離子交換色譜有什麼要求_簡述離子交換色譜法

1. 以離子交換色譜法為例，簡述濕法裝柱的操作過程和注意事項

1.樣品處理：對被分離樣品有時要經過水解等化學處理，樣品溶液一般要兼顧到濃度與粘度兩方面。
+ B4 ^: J i3 _) \- T: R/ |" v2.離子交換柱的安裝：層析柱內徑必須粗細均勻，柱管大小可據實際需要選擇。柱下端膠塞中插入一放液管，膠塞上蓋以園形尼龍綢或發泡塑料片以防止交換樹脂流出。
+ H/ ?0 X, d' E2 P8 h& S- U3.裝柱：⑴裝柱質量是確保柱層析分離效果的技術關鍵之一，越是高技術層析(如使用毛細管層析柱的高級層析設備)裝柱的技術要求和難度越高，以至手工操作很難達到。⑵裝柱的質量要求，無論是手工、機械、自動化裝柱都是一樣的，要求裝入柱中的分離載體材料松緊適度，分布均勻，無氣泡、無斷層、無結節，能保持正常的溶脹形態和結構；⑶裝入柱中樹脂的高度與直徑之比因分離對象和分離目的不同而相差很大，本教材推薦的肝素鈉洗脫柱裝柱高度是柱徑的4～6倍。⑷操作次序，以手工裝入溶脹的D254樹脂（濕法裝柱）為例，其操作程序可概括為：①查連接(柱與塞之間、上下塞與進出液管之間、梯度混合器與進液管之間、出液管與收集器之間等等的連接是否正確、緊密)，②試止漏（塞子、接頭、活塞開關處在長時間滿負荷下不泄漏），③加隔離緩沖墊（緊貼於柱子下端塞子的內平面），④加少許平衡液於空柱內，⑤趕氣泡（緩沖墊內和出水管中的氣泡），⑥開通放水開關，⑦與放水量保持相當的流速，向柱內勻速加完載體材料漿，⑧關閉放水開關，令樹脂自然下沉，⑨用洗滌液和清水洗滌樹脂，⑩最後用緩沖液過柱和平衡柱，使樹脂結構平衡穩定，⑾在樹脂表面蓋上一片尼龍或泡膜塑料，並與柱子內壁保持嚴密接觸，以防加樣時樹脂泛起。
( ?6 Y, g6 D5 S2 e- z% v b* m4.加樣：緩緩打開柱子下端的放液開關,使柱內液面剛好降至樹脂面時便立即將樣品溶液小心地加到尼龍或泡膜塑料片上，待樣品液面剛好進入樹脂層內便立即加入少許平衡緩沖液,以清洗粘附在覆蓋層中的樣品，並隨之進入樹脂層。當柱內液位接近樹脂表面時便立即添加洗滌液進行洗滌操作。$ o+ c9 M: n3 `% Q
5.洗滌：選用合適的洗滌液、恰當的總用量及洗滌流速，小心洗滌柱內樹脂，以除去不被離交樹脂吸附的雜質。: K0 s* j/ p; W4 d) o7 W6 _
6.洗脫：由洗脫曲線找出洗脫液的最佳濃度和適當的總量、操作壓及流速進行洗脫。
5 m- U F# X! m' M. O# g! |7.監測：用敏感快速的方法（參見下文「測定」）監測分離成分是否洗脫出來以及洗脫峰的軸向分布
9 v2 C$ h- _- \: S8.收集：一旦發現待分離成分洗脫出來便可進行一步或分步收集，並可根據各成分洗脫峰的軸向分布和濃度監測，決定產品收集濃度區段，棄去的洗脫液可循環用於相同成分的洗脫。
1 v7 I2 v8 H, m8 y3 ] M; J8 m9.沉澱/離心：用沉澱劑可將分離組分沉澱或離心下來脫水乾燥，沉澱劑回收再用。
" a3 @7 z0 a' t10.脫水乾燥：加入適當脫水劑為如無水乙醇、丙酮或乙醚脫水後進一步乾燥。5 _" H" J" X0 e% v" V
11.測定：對層析所得產品可稱重或測定活性計算其得量和收率。. ^7 ]4 x, e- `1 p# y- z. d7 g9 m5 `
【注意事項】4 G; U! }* `$ X7 C" b: b0 f
1.應根據被分離物質的理化性質、分子大小、分子形狀和分離的目的要求，選擇分離效果好、交換容量大而機械強度較高的分離載體材料。市售的分離載體有明確的規格型號、理化性質、功能作用、活化再生和保養存放等技術參數資料可供用戶選擇。
* K7 Q, U. T% x8 y5 R2.應根據分離純化的對象、規模選擇層析柱的長短、粗細、柱高與內徑之比，使達到最佳分離效果；此外，柱子材料的化學性質要穩定、透明，內徑要均一、光滑，死腔要愈小愈好，要有利於緊固、連接、裝柱與維護。
4 E& F! k7 Q. W3 [& s/ k( ?- P3.柱子安放要垂直、穩固，與之相連的各種線路、管道、設備、設施的布局和連接要緊奏，要方便操作、觀察與維護。4 F5 w( v8 w+ c4 C
4.要求裝入柱中的分離載體材料松緊適度，分布均勻，無氣泡、無斷層、無結節，能保持正常的溶脹形態和結構。5 F n1 O% }8 d z+ T0 L# t2 |3 C
5.保持柱內樹脂層面平整、層序結構始終如一是確保柱層析分離效果的又一技術關鍵。為此，從裝柱到洗脫結束的過程中，尤其是加樣、洗滌、洗脫過程中要始終保持柱內液位不低於柱內樹脂的頂部平面，尤其要始終保持柱內樹脂的層序結構始終如一，不被打亂，特別要防止更換濃度不同的洗滌洗脫液時發生「翻缸」而攪亂樹脂層結構，「壓缸」而造成柱層斷裂和梗塞斷流。
7 z/ W" C+ E8 q: i& t g6.注意保持一定的操作壓，這對確保層析柱流速和分離效果十分重要。因為流速不僅與洗脫液加在柱上的壓力（因液面差造成）有關，也與裝柱材料的粒度、交聯度、機械強度有關。應針對具體情況建立一個操作壓、流速和分離效果的最佳平衡點。
; N( j K7 n0 T" {9 [$ S6.顯著標明各種洗滌、洗脫液的技術參數，嚴禁亂用和混用。) M) k" o* {2 g( F
7.製作洗脫曲線，確定洗脫液收集方案，設置洗脫監控點。2 N; I* F% \6 e9 I5 J% X1 V
8.注意剔除破損樹脂，及時補足流失、破損的循環樹脂量。
# S5 F F8 K3 V2 ]9 A1 E6 U+ o9.嚴格掌握新、舊樹脂的活化、再生條件，及時再生舊樹脂。$ h4 U9 m: L5 L7 g
樹脂的再生：每次洗脫結束，用清水將樹脂洗出柱體再用、再生，或用高濃度的NaCl溶液浸泡貯存。樹脂經過一段使用後樹脂上的活性基團因被交換而使交換容量大為降低，此時樹脂需要再生處理。( z# |! T+ @) z" O
大處理（酸—鹼—酸）：加入樹脂2倍量的2mol HCL溶液攪拌3小時，自來水沖洗至中性；又用2mol NaOH溶液照酸處理方式處理；再用2mol HCL處理。
5 F% O1 U$ W2 r小處理（鹼—酸）：濃度、方法同上。) o4 @' Y" x8 ]8 s2 {8 P6 i
連續用數次的樹脂進行小處理，用十次後的樹脂要進行大處理。
4 {, T2 J( F& L& C: a- C% E& g$ X9 v10．注意脫水乾燥條件。$ M) H0 {1 @& q' Y9 j" t7 n1 x

