離子交換層析濃縮蛋白質實驗報告

Ⅰ 求離子交換柱層析法和擁有分子篩作用的（叫什麼忘了）的兩個實驗報告或操作詳細說明

離子交換層析
Tina 發表於 2006-2-21 12:21:00
材料與儀器

DEAE-32纖維素，pH8.0 0.01 mol/L Tris-HCl，工程菌破碎離心後的上清液；

層析柱

二、 方法與步驟

1） 裝柱：

用水清洗層析柱，柱內留存水距底部約1cm，加入18ml介質（凝膠溶液）。

2） 平衡：

加0.01M,PH8.0,tris-HCl緩沖液，直至流出液PH與緩沖液一致。

3） 上樣：

用量筒量出上清液體積，再加入等體積緩沖液混合，取EP管留1.5ml。待柱中水流出，至剛好覆蓋凝膠表面，靠璧緩慢加樣。

4) 用50ml緩沖液洗滌，用EP管隨機收集樣品穿出液和洗滌穿出液。

5) 洗脫：

將梯度洗滌儀和層析柱連接，洗脫瓶A（混合器）加200µl緩沖液，開口打開至兩瓶液面相平，相通管道出無氣泡，關閉連接，A中加入6gNaCl溶解，把裝置放在梯度混合儀上，開動攪拌器開關，打開A和B的連接通道，層析柱下端連收集器，收集洗脫流出液。

6） 控制流速，約4min/管，2-3ml/管。

分子篩的是凝膠層析
Sephadex G-100凝膠層析
Tina 發表於 2006-2-21 12:27:00
材料與儀器

Sephadex G-100，0.5 mol/L pH8.0 Tris-HCl，濃縮液

層析柱

二、 方法與步驟

1） Sephadex G-100 凝膠預處理

a) 100ml燒杯，稱取5克sephadex G-100,加入50ml去離子水，浸泡溶脹24小時。

b) 傾去sephadex G-100溶脹後凝膠上層的水，加入凝膠等體積的1.0 mol/L NaOH液處理，用攪棒輕輕攪動，並浸泡1小時處理後傾去。用去離子水洗滌。洗滌過程中，用傾去法除去細顆粒。其方法是用攪棒將凝膠攪勻（注意不要過分用力攪拌，以防止顆粒破碎），放置數分鍾，將未沉澱的細顆粒隨上層水倒掉。浮選3-5次，直至上層沒有細顆粒為止，再浸泡水洗至PH中性。

c) 將Sephadex G-100凝膠水溶液盛放於抽濾瓶中，用洗耳球塞住杯口，減壓抽氣30分鍾，除去凝膠溶液內的氣泡，將脫氣後的凝膠溶液輕輕倒入燒杯中，其中盛有1/2去離子水。

2) 裝柱

a) 層析柱(1.0Î50cm)用水清洗干凈，柱的上、下端聯接塑料管接上小乳膠管，裝上螺旋夾。將層析柱垂直裝好。校直過程用下端綁有鑰匙的繩子掛於鐵架的不同位置，從多角度校正使柱垂直。打開柱上埠，從柱底下出口管朝柱內注入水，使柱底全部充滿水而不留氣泡，關閉柱出口。最終柱內留存有2 cm的水。從出口處接上一根直徑2 mm細塑管，塑管另一端固定在柱的上端部位。

b) 攪動凝膠溶液（切勿攪動太快，以免空氣再逸入），使形成均一的薄膠漿，並立即沿玻棒倒入層析管內，讓加入的凝膠在柱內自然沉降，待柱底面上積起約1-2 cm的凝膠床後，打開柱出口水流。隨著柱內水的流出，上面不斷加入凝膠液，使形成的凝膠床面上有凝膠連續下降（如果凝膠床面上不再有凝膠顆粒下降，應該用攪棒均勻地將凝膠床攪起數厘米高，然後再加凝膠，不然就會形成界面，影響層析效果）。

c) 凝膠沉積到柱內凝膠是否均勻，有否「紋路」或氣泡。若層析柱不均一，必須重新裝柱。

3） 平衡

柱裝好後，使層析床穩定15-20分鍾，然後連接洗脫瓶出口和層析柱頂端，用3-5倍體積地緩沖液平衡層析柱。平衡過程中控制上柱緩沖液地進柱操作壓保持恆定。保持流速每滴/10秒。直至流出液的PH與上柱緩沖液完全相同。

