離子交換色譜法分級多糖

1. 離子交換純化多糖使用什麼方法檢測收集

離子交換純化多糖使用什麼方法檢測收集
鑒定多糖（參考資料）：
1.苯酚-硫酸法 需要多糖的純品和特定的酶
2.蒽酮-硫酸法 多糖在濃硫酸水合產生的高溫下迅速水解，產生單糖，單糖在強酸條件下與苯酚反應生成橙色衍生物。在波長490nm左右處和一定濃度范圍內，該衍生物的吸收值與單糖濃度呈線性關系，從而可用比色法測定其含量，所用的單糖對照品盡量採用與其多糖組成一致或為含量較高的單糖，這樣測得的值較准確。
3.3，5-二硝基水楊酸比色法（DNS法） 在鹼性條件下顯色，較准確測定還原糖與總糖的含量從而求出多糖的含量，可消除還原性雜質的干擾。

多糖的分離純化
在多糖提取物中，常會有無機鹽、蛋白質、色素及小分子物質等雜質，必須分別除去．一般是先脫除非多糖組分，再對多糖組分進行分級．
2．1 除蛋白：除蛋白質時一般選擇能使蛋白質沉澱而不使多糖沉澱的試劑來處理，如酚、三氯乙酸、鞣酸等。但必須處理時間短，溫度低，避免多糖降解。Sevage法（氯仿：戊醇/丁醇=4：1）和三氟三氯乙烷法在避免降解上有較好效果但要達到除盡游離蛋白質的目的仍需反復處理。如能加入蛋白質水解酶，使蛋白質大分子進行一定程度的降解，再用Sevage法處理，一般效果更好。
為了避免使用有機溶劑也可採用反復凍融的方法除蛋白，將多糖液濃縮後，一20℃室溫反復凍融7～8次，離心除去蛋白質。另外，蛋白質在等電點時溶解度最小，用氫氧化鈣飽和液調pH10～pH11可除去偏鹼性的蛋白質，然後再用硫酸調pH5～pH6，可除去偏酸性的蛋白質。凍融和等電點沉澱除蛋白質操作簡單，但多糖液里往往有低濃度的蛋白質殘留，應與其它方法結合使用。
2．2 脫色：植物多糖提取物中含有酚類化合物而使其顏色較深，可用吸附劑(纖維素、硅藻土、活性炭等)、離子交換柱(DEAE一纖維素)、氧化劑(H2O2)等脫除。活性炭比表面積大，吸附能力強，在進行當歸多糖的提取時只向多糖液中加入了0．1％左右的活性炭，煮沸後濾過即完成了脫色操作。此法成本低廉，適合工業化生產。
2．3 除小分子雜質
小分子雜質如低聚寡糖的殘留往往影響多糖的生物活性，需要進一步脫除，提高純度。傳統的方法是透析法，該法操作簡單、技術成熟，但周期長，往往需要2一3天，常溫下操作有可能造成多糖的霉變，必要時需加入少量防腐劑或需在低溫條件下進行。隨著膜分離技術的發展，纖維濾器透析法已經發展起來了，它利用不同孔徑的膜使大小不同的分子分級，這種方式可縮短生產周期，而且條件溫和，無疑是多糖脫除雜質的一條新途徑。
2．4 多糖的分級純化
採用一般方法提取的多糖通常是多糖的混合物，分級的方法可達到純化的目的．可按溶解性不同進行分級、按分子大小和形狀分級(如分級沉澱、超濾、分子篩、層析等)，也可按分子所帶基團的性質分級．
2．4．1按溶解性不同分離
2.4.1.1分步沉澱法
分步沉澱法是根據不同多糖在不同濃度低級醇、酮中具有不同溶解度的性質，從小到大按比例加入甲醇或乙醇或丙酮進行分步沉澱．
2.4.1.2 鹽析法
鹽析法是根據不同多糖在不同鹽濃度中溶解度不同而將其分離的一種方法。常用的鹽析劑有氯化鈉、氯化鉀、硫酸銨等，其中以硫酸銨最佳。
2.4.2 按電離性質不同分離
2.4.2.1季胺鹽沉澱法
季胺氫氧化物是一類乳化劑，能與酸性多糖形成不溶性化合物季銨絡合物，此絡合物在低離子強度的水溶液中不溶解而產生沉澱。若提高多糖液pH值或加入硼砂緩沖液，也可使中性多糖沉澱分離。常用季銨鹽有十六烷基三甲基季銨鹽的溴化物及其氫氧化物和十六烷基吡啶。
2．4．3 柱層析法
2.4.3.1凝膠柱層析法
凝膠柱層析法常用的凝膠有葡聚糖凝膠(Sephadex)和瓊脂糖凝膠(Sepharose)，以不同濃度的鹽溶液和緩沖溶液作為洗脫劑，從而使不同大小的多糖分子得到分離純化，但不適宜粘多糖的分離。
2.4.3.2纖維素陰離子交換劑柱層析法
纖維素陰離子交換劑柱層析法常用的交換劑為DEAE一纖維素和ECTEOLA一纖維素，分類硼砂型和鹼型兩種，洗脫劑可用不同濃度鹼溶液、硼砂溶液、鹽溶液，其優點可吸附雜質、純化多糖，並適用於分離各種酸性、中性多糖和粘多糖。如百合多糖、北沙參多糖、太子參多糖等。
2.4.3.3 活性炭柱層析法
活性炭吸附量大、效率高，是分離水溶性物質的常用吸附劑。柱層析時活性炭中常拌入等量的硅藻土作稀釋劑，以增加溶液的流速。糖溶液上柱後先用水洗脫無機鹽、單糖等再依次增加乙醇濃度進行洗脫。
2.4.3.4 離子交換柱層析和普通凝膠柱層析聯用法
有些植物的多糖成分復雜， 除中性多糖外，還含有糖醛酸等，因此往往兩種不同性質的色譜柱聯用才能得到單一多糖組分。
2.4.3.5 三種層析柱聯用
採用離子交換葡聚糖凝膠柱、丙烯葡聚糖凝膠柱和葡聚糖凝膠柱三者聯用，即先進行DEAE—SephadexA柱層析，用蒸餾水洗脫。水洗組分進一步用SephacrylS柱層析，得到主要組分再用SephadexG一100柱層析，有時會有較高的得率。
三、多糖的純度鑒定
經過分級純化的多糖在測定結構前須進行純度鑒定．而且多糖的純度不能用通常化合物的純度標准來衡量，因為即便是多糖純品，其微觀也並不均一，僅代表相似鏈長的多糖分子的平均分布，通常所謂的多糖純品也只是一定相對分子質量范圍的多糖的均一組分．目前常用於多糖純度的鑒定方法有：高效液相、 凝膠層析法、電泳法、色譜法、旋光度法等．