2. 離子交換色譜的原理以及陰陽離子交換樹脂的特性

離子交換樹脂的結構：

離子交換樹脂主要由高分子骨架和活性基團兩部分組成，高分子骨架是惰性的網狀結構骨架，是不溶於酸或鹼的高分子物質，常用的離子交換樹脂是由苯乙烯和二乙烯苯聚合得到樹脂的骨架。

而活性基團不能自由移動的官能團離子和可以自由移動的可交換離子兩部分組成，可交換離子能夠決定樹脂所吸附的離子，比如可交換離子為H型陽離子交換樹脂，那麼這個樹脂能夠吸附的離子，就是H型陽離子，而官能團離子能夠決定樹脂的「酸"、「鹼"性和交換能力的強弱，比如官能團離子是強酸性離子，那麼樹脂就是強酸性離子交換樹脂。

離子交換樹脂的內部結構：

1.凝膠型樹脂是由純單體混合物經縮合或聚合而成的，結構為微孔狀，合成的工藝比較簡單，孔徑大概在1-2nm左右，凝膠型樹脂的操作容量高，產水量高，物理強度好，且再生效率高，被廣泛應用在食品飲料加工，超純水制備，飲用水過濾，硬水軟化，製糖業，制葯等領域。

2.大孔型樹脂的孔徑一般在10nm左右，在樹脂中孔徑是比較大的，所以被稱為大孔型樹脂，且孔徑不會隨著周圍的環境而變化，能夠彌補凝膠型樹脂不能在非水系統中使用的缺點，吸附能力非常強大，不易碎裂，耐氧化好，操作容量高，能夠應用在醫葯領域、除重金屬污染、葯品純化、水處理中除去碳酸硬度、冷凝水精處理等領域。

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3. 為提高離子色譜分離效果可改變的色譜條件有什麼

1、稀釋樣品
對組成復雜的樣品，若待測李空離子對樹脂親合力相差頗大，就要作幾次進樣，並用不同濃度或強度的淋洗液或梯度淋洗。對固定相親合力差異較大的離子，增加分離度的最簡單方法是稀釋樣品或作樣品前處理。例如鹽水中SO2-4和Cl-的分離。若直接進樣，其色譜峰很寬而且拖尾，表明進樣量已超過分離柱容量，在常用的分析陰離子的色譜條件下，30min之後Cl-的洗脫仍在繼續。在這種情況下，在未恢復穩定基線之前不能再進樣。若將樣品稀釋10倍之後再進樣就可得到Cl-與痕量SO2-4之間的較好分離。對陰離子分析推薦的最大進樣量，一般為柱容量的30%，超過這個范圍就會出現大的平頭峰或肩峰
2、改變分離和檢測方式
若待測離子對固定相親合力相近或相同，樣品稀釋的效果常不令人滿意。對這種情況，除了選擇適當的流動相之外，還應考慮選擇適當的分離方式和檢測方式。例如，NO-3和ClO-3，由於它們的電荷數和離子半徑相似，在陰離子交換分離柱上共淋洗。但ClO-3的疏水性大於NO-3，在離子對色譜柱上就很容易分開。又如NO-2與Cl-在陰離子交換分離柱上的保留時間相近，常見樣品中Cl-的濃度又遠大於NO-2，使分離更加困難，但NO-2有強的UV吸收，而Cl-則很弱，因此，應改用紫外作檢測器測定NO-2，用電導檢測Cl-，或將兩種檢測器串聯，於一次進樣同時檢測Cl-與NO-2。對高濃度強酸中有機酸的分析，若採用離子排斥，由於強酸不被保留，在死體積排除，將不幹擾有機酸的分離。
3、樣品前處理
對高濃度基體中痕量離子的測定，例如海水中陰離子的測定，最好的方法是對樣品作適當的前處理。除去過量Cl-的前處理方法有：使樣品通過Ag+型前處理柱除去Cl-，或進樣前加AgNO3到樣品中沉澱Cl-；也可用閥切換技術，其方法是使樣品中弱保留的組分和90%以上的Cl-進入廢液，只讓10%左右的Cl-和保留時間大於Cl-的組分進入分離柱進行分離。對含有大的有機分子的樣品，應於進樣前除去有機物，較簡單的方法是用Dionex的前處理柱OnGuard的RP或P柱或在線閥切換除去有機基體。
4、選擇適當的淋洗液
離子色譜分離是基於淋洗離子和樣品離子之間對樹脂有效交換容量的競爭，為了得到有效的競爭，樣品離子和淋洗離子應有相近的親合力。下面舉例說明選擇淋洗液的一般原則。用CO2-32HCO-作淋洗液時，在Cl-之前洗脫的離子是弱保留離子，包括一價無機陰離子、短碳鏈一元羧酸和一些弱離解的組哪磨瞎分，如F-，甲酸，AsO-2，CN-和S2-等。對乙酸，甲酸與F-、Cl-等的分離應選用較弱的淋洗離子，常用的弱淋洗離子有HCO-3，OH-和B4O2-7。由於HCO-3和OH-易吸收空氣中CO2，CO2在鹼性溶液中會轉變成CO2-3，CO2-3之淋洗強度較HCO-3和OH-大，因而不利於上述弱保留離子的分離。B4O2-7亦為弱淋洗離子，但溶液穩定，是分離弱保留離子的推薦淋洗液。中等強度的碳酸鹽淋洗液對高親和力組分游碧的洗脫效率低。