4） 樣品洗脫

a) 上樣准備：

i) 上樣前打開層析柱上端，先檢查凝膠床界面是否平整，如果傾斜不平整，可用玻棒將凝膠床界面輕輕攪起後，再使凝膠自然沉降，形成平整狀態的凝膠床界面。用毛細吸管小心吸去大部分清液，然後讓液面自然下降，直至幾乎露出凝膠床界面。

ii) 樣品放入高速離心機，12000r/min、離心5 min。

iii) 上樣前吸取50µl樣品於EP管中，以備走電泳。

b) 樣品上樣：

i) 將樣品由玻棒引流沿管壁加入到凝膠床面上，注意不要將床面凝膠沖起。同時打開層析柱下面流出液開關（控制流速1滴/20秒），保持層析柱下面流出滴速與上樣的滴速一致，控制凝膠床界面不能脫水，並控制樣品區帶盡量狹窄。

ii) 當1.5ml樣品全部加入後，用 1-2 ml的0.5mol/L PH8.0 Tris-HCl洗脫液同上樣時一樣地保持層析柱下面流出滴速與上樣的滴速一致以控制凝膠床界面不能脫水，小心清洗凝膠床界面表面，使黏附著的樣品全部洗入凝膠床。

iii) 然後開始控制上樣的滴速大於層析柱下面流出滴速，使幾乎與凝膠床界面相平的洗脫液液面慢慢提高至凝膠床界面高出2cm左右，封閉層析柱上端。

iv) 保持層析柱上柱洗脫液入口處與層析柱下面流出處有一定勢壓。控制上柱緩沖液的進柱操作壓保持恆定。

c) 洗脫：

用0.1 mol/L PH8.0 Tris-HCl 緩沖液洗脫，用部分收集器收集，4分鍾/管（約2-3ml/管），收集約1-30管。

5） 酶活、酶濃度測定，參見2.6.2，2.6.3

6） 最高酶活收集管洗脫液留50µl，以備走電泳。

7） 將酶活較高的收集液10~14管合並，測定總體積為7.1 ml，精確測定酶活性。並用考馬思亮藍測定蛋白濃度。測酶活時體系稀釋了200倍，定蛋白時無稀釋。

Ⅱ 蛋白質提取分離純化鑒定的實驗方案

一.血清ǐ-球蛋白的初步提取
1. 血細胞與血清分離：
取人血液 1000ml,放置10min, 1000rpm離心20min .棄沉澱,留上清備用(沉澱為血細胞，上部為血清).
2. 乳糜粒分離：4000rpm 10°C離心10分鍾,採用密度梯度離心
梯度液配置：離心管下部3/4容積加血漿，上部1/4容積加0.5MnaCl+0.3MEDTA,PH7.4 乳糜粒上浮，將乳糜粒吸出,留其餘液體備用。
3. 血清蛋白分離：除去球蛋白，白蛋白及其它蛋白質。
5000rpm 10°C離心1h,密度梯度離心
梯度.液配置：管容量1/3為血清，2/3為1。31g/ml,NaCl+NaBr,攪拌後終密度為1。21g/ml .管上部1/6容積為血清脂蛋白，下部5/6為其它蛋白。
4.取2ml下部5/6血清於小試管中,加0.9％氯化鈉溶液2.0ml，邊攪拌混勻邊緩慢滴加飽和硫酸銨溶液乙4.0ml，加入PBS洗脫液2ml,混勻後於室溫中放置10min，此步驟可重復1～2次
3000rpm 離心5min.沉澱物即是ǐ-球蛋白.
