具有不同的平衡常數.親合力大的,在柱中的停留時間長,具有高的保留值.
固定相
離子交換色譜常用的固定相為離子交換樹脂.目前常用的離子交換樹脂分為三種形式,一是常見的純離子交換樹脂.第二種是玻璃珠等硬芯子表面塗一層樹脂薄層構成的表面層離子交換樹脂,第三種為大孔徑網路型樹脂.它們各有特點,例如第二種樹脂有很高的柱效,但它的柱容量不大;第三種樹脂適用於非水溶液中物質的分離,因為它們的孔徑和內表面積大,不需要用水溶脹,便可滿意地使用.
典型的離子交換樹脂是由苯乙烯和二乙烯基苯交聯共聚而成:
其中,二乙烯基苯起了交聯和加牢整個構型的作用,其含量決定了樹脂交聯度大小.交聯度一般控制在4%~16%范圍內,高度交聯的樹脂較硬而且脆,也較滲透,但選擇性較好.在基體網狀結構上引入各種不同酸鹼基團作為可交換的離於基團.
按結合的基團不同,離子交換樹脂可分為陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂.陽離子交換樹脂上具有與樣品中陽離子交換的基團.陽離子交換樹脂又可分為強酸性和弱酸性樹脂.強酸性陽離子交換樹脂所帶的基團為磷酸基(一),其中和有機聚合物牢固結合形成固定部分,是可流動的能為其他陽離子所交換的離子.
陰離子交換樹脂具有與樣品中陰離子交換的基團.陰離子交換樹脂也可分為強鹼性和弱鹼性樹脂.
陰離子交換樹脂屬強鹼性,它是由有機聚合物骨架和一季胺鹼基團所組成,它帶有正電荷.而與相反的是可以移動的部分,它能被其它陰離子所交換
流動相
離子交換色譜的流動相最常使用水緩沖溶液,有時也使用有機溶劑如甲醇,或乙醇同水緩沖溶液混合使用,以提供特殊的選擇性,並改善樣品的溶解度.
離子交換色譜所用的緩沖液,通常用下列化合物配製:鈉、鉀、被的檸檬酸鹽,磷酸鹽,甲酸鹽與其相應的酸混合成酸性緩沖液或氫氧化鈉混合成鹼性緩沖液等.
J. 過離子交換柱時,pH梯度洗脫緩沖液一般用什麼緩沖液
如果不限定純抄化方法,可以考慮親和層析或離子交換,但根據你問題的意思,是選定離子交換。
此時就要考慮你蛋白的等電點了,如果等電點在你穩定pH之上,就用陽離子交換柱:
設計陽離子交換層析:將你的樣品置換到你所指的穩定pH的running
buffer。同時裝柱,平衡,然後上樣,平衡,洗脫(因為你的pH不穩定,建議鹽洗脫),收峰。得你的蛋白;
如果你的等電點在穩定pH之下,就用陰離子交換柱,其步驟如上,只是改變柱子類型。