4. 離子交換色譜法的介紹

離子交換色譜法是利用離子交換原理和液相色譜技術的結合來測定溶液中陽離子和陰專離子的一屬種分離分析方法。凡在溶液中能夠電離的物質通常都可以用離子交換色譜法進行分離。現在它不僅適用於無機離子混合物的分離，亦可用於有機物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質等生物大分子，因此應用范圍較廣。

5. 離子交換色譜法的原理，裝置及應用

原理：
離子交換色譜（ion exchange chromatography，IEC）以離子交換樹脂作為固定相，樹脂上具有固定離子基團及可交換的離子基團。當流動相帶著組分電離生成的離子通過固定相時，組分離子與樹脂上可交換的離子基團進行可逆變換。根據組分離子對樹脂親合力不同而得到分離。

裝置：
（1）分離柱裝有離子交換樹脂，如陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂或螯合離子交換樹脂。為了減小擴散阻力，提高色譜分離效率，要使用均勻粒度的小球形樹脂。最常用的陽離子交換樹脂是在有機聚合物分子（如苯乙烯－二乙烯基苯共聚物）上連接磺酸基官能團（─SO3─）。最常用的陰離子交換劑是在有機聚合物分子上連接季銨官能團(─NH4)。這些都是常規高交換容量的離子交換樹脂，由於它們的傳質速度低，使柱效和分離速度都低。C.霍瓦特描述了一種薄膜陰離子交換樹脂，它是在苯乙烯－二乙烯基苯共聚物核心上沉澱一薄層陰離子交換樹脂，就象雞蛋有一薄層外皮那樣，離子交換反應只在外皮上進行,因此縮短了擴散的路徑,所以離子交換速度高，傳質快，提高了柱效。同樣，在小顆粒多孔硅膠上塗一薄層離子交換材料也可得到相同類型的樹脂。螯合離子交換樹脂具有絡合某些金屬離子而同時排斥另一些金屬離子的能力，因此這種樹脂具有很高的選擇性。除了離子交換柱外，其他高效液相色譜柱也可用於分離離子。
（2）抑制柱和柱後衍生作用常用的檢測器不僅能檢測樣品離子，而且也對移動相中的離子有響應，所以必須消除移動相離子的干擾。在離子色譜中，消除(抑制)移動相離子干擾的常用方法有兩種。
①抑制反應，用抑制反應來改變移動相，使移動相離子不被檢測器測出。離子色譜通常使用電導檢測器。在抑制反應中??綞匝衾胱佣?裕?把高電導率移動相的氫氧化物轉變成水,而樣品離子則轉變成它們相應的酸：
NaOH+H+─→Na++H2O
NaX+H+─→HX+Na+
在裝有強酸性陽離子交換樹脂的柱中進行抑制反應，使用一段時間後，這種樹脂就需要再生，很不方便。改用連接有磺酸基(─SO3H)的離子交換膜(陽離子交換膜)或用連接有銨基(─NH4)的離子交換膜(陰離子交換膜)，就可以連續進行抑制反應。例如，陽離子交換膜可使陽離子通過它擴散過去，而陰離子則不能擴散過去。
1981年，T.S.史蒂文斯和斯莫爾等報道了中空纖維抑製法。這種纖維是由陽離子交換膜材料拉制而成。用這種方法不僅不需要再生抑制柱而且減小了峰的加寬，提高了柱效。一種比較新的膜技術是加一電場以加速離子的傳遞，該法與中空纖維法比較，其優點是反應時間短、交換能力高，並且可以用於陽離子和陰離子兩者。
②柱後衍生作用，將從柱子流出的洗出液與對被測物有特效作用的試劑相混合，在一反應器中生成帶色的絡合物（見配位化合物）。對衍生試劑最重要的要求是它們與被測物能生成絡合物，但不與移動相生成絡合物。柱後衍生法能用於測定重金屬離子，所用的衍生試劑有茜素紅S等。
（3）檢測器分為通用型和專用型。通用型檢測器對存在於檢測池中的所有離子都有響應。離子色譜中最常用的電導檢測器就是通用型的一種。紫外－可見分光光度計是專用型的檢測器，對離子具有選擇性響應。可變波長紫外檢測器與電導檢測器聯用,能幫助鑒定未知峰,分辨重疊峰和提供電導檢測器不能測定的陰離子，如硫化物及亞砷酸中的陰離子的檢測。
在離子色譜中，電導檢測法總是和抑制反應配合使用。這種檢測器對分子不響應，如水、乙醇或者不離解的弱酸分子等。對於電導檢測器，一個重要的條件是溫度要穩定，所以檢測池要放在恆溫箱中，1982年H.薩托設計一種雙示差電導檢測器，消除了溫度變化對檢測的影響，可測定10-9摩爾的陰離子。

應用：
離子色譜主要用於測定各種離子的含量，特別適於測定水溶液中低濃度的陰離子，例如飲用水水質分析，高純水的離子分析，礦泉水、雨水、各種廢水和電廠水的分析，紙漿和漂白液的分析，食品分析，生物體液(尿和血等)中的離子測定，以及鋼鐵工業、環境保護等方面的應用。離子色譜能測定下列類型的離子：有機陰離子、鹼金屬、鹼土金屬、重金屬、稀土離子和有機酸,以及胺和銨鹽等。