二.凝膠層析提純血清ǐ-球蛋白(1)裝柱：海綿墊裝入玻璃柱底端,作為柱底支持物,裝入定量的蒸餾水(約為柱體積的1/5),以避免膠粒直接沖擊柱底支持物;用玻璃棒小心排除柱底支持物.將密實洗凈的層析柱保持垂直位置，關閉出口，柱內留下約2.0ml洗脫液。邊攪拌凝膠,邊向柱內緩慢,連續,均勻地加入凝膠,(打開柱底端的螺旋夾)不要中斷,使膠粒均勻沉降,以免膠面一次性將疑膠從塑料介面加入層析柱內，打開柱底部出口，調節流速0.3ml/min。凝腔隨柱內溶液慢慢流下而均勻沉降到層析柱底部傾斜和發生斷層;檢查裝好的凝膠柱用眼觀察有無凝膠分層.溝流和氣泡現象.最後使凝膠床達20厘米高，床面上保持有洗脫液，操作過程中注意不能讓凝膠床表面露出液面並防止層析床內出現「紋路」。用緩沖液平衡凝膠柱,流速控制在3-5s/滴.(2)上樣與洗脫：小心控制凝膠柱下端活塞，使柱上的緩沖液面剛好下降至凝膠床表面，關緊下端出口，用長滴管吸取鹽析法制備的球蛋白混合樣品，將裝有上樣液的滴管頭插入床面以上1-2cm處,小心緩慢地貼壁加到凝膠床表面。柱上樣量控制在柱體積的2%-5%.打開下端出口，將流速控制在0.25ml/min使樣品進入凝膠床內。關閉出口，小心加入少量0.0175mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)洗柱內壁。打開下端出口，待緩沖液進入凝膠床後再加少量緩沖液。如此重復三次，以洗凈內壁上的樣品溶液。然後可加入適量緩沖液開始洗脫。加樣開始應立即收集洗脫液。洗脫時接通蠕動泵，流速為0.5ml/min,用部分收集器收集，每管1ml。(3)洗脫液中NH4+與蛋白質的檢查：取比色板兩個(其中一個為黑色背底)，按洗脫液的順序每管取一滴，分別滴入比色板中，前者加雙縮脲2滴，出現藍色混濁即示有蛋白質析出，由此可估計蛋白質在洗脫各管中的分布及濃度；於另一比色板中，加人奈氏試劑l滴，以觀察NH4+出現的情況。 合並球蛋白含量高的各管，混勻。除留少量作電泳鑒定外，其餘用DEAE纖維素陰離子交換柱進一步純化。三．純化――DEAE纖維素陰離子交換層析用DEAE纖維素裝柱約8-10cm高度，並用0.0175mol／L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)平衡，然後將脫鹽後的球蛋白溶液緩慢加於DEAE纖維素陰離子交換柱上，用同一緩沖液洗脫、分管收集。用20％磺基水楊酸溶液檢查蛋白質分布情況。(裝柱、上樣、洗脫，收集及蛋白質檢查等操作步驟同凝膠層析)。四．濃縮經DEAE纖維素陰離於交換柱純化的γ－球蛋白液往往濃度較低。為便於鑒定，常需濃縮。收集較濃的純化的γ－球蛋白溶液2m1，按每ml加0.2～ 0.25gSephadex G一25干膠，搖動2～3min， 3000r／min 離心5min。上清液即為濃縮的γ-球蛋白溶液。五. 乙酸纖維素薄膜電泳鑒定ǐ-球蛋白(一)儀器與薄膜的准備1.醋酸纖維素薄膜的潤洗與選擇用竹夾子取一片薄膜，小心地平放在盛有緩沖液的平皿中，若漂浮於液面的薄膜在15—30s內迅速潤濕，整條薄膜色澤深淺一致，則此膜均勻可用於電泳；若薄膜潤濕緩慢，色澤深淺不一或有條紋及斑點等，則表示薄膜厚薄不均勻應棄去，以免影響電泳結果。將選好的薄膜用竹子輕壓，使其完全浸泡於緩沖液中約30min後，方可用於電泳。