多糖的單糖組分的鑒定稱取多糖粗品8 mg，用2 mL濃度為1 mol／L硫酸100*C水解6 h。飽和Ba(OH)2中和至中性，抽濾，取濾液，濃縮，毛細管點樣，薄層層析法分析。採用硅膠G板105"(2活化2 h後使用。標准糖分別為D一半乳糖，D一葡萄糖，D一甘露糖，L一山梨糖、L一阿拉伯糖。展開劑為正丁醇一冰醋酸一水(4：1：5)(體積比)。用AgNO3一NaOH 溶液顯色。

2. DEAE-52離子交換色譜柱精製多糖 在加洗脫劑前會不會有多糖出來

這個理論上來說是不會有多糖出來的，但是實際上會有很少的部分會流出，這取決於吸附劑的多少，和能力的強弱

3. 色譜法按原理分為幾類

按色譜法分離所依據的物理或物理化學性質的不同，又可將其分為5類，分別是：

1、吸附色譜法：利用吸附劑表面對不同組分物理吸附性能的差別而使之分離的色譜法稱為吸附色譜法。適於分離不同種類的化合物（例如，分離醇類與芳香烴）。

2、分配色譜法：利用固定液對不同組分分配性能的差別而使之分離的色譜法稱為分配色譜法。

3、離子交換色譜法：利用離子交換原理和液相色譜技術的結合來測定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法，利用被分離組分與固定相之間發生離子交換的能力差異來實現分離。