6. 簡述離子交換色譜法

離子交換色譜法(ion exchange chromatography,IEC)
離子色譜分析法出現在20世紀70年代，80年代迅速發展起來，以無機、特別是無機陰離子混合物為主要分析對象。
離子交換色譜利用被分離組分與固定相之間發生離子交換的能力差異來實現分離。離子交換色譜的固定相一般為離子交換樹脂，樹脂分子結構中存在許多可以電離的活性中心，待分離組分中的離子會與這些活性中心發生離子交換，形成離子交換平衡，從而在流動相與固定相之間形成分配。固定相的固有離子與待分離組分中的離子之間相互爭奪固定相中的離子交換中心，並隨著流動相的運動而運動，最終實現分離。
表達式
離子交換色譜的分配系數又叫做選擇系數，其表達式為：

K_s=\frac{[RX^+]}{[X^+]}

其中[RX + ]表示與離子交換樹脂活性中心結合的離子濃度，[X + ]表示游離於流動相中的離子濃度

分離原理
離子交換色譜（ion exchange chromatography，IEC）以離子交換樹脂作為固定相，樹脂上具有固定離子基團及可交換的離子基團。當流動相帶著組分電離生成的離子通過固定相時，組分離子與樹脂上可交換的離子基團進行可逆變換。根據組分離子對樹脂親合力不同而得到分離。

陽離子交換:

陰離子交換:

式中"－－"表示在固定相上，Kxy和Kzm是交換反應的平衡常數，Z+和X-代表被分析的組分離子。M+和Y-表示樹脂上可交換的離子團。

離子交換反應的平衡常數分別為：

陽離子交換：

陰離子交換：

平衡常數K值越大，表示組分的離子與離子交換樹脂的相互作用越強。由於不同的物質在溶劑中離解後，對離子交換中心具有不同的親合力，因此具有不同的平衡常數。親合力大的，在柱中的停留時間長，具有高的保留值。

固定相
離子交換色譜常用的固定相為離子交換樹脂。目前常用的離子交換樹脂分為三種形式，一是常見的純離子交換樹脂。第二種是玻璃珠等硬芯子表面塗一層樹脂薄層構成的表面層離子交換樹脂，第三種為大孔徑網路型樹脂。它們各有特點，例如第二種樹脂有很高的柱效，但它的柱容量不大；第三種樹脂適用於非水溶液中物質的分離，因為它們的孔徑和內表面積大，不需要用水溶脹，便可滿意地使用。

典型的離子交換樹脂是由苯乙烯和二乙烯基苯交聯共聚而成：

其中，二乙烯基苯起了交聯和加牢整個構型的作用，其含量決定了樹脂交聯度大小。交聯度一般控制在4％～16％范圍內，高度交聯的樹脂較硬而且脆，也較滲透，但選擇性較好。在基體網狀結構上引入各種不同酸鹼基團作為可交換的離於基團。

按結合的基團不同，離子交換樹脂可分為陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂。陽離子交換樹脂上具有與樣品中陽離子交換的基團。陽離子交換樹脂又可分為強酸性和弱酸性樹脂。強酸性陽離子交換樹脂所帶的基團為磷酸基（一），其中和有機聚合物牢固結合形成固定部分，是可流動的能為其他陽離子所交換的離子。

陰離子交換樹脂具有與樣品中陰離子交換的基團。陰離子交換樹脂也可分為強鹼性和弱鹼性樹脂。

陰離子交換樹脂屬強鹼性，它是由有機聚合物骨架和一季胺鹼基團所組成，它帶有正電荷。而與相反的是可以移動的部分，它能被其它陰離子所交換

流動相
離子交換色譜的流動相最常使用水緩沖溶液，有時也使用有機溶劑如甲醇，或乙醇同水緩沖溶液混合使用，以提供特殊的選擇性，並改善樣品的溶解度。

離子交換色譜所用的緩沖液，通常用下列化合物配製：鈉、鉀、被的檸檬酸鹽，磷酸鹽，甲酸鹽與其相應的酸混合成酸性緩沖液或氫氧化鈉混合成鹼性緩沖液等。

7. 請說明下液相色譜的原理以及操作時候的注意點

原理：
高效液相色譜法是在經典色譜法的基礎上，引用了氣相色譜的理論，在技術上，流動相改為高壓輸送（最高輸送壓力可達4.9´107Pa）;色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高於經典液相色譜（每米塔板數可達幾萬或幾十萬）；同時柱後連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進行連續檢測。
特點

1．高壓：液相色譜法以液體為流動相（稱為載液），液體流經色譜柱，受到阻力較大，為了迅速地通過色譜柱，必須對載液施加高壓。一般可達150～350×105Pa。
2. 高速：流動相在柱內的流速較經典色譜快得多，一般可達1～10ml/min。高效液相色譜法所需的分析時間較之經典液相色譜法少得多，一般少於 1h 。
3. 高效：近來研究出許多新型固定相，使分離效率大大提高。
4.高靈敏度：高效液相色譜已廣泛採用高靈敏度的檢測器，進一步提高了分析的靈敏度。如熒光檢測器靈敏度可達10-11g。另外，用樣量小，一般幾個微升。
5.適應范圍寬：氣相色譜法與高效液相色譜法的比較：氣相色譜法雖具有分離能力好，靈敏度高，分析速度快，操作方便等優點，但是受技術條件的限制，沸點太高的物質或熱穩定性差的物質都難於應用氣相色譜法進行分析。而高效液相色譜法，只要求試樣能製成溶液，而不需要氣化，因此不受試樣揮發性的限制。對於高沸點、熱穩定性差、相對分子量大（大於 400 以上）的有機物（這些物質幾乎佔有機物總數的 75% ～ 80% ）原則上都可應用高效液相色譜法來進行分離、分析。據統計，在已知化合物中，能用氣相色譜分析的約佔20%，而能用液相色譜分析的約佔70～80%。

高效液相色譜按其固定相的性質可分為高效凝膠色譜、疏水性高效液相色譜、反相高效液相色譜、高效離子交換液相色譜、高效親和液相色譜以及高效聚焦液相色譜等類型。用不同類型的高效液相色譜分離或分析各種化合物的原理基本上與相對應的普通液相層析的原理相似。其不同之處是高效液相色譜靈敏、快速、解析度高、重復性好，且須在色譜儀中進行。
高效液相色譜法的主要類型及其分離原理
根據分離機制的不同，高效液相色譜法可分為下述幾種主要類型：