2.電泳槽的准備根據電泳槽膜支架的寬度，剪裁尺寸合適的濾紙條。在兩個電極槽中，各倒入等體積的電極緩沖液，在電泳槽的兩個膜支架上，各放兩層濾紙條，使濾紙一端的長邊與支架前沿對齊，另一端浸入電極緩沖液內。當濾紙條全部潤濕後，用玻璃棒輕輕擠壓在膜支架上的濾紙以驅趕氣泡，使濾紙的一端能緊貼在膜支架上。濾紙條是兩個電極槽聯系醋酸纖維素薄膜的橋梁，因而稱為濾紙橋。
3.電極槽的平衡用平衡裝置(或自製平衡管)連接兩個電泳槽，使兩個電極槽內的緩沖液彼此處於同一水平狀態，一般需平衡15——20min。注意，取出平衡裝置時應將活塞關緊。
(二)點樣
1.制備點樣模板取一張干凈濾紙(10×10cm)，在距紙邊1.5cm處用鉛筆劃一平行線，此線為點樣標志區。
2.點樣用竹夾子取出浸透的薄膜，夾在兩層濾紙間以吸去多餘的緩沖液。無光澤面向上平放在點樣模板上，使其底邊與模板底邊對齊。點樣區距陰極端1.5cm處。點樣時，先用玻璃棒或血色素吸管取2—3�0�8L血清，均勻塗在加樣器上，再將點樣器輕輕印在點樣區內，使血清完全滲透至薄膜內，形成一定寬度、粗細均勻的直線。此步是實驗的關鍵，點樣前應在濾紙上反復練習，掌握點樣技術後再正式點樣。
(三).電泳用竹夾子將點樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上(點樣面朝下)，另一端平貼在陽極端支架上，要求薄膜緊貼濾紙橋並綳直，中間不能下垂。如一電泳槽中同時安放幾張薄膜，則薄膜之間應相隔幾毫米。蓋上電泳槽蓋，使薄膜平衡10min。用導線將電泳槽的正、負極與電泳儀的正、負極分別連接，注意不要接錯。在室溫下電泳，打開電源開關，用電泳儀上細調節旋扭調到每厘米膜寬電流強度為0.3mA(8片薄膜則為4.8mA)。通電10—15min後，將電流調節到每厘米膜寬電流強度為0.5mA(8片共8 mA)，電泳時間約50—80min。電泳後調節旋扭使電流為零，關閉電泳儀切斷電源。
(四).染色與漂洗
1.血清蛋白染色與漂洗脫色用解剖鑷子取出電泳後的薄膜，放在含0.5%氨基黑10B染色液的培養皿中，浸染5min，取出後再用漂洗液浸洗脫色，每隔10min 換漂洗液一次，連續數次，直至背景藍色脫盡。取出薄膜放在濾紙上，用吹風機的冷風將薄膜吹乾。
(五)透明將脫色吹乾後的薄膜浸入透明甲液中2min，立即放入透明乙液中浸泡1min，取出後立即緊貼於干凈玻璃板上，兩者間不能有氣泡，約2—3min薄膜完全透明。若透明太慢可用滴管取透明乙液少許在薄膜表面淋洗一次，垂直放置待其自然乾燥，或用吹風機冷風吹乾且無酸味。再將玻璃板放在流動的自來水下沖洗，當薄膜完全潤濕後用單面刀片撬開薄膜的一角，用手輕輕將透明的薄膜取下，用濾紙吸干所有的水分，最後將薄膜置液體石蠟中浸泡3min，再用濾紙吸干液體石蠟，壓平。此薄膜透明，區帶著色清晰，可用於光吸收計掃描。長期保存不褪色。
(六)結果判斷與定量血清蛋白電泳經蛋白染色後，可顯示出區帶，未經透明處理的電泳圖譜可直接用於定量測定。可採用洗脫法或光吸收掃描法，測定各蛋白組分相對百分含