離子交換色譜主要是用來分離離子或可離解的化合物。它不僅廣泛地應用於無機離子的分離，而且廣泛地應用於有機和生物物質，如氨基酸、核酸、蛋白質等的分離。

4、尺寸排阻色譜法：是按分子大小順序進行分離的一種色譜方法，體積大的分子不能滲透到凝膠孔穴中去而被排阻，較早的淋洗出來；中等體積的分子部分滲透；

小分子可完全滲透入內，最後洗出色譜柱。這樣，樣品分子基本按其分子大小先後排阻，從柱中流出。被廣泛應用於大分子分級，即用來分析大分子物質相對分子質量的分布。

5、親和色譜法：相互間具有高度特異親和性的二種物質之一作為固定相，利用與固定相不同程度的親和性，使成分與雜質分離的色譜法。例如利用酶與基質（或抑制劑）、抗原與抗體，激素與受體、外源凝集素與多糖類及核酸的鹼基對等之間的專一的相互作用；

使相互作用物質之一方與不溶性擔體形成共價結合化合物，用來作為層析用固定相，將另一方從復雜的混合物中選擇可逆地截獲，達到純化的目的。可用於分離活體高分子物質、過濾性病毒及細胞。或用於對特異的相互作用進行研究。

其應用：

色譜法的應用可以根據目的分為制備性色譜和分析性色譜兩大類。

制備性色譜的目的是分離混合物，獲得一定數量的純凈組分，這包括對有機合成產物的純化、天然產物的分離純化以及去離子水的制備等。

相對於色譜法出現之前的純化分離技術如重結晶，色譜法能夠在一步操作之內完成對混合物的分離，但是色譜法分離純化的產量有限，只適合於實驗室應用。

分析性色譜的目的是定量或者定性測定混合物中各組分的性質和含量。定性的分析性色譜有薄層色譜、紙色譜等，定量的分析性色譜有氣相色譜、高效液相色譜等。色譜法應用於分析領域使得分離和測定的過程合二為一，降低了混合物分析的難度縮短了分析的周期，是比較主流的分析方法。