1 ．液 — 液分配色譜法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化學鍵合相色譜(Chemically Bonded Phase Chromatography)

流動相和固定相都是液體。流動相與固定相之間應互不相溶（極性不同，避免固定液流失），有一個明顯的分界面。當試樣進入色譜柱，溶質在兩相間進行分配。達到平衡時，服從於下式：

式中，cs—溶質在固定相中濃度；cm--溶質在流動相中的濃度； Vs—固定相的體積；Vm—流動相的體積。LLPC與GPC有相似之處，即分離的順序取決於K，K大的組分保留值大；但也有不同之處，GPC中，流動相對K影響不大，LLPC流動相對K影響較大。

a. 正相液 — 液分配色譜法(Normal Phase liquid Chromatography): 流動相的極性小於固定液的極性。

b. 反相液 — 液分配色譜法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流動相的極性大於固定液的極性。

c. 液 — 液分配色譜法的缺點：盡管流動相與固定相的極性要求完全不同，但固定液在流動相中仍有微量溶解；流動相通過色譜柱時的機械沖擊力，會造成固定液流失。上世紀70年代末發展的化學鍵合固定相（見後），可克服上述缺點。現在應用很廣泛（70~80%）。

2 ．液 — 固色譜法

流動相為液體，固定相為吸附劑（如硅膠、氧化鋁等）。這是根據物質吸附作用的不同來進行分離的。其作用機制是：當試樣進入色譜柱時，溶質分子 (X) 和溶劑分子(S)對吸附劑表面活性中心發生競爭吸附（未進樣時，所有的吸附劑活性中心吸附的是S），可表示如下：

Xm + nSa ====== Xa + nSm

式中：Xm--流動相中的溶質分子；Sa--固定相中的溶劑分子；Xa--固定相中的溶質分子；Sm--流動相中的溶劑分子。

當吸附競爭反應達平衡時：

K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]

式中：K為吸附平衡常數。[討論：K越大，保留值越大。]

3 ．離子交換色譜法(Ion-exchange Chromatography)

IEC是以離子交換劑作為固定相。IEC是基於離子交換樹脂上可電離的離子與流動相中具有相同電荷的溶質離子進行可逆交換，依據這些離子以交換劑具有不同的親和力而將它們分離。

以陰離子交換劑為例，其交換過程可表示如下：

X-(溶劑中) + (樹脂-R4N+Cl-)=== (樹脂-R4N+ X-) + Cl- (溶劑中)

當交換達平衡時：

KX=[-R4N+ X-][ Cl-]/[-R4N+Cl-][ X-]

分配系數為：

DX=[-R4N+ X-]/[X-]= KX [-R4N+Cl-]/[Cl-]

[討論：DX與保留值的關系]

凡是在溶劑中能夠電離的物質通常都可以用離子交換色譜法來進行分離。

4 ．離子對色譜法(Ion Pair Chromatography)

離子對色譜法是將一種 ( 或多種 ) 與溶質分子電荷相反的離子 ( 稱為對離子或反離子 ) 加到流動相或固定相中，使其與溶質離子結合形成疏水型離子對化合物，從而控制溶質離子的保留行為。其原理可用下式表示：

X+水相 + Y-水相 === X+Y-有機相

式中：X+水相--流動相中待分離的有機離子（也可是陽離子）；Y-水相--流動相中帶相反電荷的離子對（如氫氧化四丁基銨、氫氧化十六烷基三甲銨等）；X+Y---形成的離子對化合物。

當達平衡時：

KXY = [X+Y-]有機相/[ X+]水相[Y-]水相

根據定義，分配系數為：

DX= [X+Y-]有機相/[ X+]水相= KXY [Y-]水相

[討論：DX與保留值的關系]

離子對色譜法(特別是反相)發解決了以往難以分離的混合物的分離問題，諸如酸、鹼和離子、非離子混合物，特別是一些生化試樣如核酸、核苷、生物鹼以及葯物等分離。

5 ．離子色譜法(Ion Chromatography)

用離子交換樹脂為固定相，電解質溶液為流動相。以電導檢測器為通用檢測器，為消除流動相中強電解質背景離子對電導檢測器的干擾，設置了抑制柱。試樣組分在分離柱和抑制柱上的反應原理與離子交換色譜法相同。

以陰離子交換樹脂（R-OH）作固定相，分離陰離子（如Br-）為例。當待測陰離子Br-隨流動相（NaOH）進入色譜柱時，發生如下交換反應（洗脫反應為交換反應的逆過程）：

抑制柱上發生的反應：

R-H+ + Na+OH- === R-Na+ + H2O

R-H+ + Na+Br- === R-Na+ + H+Br-

可見，通過抑制柱將洗脫液轉變成了電導值很小的水，消除了本底電導的影響；試樣陰離子Br-則被轉化成了相應的酸H+Br-，可用電導法靈敏的檢測。

離子色譜法是溶液中陰離子分析的最佳方法。也可用於陽離子分析。
6 ．空間排阻色譜法(Steric Exclusion Chromatography)

空間排阻色譜法以凝膠 (gel) 為固定相。它類似於分子篩的作用，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多，一般為數納米到數百納米。溶質在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來進行分離，而是按分子大小進行分離。分離只與凝膠的孔徑分布和溶質的流動力學體積或分子大小有關。試樣進入色譜柱後，隨流動相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過。在試樣中一些太大的分子不能進入膠孔而受到排阻，因此就直接通過柱子，首先在色譜圖上出現，一些很小的分子可以進入所有膠孔並滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保留值最大，在色譜圖上最後出現。

高效液相色譜儀主要有進樣系統、輸液系統、．分離系統、檢測系統和數據處理系統，下面將分別敘述其各自的組成與特點。

1．進樣系統

一般採用隔膜注射進樣器或高壓進樣間完成進樣操作，進樣量是恆定的。這對提高分析樣品的重復性是有益的。

2．輸液系統

該系統包括高壓泵、流動相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強為l．47～4．4X107Pa，流速可調且穩定，當高壓流動相通過層析柱時，可降低樣品在柱中的擴散效應，可加快其在柱中的移動速度，這對提高解析度、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動相貯存錯和梯度儀，可使流動相隨固定相和樣品的性質而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強度、PH值，或改用競爭性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質（即使僅有一個基團的差別或是同分異構體）都能獲得有效分離。