Ⅲ 建立離子交換法純化蛋白質的方法需要摸索哪些條件

1. pH值，緩沖液的pH值對於蛋白結合離子交換層析有非常大的影響，需要先摸索出合適的版pH值，既能權保證蛋白結合上離子交換層析，又不會出現不穩定沉澱的情況。

2. 鹽濃度，鹽濃度是離子交換層析洗脫的關鍵，需要摸索出蛋白能在什麼樣的鹽濃度下被洗脫，且洗脫後純度能夠達到最初的要求。

3. 柱體積，盡管各種離子交換層析均有理論結合蛋白量，但各種蛋白情況不一樣，需要摸索出能夠完全結合目的蛋白合適的柱體積。既不會太大造成洗脫濃度過稀，也不會太小造成目標蛋白過載。

4. 溫度，溫度可能會造成蛋白變性等等。

Ⅳ 如果一個蛋白質只是在PH6-6.5范圍內穩定，請設計一個通過離子交換層析純化該蛋白質的實驗

你是不是說混淆了，到底是等電點在pH6-6.5？還是等電點未知，確在6-6.5穩定？
我就先按等電點來理解，回答你的問題。
如果對蛋白純化的濃度要求不高，或者待純化樣品成分簡單，雜蛋白少，就選一種離子交換層析，即陽離子離子交換層析（running buffer 設pH5.0比較合適）或陰離子交換層析（running buffer 設pH7.5比較合適）。
如果雜蛋白多，就用兩步離子交換層析，即結合陰陽離子交換層析。一般建議先做陽離子交換層析（這樣第一步可去掉核酸之類的）。不知你要多具體的步驟，先寫個大致步驟吧：
1，陽離子交換層析：將你的樣品置換到pH5.0的running buffer（一般醋酸鈉buffer）。同時裝住，平衡啥的，然後上樣，平衡，洗脫（升pH或鹽洗脫），收峰。這步就去掉等電點在6之下的大部分雜蛋白；
2，陰離子交換層析：將所收蛋白置換buffer至pH7.5的running buffer（PB），同時裝住，平衡啥的，然後上樣，平衡，洗脫（降pH或鹽洗脫），收峰。去掉pH6.5之上的大部分雜蛋白。
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如果你確實所指在6-6.5穩定，那就看你蛋白的等電點在多少了，只好選一種離子交換層析，在6.5之上就試試pH6.0的running buffer做陽離子交換層析，在6.0之下，就試試pH6.5的running buffer做陰離子交換層析。
若有疑問，歡迎繼續討論，純屬手打，歡迎採納，祝新年愉快！

Ⅳ 分離pl差異較大的蛋白質

分離pl差異較大的蛋白質可以用電泳法或離子交換層析法分離。根據蛋白質帶電性質進行分離。
1、電泳法。各種蛋白質在同一pH條件下，因分子量和電荷數量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質作為載體，電好並泳時兩性電解質形成一鏈橋個由正極到負極逐漸增加的pH梯度，當帶一定電荷的蛋白質在其中泳動時，到達各自等電點的pH位置就停止，此法可用於分析和制備各種蛋白質。棚襪猛
2、離子交換層析法。離子交換劑有陽離子交換劑和陰離子交換劑，當被分離的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上，隨後用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質洗脫下來。

Ⅵ 蛋白質的純化實驗

一、儀器設備
色析管柱 （Pharmacia C column, 1.6×100 cm）、鐵架、鐵夾及水平儀；部分收集器（fraction collector, 需准備干凈試管約100 支）；濃縮用離心機 （低速5,000 rpm）；濃縮用離心管Centriprep-30 （Amicon 4322） 請注意其使用方法。