在中華人民共和國葯典中，共有超過約600種化學合成葯和超過約400種中葯的質量控制應用了高效液相色譜的方法。

4. 如何讓分離單糖和多糖

方法一：分級沉澱法
糖類多數可溶於水, 三糖以下尚可溶於乙醇.隨著聚合度的增大,在乙醇中的溶解度逐步降低.根據這一性質,在糖的濃水溶液中,分次加入乙醇,使酵的濃度漸增,5％.10％,15％,20％…90％,分取各次析出的沉澱,在產量和醇濃度之間畫出曲線,以此可以粗略地觀察出糖的組分.若遇糖的衍生物,如甲醚、乙酸醑,其極性低於糖,可在有機溶劑中進行分級沉澱嘲1.多糖的分子量范圍廣,且有共沉澱現象.此法只能作粗略的分離用,需反復進行及綜合使用別的方法才能達到糖的組分均一,物理常數恆定。
方法二：凝膠層析法
凝膠層析法(凝膠過濾法或分子篩層析法)主要利用具有三維網狀結構的多孔性凝膠,其孔徑大小決定於合成凝膠時所加交聯劑的程度.當含有混合溶質的溶液流經適當的凝膠柱時,小分子易擴散入孔中,而大的則不易擴散,各溶質洗脫順序隨分子量由大及小,漸次流出.此法對於不同聚合度的糖類分離特別有效。方法快速、簡單,條件溫和.常用的有葡聚糖凝膠(sephadex G)、瓊脂糖凝膠(SepharoseBio—gel A)、聚丙烯醯胺凝膠(Bio—gel P)等。
方法三：纖維素柱層析
纖維素對多糖的分離,是利用混合糖的溶液,流經預先以另一種溶劑(如乙醇)混懸的纖維素柱,多糖在此多孔支持介質上析出沉澱,再以遞減醇濃度的稀醇逐步洗脫,溶出各種多糖.流出柱的先後順序通常是水溶性大的先出柱,水溶性差的最後出柱,與分級沉澱法正好相反.此法較分級沉澱法為優,因為其接觸面大。。
方法四：離子交換纖維素層析
常用的陽離子交換纖維素有CM-cellulose、P—celhlose、SE—cellulose、SM-cellulose；陰離子交換纖維素有DEAE-cellulose、ECTE—cellulose、PAB-cellulose、TEAE-cellulose等.其中陽離子交換纖維素特別適用於分離酸性、中性多糖和粘多糖.交換劑對多糖的吸附力與多糖的結構有關,通常多糖分子中酸性基團增加則吸附力隨之增加：對於線狀分子,分子量大的較分子量小的易吸附；直鏈的較分枝的易吸附.在pH 6時酸性多糖可吸附於交換劑上,中性多糖則不能被吸附.當用硼砂將交換荊預處理後,則中性多糖也可以被吸附。
方法五：季銨鹽沉澱法
陽離子型清潔劑如十六烷基三甲銨鹽(CTA鹽)和十六烷基吡啶鹽(CP鹽)等和酸性多糖陰離子可以形成不溶於水的沉澱,使酸性多糖自水溶液中沉澱出來,中性多糖留存在母液中而分離.若再利用硼酸絡合物.中性多糖亦可沉澱,或在高pH的條件下,增加中性醇羥基的解離度而使之沉澱。
方法六：制各性區域電泳
分子大小、形狀及所負電荷不同的多糖其在電場的作用下遷移速率是不同的,故可用電泳的方法將不同的多糖分開,電泳常用的載體是玻璃粉.具體的操作是用水將玻璃粉拌成膠狀、裝柱,用電泳緩沖液(如0．05mol／L硼砂水溶液,pH9．3)平衡3天,將多糖加於柱上端,接通電源,上端為正極(多糖的電泳方向是向負極的),下端為負極,其單位厘米的電壓為1．2-2V,電流30—35mA,電泳的時間為5 －12小時.電泳完畢後將玻璃粉載體推出柱外,分割後分別洗脫、檢測。該方法分離效果較好,但只適合於實驗室小規模使用,且電泳柱中必須有冷卻夾層。
方法七：金屬離子沉澱法
銅鹽沉澱多糖,可用CuCl2,CuSO4,Cu(OAc)：的溶液或是Fehling試劑、乙二胺銅試劑。通常需加過量的試劑用於沉澱,但Fehling試劑不可太多過量,因其有使多糖銅復合物沉澱重新溶解的危險.沉澱分解恢復可用酸的醇溶液或用螯合試劑.常用的銅鹽分級沉澱法是Fehling試劑法和醋酸銅乙醇法。飽和Ba(OH)：溶液可使樹膠類多糖沉澱,特別容易使B(1,4)一D一甘露聚糖沉澱而和木聚糖分離。另據報道,國外多採用LKB柱色譜,用比旋光度、示差折射及紫外檢測多糖,各組分的峰位自動記錄,分離效果高且方便。

5. 膜分離技術可以完成糖類物質分離嗎

到現在為止膜分離技術暫時不可以完成糖類物質分離。

可以完成糖類物質分離的方法： 分步沉澱法、柱層析法、陰離子交換法、凝膠色譜法、大孔樹脂柱色譜、超濾法

先將糖類物質提取出來

• 分步沉澱法

多糖的結構和分子量不同，其極性大小不同，在有機溶劑（如醇或酮）中的溶解度不同，根據這一原理，可以依次增加醇濃度，從而將多糖按分子量從大到小的沉澱出來。仍需要藉助柱層析法等進一步純化，方可得到均一性的多糖。

• 柱層析法

要獲得均一性的多糖，一般是先經過陰離子交換柱進行粗步純化，然後再用凝膠柱進一步純化。有些多糖也採用大孔樹脂柱進行純化。下面對這三種柱層析法進行詳細介紹。

• 陰離子交換法

一般使用陰離子交換柱對真菌、藻類和高等植物的多糖進行初步分離。陰離子交換色譜常用的介質有DEAE-纖維素、DEAE-瓊脂糖凝膠、DEAE-葡萄糖凝膠。

• 凝膠色譜法

凝膠色譜法根據被分離組分尺寸大小與凝膠的孔徑關系實現分離，類似於分子篩的作用。常用的凝膠有葡聚糖凝膠（SephadexG）、Sephadex LH-20、聚丙烯酸凝膠Toyopearl HW等。多糖的進一步分離往往會選擇用各種凝膠進行分離純化。