3.分離系統

該系統包括色譜柱、連接管和恆溫器等。色譜柱一般長度為10～50cm（需要兩根連用時，可在二者之間加一連接管），內徑為2～5mm，由"優質不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料製成，住內裝有直徑為5～10μm粒度的固定相（由基質和固定液構成）．固定相中的基質是由機械強度高的樹脂或硅膠構成，它們都有惰性（如硅膠表面的硅酸基因基本已除去）、多孔性（孔徑可達1000?）和比表面積大的特點，加之其表面經過機械塗漬（與氣相色譜中固定相的制備一樣），或者用化學法偶聯各種基因（如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等）或配體的有機化合物。因此，這類固定相對結構不同的物質有良好的選擇性。例如，在多孔性硅膠表面偶聯豌豆凝集素（PSA）後，就可以把成纖維細胞中的一種糖蛋白分離出來。

另外，固定相基質粒小，柱床極易達到均勻、緻密狀態，極易降低渦流擴散效應。基質粒度小，微孔淺，樣品在微孔區內傳質短。這些對縮小譜帶寬度、提高解析度是有益的。根據柱效理論分析，基質粒度小，塔板理論數N就越大。這也進一步證明基質粒度小，會提高解析度的道理。

再者，高效液相色譜的恆溫器可使溫度從室溫調到60C，通過改善傳質速度，縮短分析時間，就可增加層析柱的效率。

4．檢測系統

高效液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器、示差折光檢測器和熒光檢測器三種。

（1）紫外檢測器

該檢測器適用於對紫外光（或可見光）有吸收性能樣品的檢測。其特點：使用面廣（如蛋白質、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；靈敏度高（檢測下限為10-10g／ml）；線性范圍寬；對溫度和流速變化不敏感；可檢測梯度溶液洗脫的樣品。

（2）示差折光檢測器

凡具有與流動相折光率不同的樣品組分，均可使用示差折光檢測器檢測。目前，糖類化合物的檢測大多使用此檢測系統。這一系統通用性強、操作簡單，但靈敏度低（檢測下限為10-7g／ml），流動相的變化會引起折光率的變化，因此，它既不適用於痕量分析，也不適用於梯度洗脫樣品的檢測。

（3）熒光檢測器

凡具有熒光的物質，在一定條件下，其發射光的熒光強度與物質的濃度成正比。因此，這一檢測器只適用於具有熒光的有機化合物（如多環芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質等）的測定，其靈敏度很高（檢測下限為10-12～10-14g／ml），痕量分析和梯度洗脫作品的檢測均可採用。

（5）數據處理系統

該系統可對測試數據進行採集、貯存、顯示、列印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展。

操作注意要點：

1)．首先對流動相進行過濾，根據需要選擇不同的濾膜，一般為有機系和水系，常用的孔徑為0.20um和0.45um。
2)．對抽濾後的流動相進行超聲脫氣10-20分鍾。
3)．正常情況下，儀器首先用甲醇沖洗10-20分鍾，然後再進入測試用流動相(如流動相為緩沖試劑，則要二次重蒸水沖洗10-20分鍾，直至色譜柱中有機相沖凈為止) 。
4)．一般情況下，流動相沖洗20-30分鍾後，儀器方可穩定，最重要的是儀器基線走後，方可進樣測試。
5)．同時進兩針標樣，將其結果相比較，其結果的比值在0.98-1.02之間後，就可以正式進行樣品的測試了。
6)．樣品測試結束後，就要進行色譜儀及色譜柱的清洗和維護。如流動相為緩沖試劑，同樣也要用重蒸水清洗10-20分鍾，方可用有機相進行保護，否則，有損色譜柱。
7)．關機時，先關計算機，再關液相色譜。
8)．填寫登記本，由負責人簽字。

注意事項：
1)．流動相均需色譜純度，水用20M的去離子水。脫氣後的流動相要小心振動盡量不引起氣泡。
2)．柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要讓液體過柱子。
3)．所有過柱子的液體均需嚴格的過濾。
4)．壓力不能太大，最好不要超過150kgf/cm2 .
5). 因為緩沖試劑遇有機溶劑，會結晶，有損色譜柱，所以，每次由有機相變流動相或流動相變有機相均需用蒸餾水清洗。

8. 關於離子交換色譜法

我感覺應該選C
首先B中陽離子為+2價離子，最容易被吸附，通過試管速度最慢。
然後A和C作比較，其中A的離子半徑比較大，而且配合物更易被吸附，所以A更容易被吸附。
通過比較得到C的吸附能力最弱。

9. 在使用離子交換色譜時,應該選擇什麼樣的離子交換劑選擇什麼樣的骨架

離子交換技術：

Sober 和 Peterson於1956年首次將離子交換基團結合到纖維素上，製成了離子交換纖維素，成功地應用於蛋白質的分離。從此使生物大分子的分級分離方法取得了迅速的發展。離子交換基團不但可結合到纖維上，還可結合到交聯葡聚糖（S-ephadex）和瓊脂糖凝膠（Sepharose）上。近年來離子交換色譜技術已經廣泛應用於蛋白質、酶、核酸、肽、寡核苷酸、病毒、噬菌體和多糖的分離和純化。它們的優點是:⑴具有開放性支持骨架，大分子可以自由進入和迅速擴散，故吸附容量大。⑵具有親水性，對大分子的吸附不大牢固，用溫和條件使可以洗脫，不致引起蛋白質變性或酶的失活。⑶多孔性，表面積大、交換容量大，回收率高，可用於分離和制備。