二、葯品試劑
膠體Sephacryl S-300 （Pharmacia）：a. 預先以緩沖液buffer A-150 平衡好，並且使完全沈降後的膠體體積，佔全部體積的七至八成；要先預估好膠體的使用量。b. 膠體溫度要與操作場所的溫度一致，否則溫度變化會產生氣泡。c. Sephacryl 系列膠體有相當大的吸附力，因此要在緩沖液加入0.15 M 以上的NaCl 以除去非專一性吸附。Buffer A-150:注意使用時的溫度要與管柱膠體的溫度一致標準分子量組合 （Bio-Rad 151-1901）：溶於1 mL 後每組取0.4 mL.含有thyroglobulin （670 kD）， bovine gamma globulin （158 kD）， chicken ovalbumin （44 kD）， equine myoglobin （17 kD）， vitamin B12 （1 350）。

三、管柱裝填

1. 以純水沖洗玻璃管柱 （以純水上下沖洗即可，嚴禁使用試管刷）；並請了解管柱的構造與拆裝方法，垂直架好管柱，以軟管連接部分收集器，並以bufferA-150 試看管路是否通暢；可以用止血鉗或長尾文書夾夾住出口軟管，則可控制溶離的進行。 注意系統的擺設要適當，不要裝置於交通要沖。

2. 依預估量取出Sephacryl 膠體，注意膠體的溫度與緩沖液是否已平衡；將瓶中的膠體上下震盪，使的完全懸浮，但勿產生太多氣泡。

3. 在管柱內加入約10 cm 高緩沖液，然後將膠體慢慢沿著管壁倒入管柱，一直加到管柱頂端，開始流洗後膠體沈降很快。當膠體上方的液面逐漸降低時，可於頂端添加膠體，以達所要高度；膠體高度約90 cm。

4. 膠體完全沈降後，小心以buffer A-150 加滿管柱，關閉出口，裝上頂端端蓋並連通緩沖液瓶，打開出口以重力流洗。 調整緩沖液瓶高度，使流速約每五~六秒一滴，並設定收集體積為2.5 mL/tube。

5. 膠柱流洗約100 mL 後，關閉出口，拆開頂端端蓋，先以滴管吸出膠體上方的溶液到剩約1 cm 高，注意勿破壞膠體表面平整； 然後打開出口，使液面下降至膠體面，再關閉出口，准備注入樣本。

四、樣本色析進行

1. 以微量移液器或滴管吸取樣本 （樣本體積不得超過膠體總體積的3%），沿著膠體上方管壁緩慢加入，注意切勿破壞膠體的平整表面。

2. 打開出口，同時開啟部分收集器；當樣本完全沒入膠體時，關閉出口，緩緩加入與樣本相等體積的buffer A-150，打開出口待其慢慢進入膠體中，如此重復二次。不得擾動膠體表面，造成凹陷。

3. 暫時關閉出口，將液面高度加滿至管柱頂端，並把頂端端蓋鎖上；然後打開出口開始溶離，調整緩沖液瓶的高度，使流速為6 s 一滴。

4. 要留心觀察前面幾個分劃，確定整個系統運轉無礙，小心部分收集器最容易出問題。管柱預計將流洗過夜，收集約80 管。
10） 收集試管，進行蛋白質定量分析以及GUS 活性測定，並請作圖。

5. 收集GUS 活性區，以Centriprep-30 濃縮至10 mL 後，加buffer A-0 稀釋至20 mL，保留100 μL。

6. 管柱請再以buffer A-150 流洗100 mL 後，小心放置一旁，准備以後進行分子量測定。

五、分子量測定

1. 進行分子量測定前一天，請先以buffer A-150 流洗100 mL，並檢查膠柱內有無氣泡產生，若有嚴重的氣泡或乾裂，必須重新裝填管柱。

2. 取標準分子量溶液0.4 mL,加上純質目標酶0.5 mL （以親和層析法所得的AF 部份），如上法注入管柱中，立刻開始進行膠體過濾，並收集各分劃。請依循上述所有管柱及分劃收集器的操作要點。