• 大孔樹脂柱色譜

大孔樹脂柱色譜是利用大孔樹脂的選擇性吸附作用和分子篩作用分離純化多糖。比如用AB-8大孔樹脂從青錢柳葉中分離純化出均一性多糖。

• 超濾法

超濾是以壓力為推動力的膜分離技術，應用膜分離原理將小分子溶質和溶劑除去而留下大分子溶質，從而使大分子物質得到純化。

6. 多糖常用分級沉澱法提取,再用色譜法分離對嗎

生物活性多糖主要有真菌多糖、植物多坦李糖、動物多糖3 大類。多糖的提取首先要根據多糖的存在形式及提取部位,決定在提取之前就是否做預處理。動物多糖與微生物多糖多有脂質包圍,一般需要先加入丙酮、乙醚、乙醇或乙醇乙醚的混合液進行迴流脫脂,釋放多糖。植物多糖提取時需注意一些含脂較高的根、莖、葉、花、果及種子類,在提取前,應先用低極性的有機溶劑對原料進行脫脂預處理,目前多糖的提取方法主要有溶劑提取法、生物提取法、強化提取法等。

1.1溶劑法

1.1.1水提醇沉法

水提醇沉法就是提取多糖最常用的一種方法。多糖就是極性大分子化合物,提取時應選擇

水、醇等極性強的溶劑。用水作溶劑來提取多糖時,可以用熱水浸煮提取,也可以用冷水浸提滲濾,然後將提取液濃縮後,在濃縮液中加乙醇,使其最終體積分數達到70 %左右,利用多糖不溶於乙醇的性質,使多糖從提取液中沉澱出來,室溫靜置 5 h,多糖的質量分數與得率均較高。影響多糖提取率的因素有:水的用量、提取溫度、浸提固液比、提取時間以及提取次數等。

水提醇沉法提取多糖不需特殊設備,生產工藝成本低,安全,適合工業化大生產,就是一種可取的提取方法。但由於水的極性大,容易把蛋白質、苷類等水溶性的成分浸提出來,從而使提取液存放時腐敗變質,為後續的分離帶來困難,且該法提取比較耗時,提取率也不高。

1.1.2酸提法

為了提高多糖的提取率,在水提醇沉法的基礎上發展了酸提取法。如某些含葡萄糖醛酸等酸性基團的多糖在較低pH 值下難以溶解,可用乙酸或鹽酸使提取液成酸性,再加乙醇使多糖沉澱析出,也可加入銅鹽等生成不溶性絡合物或鹽類沉澱而析出。

由於H＋的存在抑制了酸性雜質的溶出,稀酸提取法提取得到的多糖產品純度相對較高,但在酸性條件下可能引起多糖中糖苷鍵的斷裂,且酸會對容器造成腐蝕,除弱酸外,一般不宜採用。因此酸提法也存在一定的不足之處。

1.1.3鹼提法

多糖在鹼性溶液中穩定, 鹼有利於酸性多糖的浸出,可提高多糖的收率,縮短提取時間,但提取液中含有其它雜質,使粘度過大,過濾困難,且浸提液有較濃的鹼味,溶液顏色呈黃色,這樣會影響成品的風味與色澤。

1.1.4超臨界流體萃取法

超臨界流體萃取技術就是近年來發展起來的一種新的提取分離技術。超臨界流

體就是指物質處於臨界仿信轎溫度與臨界壓力以上時的狀態,這種流體兼有液體與氣體的特點,密度大,粘備肆稠度小,有極高的溶解,滲透到提取材料的基質中,發揮非常有效的萃取功能。而且這種溶解能力隨著壓力的升高而增大,提取結束後,再通過減壓將其釋放出來,具有保持有效成分的活性與無溶劑殘留等優點。由於CO2的超臨界條件(TC＝304.6 ℃,Tp＝7.38 MPa)容易達到,常用於超臨界萃取的溶劑,在壓力為8～40 MPa 時的超臨界CO2足以溶解任何非極性、中極性化合物,在加入改性劑後則可溶解極性化物。