一、基本理論

離子交換劑通常是一種不溶性高分子化合物，如樹脂，纖維素，葡聚糖，醇脂糖等，它的分子中含有可解離的基團，這些基因在水溶液中能與溶液中的其它陽離子或陰離子起交換作用。雖然交換反應都是平衡反應，但在層析柱上進行時，由於連續添加新的交換溶液，平衡不斷按正方向進行，直至完全。因此可以把離子交換劑上的原子離子全部洗脫下來，同理，當一定量的溶液通過交換柱時，由於溶液中的離子不斷被交換而波度逐減少，因此也可以全部被交換並吸附在樹脂上。如果有兩種以上的成分被交換吸著在離子交換劑上，用洗脫液洗脫時，在被洗脫的能力則決定於各自洗反應的平衡常數。蛋白質的離子交換過程有兩個階段——吸附和解吸附。吸附在離子交換劑上的蛋白質可以通過改變pH使吸附的蛋白質失去電荷而達到解離但更多的是通過增加離子強度，使加入的離子與蛋白質競爭離子交換劑上的電荷位置，使吸附的蛋白質與離子交換劑解開。不同蛋白質與離子交換劑之間形成電鍵數目不同，即親和力大小有差異，因此只要選擇適當的洗脫條件便可將混合物中的組分逐個洗脫下來，達到分離純化的目的。

10. HPLC簡介

1 HPLC的定義

HPLC是指具有高分離效能的柱液相色譜法[1]。

HPLC系採用高壓輸液泵將規定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱，對供試品進行分離測定的色譜方法[2]。注入的供試品，由流動相帶入柱內，各組分在柱內被分離，並依次進入檢測器，由積分儀或數據處理系統記錄和處理色譜信號。

2 對儀器激沒伏的一般要求和色譜條件

HPLC所用的儀器為高效液相色譜儀。儀器應定期檢定並符合有關規定。

2.1 色譜柱

反相色譜系統使用非極性填充劑，常用的色譜柱填充劑為化學鍵合硅膠，以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠（如氰基鍵合硅烷和氨基鍵合硅烷等）也有使用。正相色譜系統使用極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換色譜系統使用離子交換填充劑；分子排阻色譜系統使用凝膠或高分子多孔微球等填充劑；對映異構體的分離通常使用手性填充劑。填充劑的性能（如載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團的表面覆蓋度、含碳量和鍵合類型等）以及色譜柱的填充，直接影響供試品的保留行為和分離效果。分析分子量小於2000的化合物應選擇孔徑在15nm（1nm10A）以下的填料，分析分子量大於2000的化合物則應選擇孔徑在30nm以上的填料。除另有規定外，普通分析柱的填充劑粒徑一般在3～10μm之間，粒徑更小（約2μm）的填充劑常用於填裝微徑柱（內徑約2mm）。

使用微徑柱時，輸液泵的性能、進樣體積、檢測池體積和系統的死體積等必須與之匹配；如有必要，色譜條件也需作適當的調整。當對其測定結果產生爭議時，應以品種項下規定的色譜條件的測定結果為准。

以硅膠為載體的鍵合固定相的使用溫度通常不超過40℃，為改善分離效果可適當提高色譜柱的使用溫度，但不宜超過60℃。

流動相的pH值應控制在2～8之間。當pH值大於8時，可使載體硅膠溶解；當pH值小於2時，與硅膠相連的化學鍵合相易水解脫落。當色譜系統中需使用pH值大於8的流動相時，應選用耐堿的填充劑，如採用高純硅膠為載體並具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠填充劑、包覆聚合物填充劑、有機一無機雜化填充劑或非硅膠基鍵合填充劑等；當需使用pH值小於2的流動相時，應選用耐酸的填充劑，如具有大體積側鏈能產生空間位阻保護作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基硅烷鍵合硅膠填充劑、有機－無機雜化填充劑等。

2.2 檢測器

最常用的檢測器為紫外檢測器，包括二極察滾管明攜陣列檢測器，其他常見的檢測器有熒光檢測器、蒸發光散射檢測器、示差折光檢測器、電化學檢測器和質譜檢測器等。

紫外、熒光、電化學檢測器為選擇性檢測器，其響應值不僅與供試品溶液的濃度有關，還與化合物的結構有關；蒸發光散射檢測器和示差折光檢測器為通用型檢測器，對所有的化合物均有響應；蒸發光散射檢測器對結構類似的化合物，其響應值幾乎僅與供試品的質量有關；二極體陣列檢測器可以同時記錄供試品的吸收光譜，故可用於供試品的光譜鑒定和色譜峰的純度檢查。

紫外、熒光、電化學和示差折光檢測器的響應值與供試品溶液的濃度在一定范圍內呈線性關系，但蒸發光散射檢測器的響應值與供試品溶液的濃度通常呈指數關系，故進行計算時，一般需經對數轉換。

不同的檢測器，對流動相的要求不同。如採用紫外檢測器，所用流動相應符合紫外－可見分光光度法（2010年版葯典二部附錄ⅣA）項下對溶劑的要求；採用低波長檢測時，還應考慮有機相中有機溶劑的截止使用波長，並選用色譜級有機溶劑。蒸發光散射檢測器和質譜檢測器通常不允許使用含不揮發性鹽組分的流動相。

2.3 流動相

反相色譜系統的流動相首選甲醇－水系統（採用紫外末端波長檢測時，首選乙腈－水系統），如經試用不適合時，再選用其他溶劑系統。應盡可能少用含有緩沖液的流動相，必須使用時，應盡可能選用含較低濃度緩沖液的流動相。由於C18鏈在水相環境中不易保持伸展狀態，故對於十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統，流動相中有機溶劑的比例通常應不低於5%，否則C18鏈的隨機捲曲將導致組分保留值變化，造成色譜系統不穩定。

各品種項下規定的條件除固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得改變外，其餘如色譜柱內徑、長度、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組分的比例、柱溫、進樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變，以適應供試品並達到系統適用性試驗的要求。其中，調整流動相組分比例時，以組分比例較低者（小於或等於50%）相對於自身的改變數不超過±30%且相對於總量的改變數不超過±10%為限，如30%相對改變數的數值超過總量的10%時，則改變數以總量的±10%為限。

對於必須使用特定牌號的填充劑方能滿足分離要求的品種，可在該品種項下註明。

3 系統適用性試驗

HPLC的適用性試驗通常包括理論板數、分離度、重復性和拖尾因子等四個參數。其中，分離度和重復性尤為重要。[2]