3. 收集所得，進行蛋白質定量分析，可定出數個蛋白質尖峰，以作為分子量依據；另以目測法，決定紅色高峰的管數，則可定出vitamin B12的溶離管數。利用以上數據，可畫出分子量與溶離管數間的直線關系，作為分子量判定的標准校正線。

4. 同樣的一批分劃，請進行酶活性分析 （GUS），則可定出酶的溶離體積，對照上述標准校正線，則可求出酶的分子量。

六、拆除管柱及保存膠體
1. 若管柱長期不用，應當自管柱中取出膠體，以緩沖液清洗後，置冷藏室中保存，但絕對不要放在冷凍箱中。膠體若裝填太緊，有時可能不易取出，要有耐心地以緩沖液慢慢沖出來。

2. 膠體可以加0.01% NaN3防止黴菌生長，但使用前記得要洗去；再度使用時，請檢查膠體中有無灰黑色黴菌顆粒，若有結塊而不易打散者，也不要使用。

Ⅶ 離子交換層析法分離單核苷酸 求一份實驗結果

氨基酸的分離鑒定——紙層析法
一,實驗目的
掌握氨基酸紙層析的方法和原理,學會分析待
測樣品的氨基酸成分.
二,實驗原理
紙層析是以濾紙為惰性支持物的分配層析.濾紙纖維上的羥基具有親水性,吸附一層水作為固定相,有機溶劑為流動相.當有機相流經固定相時,物質在兩相間不斷分配而得到分離.
溶質在濾紙上的移動速度用Rf值表示:
Rf=原點到層析斑點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離
在一定的條件下某種物質的Rf值是常數.Rf值的大小與物質的結構,性質,溶劑系統,層析濾紙的質量和層析溫度等因素有關.本實驗利用紙層析法分離氨基酸.
三,實驗器材
(1)大燒杯(5000mL):1隻/組
(2)微量注射器(100 L):1隻/ 組.
(3)噴霧器:公用.
(4)培養皿:1隻/組.
(5)層析濾紙(長22cm,寬14cm的新華一號濾紙):1張/組.
(6)直尺,鉛筆:自備.
(7)電吹風:1隻/組.
(8)托盤,針,白線:1套/組.
(9)手套:1雙/組.
(10)塑料薄膜:公用.
(11)小燒杯:50mL,1隻/組.
四,實驗試劑
(1)擴展劑:將4體積正丁醇和1體積冰醋酸放入分液漏斗中,與5體積水混合,充分振盪,靜置後分層,棄去下層水層.
(2)氨基酸溶液:0.5%的已知氨基酸溶液3種(賴氨酸,苯丙氨酸,纈氨酸),0.5%的待測氨基酸液1種.
(3)顯色劑:0.1%水合茚三酮正丁醇溶液.
實驗試劑
五,實驗操作
檢查培養皿是否乾燥,潔凈;若否,將其洗凈並置於乾燥箱內120℃烘乾.
(1)平衡:剪一大塊塑料薄膜鋪在桌面上,將層析缸或大燒杯到置於塑料薄膜上,再把盛有約20mL展層溶液的小燒杯置於倒置的層析缸或大燒杯中,用塑料薄膜密封起來,平衡20min.
(2)規劃:帶上手套,取寬約14cm,高約22cm的層析濾紙一張.在紙的下端距邊緣2cm處輕輕用鉛筆劃一條平行於底邊的直線A,在直線上做4個記號,記號之間間隔2cm,這就是原點的位置.另在距左邊緣1cm處畫一條平行於左邊緣的直線B,在B線上以A,B兩線的交點為原點標明刻度(以厘米為單位),參見左圖.
(3)點樣:用微量注射器分別取10mL左右的氨基酸樣品(每取一個樣之前都要用蒸餾水洗滌微量注射器,以免交叉污染),點在這四個位置上.擠一滴點一次,同一位置上需點2～3次,2～3mL/次,每點完一點,立刻用電吹風熱風吹乾後再點,以保證每點在紙上擴散的直徑最大不超過3mm.每人須點4個樣,其中3個是已知樣,1個是待測樣品.
(4)層析:用針,線將濾紙縫成筒狀,紙的兩側
邊緣不能接觸且要保持平行,參見圖3-3.向培養皿中加入擴展劑,使其液面高度達到1cm左右,將點好樣的濾紙筒直立於培養皿中(點樣的一端在下,擴展劑的液面在A線下約1cm),罩上大燒杯,仍用塑料薄膜密封.當擴展劑上升到A線時開始計時,每隔一定時間測定一下擴展劑上升的高度,填入表3-1中.當上升到15～18cm,取出濾紙,剪斷連線,立即用鉛筆描出溶劑前沿線,迅速用電吹風熱風吹乾.
(5)顯色:用噴霧器在通風廚中向濾紙上均勻噴上0.1%茚三酮正丁醇溶液,然後立即用熱風吹乾,即可顯出各層析斑點,參見左圖.
(6)計算各種氨基酸的Rf值,並判斷混合樣品中都有哪些氨基酸,各人將自己的實驗結果貼在實驗報告上,見表3-2.
(7)以層析時間為橫坐標,擴展劑上升高度為縱坐標畫圖,求出擴展劑上升到18cm時所需要的時間.
(8)將微量注射器內外用蒸餾水清洗干凈,倒掉用過的展層液和平衡液,將培養皿洗凈,整理好桌面上的儀器和試劑