按各品種項下要求對色譜系統進行適用性試驗，即用規定的對照品溶液或系統適用性試驗溶液在規定的色譜系統進行試驗，必要時，可對色譜系統進行適當調整，以符合要求。

3.1 色譜柱的理論板數（n）

用於評價色譜柱的分離效能。由於不同物質在同一色譜柱上的色譜行為不同，採用理論板數作為衡量柱效能的指標時，應指明測定物質，一般為待測組分或內標物質的理論板數。

在規定的色譜條件下，注入供試品溶液或各品種項下規定的內標物質溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分峰或內標物質峰的保留時間tR（以分鍾或長度計，下同，但應取相同單位）和峰寬（W）或半高峰寬（Wh/2），按n16（tR/W）2或n5.54（tR/Wh/2）2計算色譜柱的理論板數。

3.2 分離度（R）

用於評價待測組分與相鄰共存物或難分離物質之間的分離程度，是衡量色譜系統效能的關鍵指標。可以通過測定待測物質與已知雜質的分離度，也可以通過測定待測組分與某一添加的指標性成分（內標物質或其他難分離物質）的分離度，或將供試品或對照品用適當的方法降解，通過測定待測組分與某一降解產物的分離度，對色譜系統進行評價與控制。

無論是定性鑒別還是定量分析，均要求待測峰與其他峰、內標峰或特定的雜質對照峰之間有較好的分離度。除另有規定外，待測組分與相鄰共存物之間的分離度應大於1.5。分離度的計算公式為：

式中tR2為相鄰兩峰中後一峰的保留時間；tR1為相鄰兩峰中前一峰的保留時間；W1、W2及W1,h/2、W2,h/2分別為此相鄰兩峰的峰寬及半高峰寬（如圖）。

當對測定結果有異議時，色譜柱的理論板數（n）和分離度（R）均以峰寬（W）的計算結果為准。

3.3 重復性

用於評價連續進樣中，色譜系統響應值的重復性能。採用外標法時，通常取各品種項下的對照品溶液，連續進樣5次，除另有規定外，其峰面積測量值的相對標准偏差應不大於2.0%；採用內標法時，通常配製相當於80%、100%和120%的對照品溶液，加入規定量的內標溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別至少進樣2次，計算平均校正因子。其相對標准偏差應不大於2.0%。

3.4 拖尾因子（T）

用於評價色譜峰的對稱性。為保證分離效果和測量精度，應檢查待測峰的拖尾因子是否符合各品種項下的規定。拖尾因子計算公式為：

式中W0.05h為5%峰高處的峰寬；

d1為峰頂點至峰前沿之間的距離（如圖）。

除另有規定外，峰高法定量時T應在0.95～1.05之間。峰面積法測定時，若拖尾嚴重，將影響峰面積的准確測量。必要時，應在各品種項下對拖尾因子作出規定。

4 測定法

4.1 內標法

按各品種項下的規定，精密稱（量）取對照品和內標物質，分別配成溶液，精密量取各適量，混合配成校正因子測定用的對照溶液。取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測量對照品和內標物質的峰面積或峰高，按下式計算校正因子：

式中AS為內標物質的峰面積或峰高；

AR為對照品的峰面積或峰高；

cS為內標物質的濃度；

cR為對照品的濃度。

再取各品種項下含有內標物質的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測量供試品中待測成分和內標物質的峰面積或峰高，按下式計算含量：

式中AX為供試品的峰面積或峰高；

cX為供試品的濃度；

A'X為內標物質的峰面積或峰高；

c'S為內標物質的濃度；

f為校正因子。

採用內標法，可避免因樣品前處理及進樣體積誤差對測定結果的影響。

4.2 外標法

按各品種項下的規定，精密稱（量）取對照品和供試品，配製成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品溶液和供試品溶液中待測成分的峰面積（或峰高），按下式計算含量：

式中各符號意義同上。

由於微量注射器不易精確控制進樣量，當採用外標法測定供試品中成分或雜質含量時，以定量環或自動進樣器進樣為好。

4.3 加校正因子的主成分自身對照法

測定雜質含量時，可採用加校正因子的主成分自身對照法。在建立方法時，按各品種項下的規定，精密稱（量）取雜質對照品和待測成分對照品各適量，配製測定雜質校正因子的溶液，進樣，記錄色譜圖，按上述（1）法計算雜質的校正因子。此校正因子可直接載入各品種項下，用於校正雜質的實測峰面積。這些需作校正計算的雜質，通常以主成分為參照，採用相對保留時間定位，其數值一並載入各品種項下。

測定雜質含量時，按各品種項下規定的雜質限度，將供試品溶液稀釋成與雜質限度相當的溶液作為對照溶液，進樣，調節檢測靈敏度（以雜訊水平可接受為限）或進樣量（以柱子不過載為限），使對照溶液的主成分色譜峰的峰高約達滿量程的10%～25%或其峰面積能准確積分[通常含量低於0.5%的雜質，峰面積的相對標准偏差（RSD）應小於10%;含量在0.5%～2%的雜質，峰面積的RSD應小於5%;含量大於2%的雜質，峰面積的RSD應小於2%]。然後，取供試品溶液和對照品溶液適量，分別進樣，供試品溶液的記錄時間，除另有規定外，應為主成分色譜峰保留時間的2倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質的峰面積，分別乘以相應的校正因子後與對照溶液主成分的峰面積比較，依法計算各雜質含量。

4.4 不加校正因子的主成分自身對照法

測定雜質含量時，若沒有雜質對照品，也可採用不加校正因子的主成分自身對照法。同上述（3）法配製對照溶液並調節檢測靈敏度後，取供試品溶液和對照溶液適量，分別進樣，前者的記錄時間，除另有規定外，應為主成分色譜峰保留時間的2倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質的峰面積並與對照溶液主成分的峰面積比較，計算雜質含量。

若供試品所含的部分雜質未與溶劑峰完全分離，則按規定先記錄供試品溶液的色譜圖Ⅰ，再記錄等體積純溶劑的色譜圖Ⅱ。色譜圖Ⅰ上雜質峰的總面積（包括溶劑峰），減去色譜圖Ⅱ上的溶劑峰面積，即為總雜質峰的校正面積。然後依法計算。

4.5 面積歸一化法

按各品種項下的規定，配製供試品溶液，取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測量各峰的面積和色譜圖上除溶劑峰以外的總色譜峰面積，計算各峰面積占總峰面積的百分率。

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離子交換色譜有什麼要求

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