Ⅷ 生物化學離子交換柱層析法分離氨基酸實驗報告

錦州新科水處理設備廠
生產各種水處理設備,有機玻璃離子交換柱
電話:0416-3920228

Ⅸ 離子交換層析的原理是什麼 已解決

離子交換層析法是從復雜的混合物中，分離性質相似大分子的方法之一，依據的原理是物內質的酸鹼性容，極性，所帶陰陽離子的不同。電荷不同的物質，對管柱上的離子交換劑有不同的親和力，改變沖洗液的離子強度和pH值，物質就能依次從層析柱中分離出來。

層析開始前，功能基團與反離子穩定結合，就與反離子發生可逆交換，與層析劑結合被固定下來。因為鹽離子可以與底物競爭功能基團，鹽濃度越高樣品與層析劑結合越不緊密，易被洗脫下來。不同物質與層析劑結合程度不同，洗脫下來的時間不同，因此得以分開。

(9)離子交換層析濃縮蛋白質實驗報告擴展閱讀

離子交換劑的選擇首重保持欲分離物質的生物活性，以及在不同pH值環境中，此物質所帶的電荷和電性強弱，陰陽離子交換劑的選擇若被分離物質帶正電荷，這些鹼性蛋白質，它們在酸性溶液中較穩定，親和力強，故採用陽離子交換劑。

在鹼性溶液中較穩定，則使用陰離子交換劑，如果欲分離的物質是兩性離子，一般考慮在它穩定的pH范圍帶有何種電荷，作為交換劑的選擇。離子交換劑的再生與保存離子交換劑可在柱上再生，若有脂溶性物質則可用非離子型去污劑洗柱後再生，也可用乙醇洗滌。

Ⅹ 怎樣利用離子交換柱層析法分離不同的蛋白質

離子交換柱層析法的核心在於不同的蛋白質的等電點不同
所以說，利用離子交換柱層析法分離不同的蛋白質其實就是利用不同蛋白質不同的等電點來分離。比如目的蛋白等電點是5，那麼在環境pH為8.0的情況下，目的蛋白可以結合陰離子交換層析，而雜蛋白可能不能結合或者結合能力比目的蛋白弱。通過不同的鹽濃度的洗脫讓結合能力不同的蛋白在不同的組分被洗脫出來，最終完成對目的蛋白和雜蛋白的分離。