該法的缺點就是設備復雜,運行成本高,提取范圍有限。

7. 某中葯中含三萜皂苷，游離三萜，黃酮，黃酮醇，多糖成分，設計合理提取分離實驗

皂苷部分極性較大，首先應該附集皂苷部位，通常可用正丁醇萃取或是大孔樹脂得到總皂苷部位。對於具體皂苷的分離，若使用硅膠柱層析，一般以氯仿：甲醇：水進行洗脫，氯仿：甲醇：水一般為9：1：0.1，8：2：0.3，7：3：0.5。黃酮類化合物在硅膠上的吸附較多，可以採取減壓硅膠柱或者中壓硅膠柱，上樣量稍大搜液桐一些（這樣世坦可以減小吸附量），將樣品分段，然後採用sephadex LH－20進行細分。多糖提取方法既有熱水浸提法、酸埋粗鹼浸提法、酶解提取法、微波輔助提取法、超聲輔助提取法和超高壓提取法等單一方法,也有超聲微波輔助法、微波輔助酶法、超聲波輔助酶法等聯用方法。多糖分離純化過程一般是先除雜,再對多糖組分進行分級純化。分級純化的常用方法有沉澱法、凝膠色譜法、陰離子交換色譜法、大孔樹脂柱色譜法、超濾法等。

8. 多糖的紫外光譜怎麼看

經過分級純化的多糖在測定結構前須檢查其純度及測定分子量。
檢查純度最常用的判斷方法：
（1）用gc、hpLc測純吵做定組成多糖的單糖的摩爾比是否恆定。
用不同的柱型測定結果更為可靠。
（2）電泳只出現一條帶。
如可用聚丙烯醯胺凝膠電泳、乙酸纖維素薄膜電泳及玻璃纖維紙電泳。對於碰頃中性多糖可採用高壓電泳，以硼酸鹽為緩沖液，可增大其遷移速度。
（3）凝膠柱層析圖呈現對稱的單峰。若有「拖尾」現象，說明其均一性不夠好。陰離子交換層析純化
用DeAe一纖維素52(2.6x100cm)柱層析,0.lmol/Lnacl洗脫,流速6ml/h,按2ml一管分部收集,苯酚一硫酸法逐管檢測,繪制收集體積與糖含量之間的關系曲線。看是否有單一對稱峰。
按照Ye等報道,採用DeAe一52一纖維素交換柱層析法(2.6x30cm)對鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖進行初步分離。DeAe一纖維素凝膠預處理:稱取DeAe一52一纖維素凝膠乾粉,加入約10倍體積質量比(ml/g)的0.5mol/Lna0h溶液浸泡30分鍾,倒出上清液,用大量去離子水反復浸洗至ph值近中性;再用相同體積的0.5mol/LhcI溶液浸泡30分鍾,倒出上清液,用大量去離子水反復浸洗至ph值近中性;最後用相同體積的0.5mol/lnaoh溶液再浸泡30分鍾,用大量去離子水反復浸洗至ph值中性。處理完畢後,進行濕法裝柱,用去離子水0.5mol/Lnacl溶液,去離子水依次分別平衡(流速1.0ml/min)2一3個柱體積備用.
糖樣100mg溶於5ml的去離子水中,離心除去不溶物,上樣於DeAe一52一纖維素陰離子
-1層析柱(2.6x30cm,cl型),分別採用去離子水0.1和0.3mol/LnacI溶液進行分段梯度洗脫,
流速1.0ml/min,自動收集器分部收集(10ml/管),每梯度20管。用硫酸一苯酚法跟蹤檢測各管多糖含量(490nm處吸收值),以收集的管數為橫坐標。吸光值(490nm)為縱坐標繪制DeAe一52一纖維素色譜柱洗脫曲線。依據洗脫峰型,合並相同組分,50℃旋轉蒸發濃縮,對去離子水透析48h以去除nacI及小分子雜質,最後將透析內液冷凍乾燥,得初步純化產品。
初步純化多糖得率計算公式:
多糖得率(%)=純化多糖質量/粗多糖質量x100%
葡聚糖凝膠層析純化
採用sephadexg-100凝膠層析法對DeAe-52一纖維素初步純化的不同組分的多糖樣品進一步純化。葡聚糖凝膠(sephadexg一100)的預處理:稱取sephadexg一100凝膠乾粉,加入30倍體積質量比(ml/g)的去離子水,沸水浴5小時使其溶脹。冷卻後用去離子水反復浸洗,減壓脫氣後進行濕法裝柱,用0.1mna2so4;溶液平衡(流速0.25ml/min)2一3個柱體積備用。
分別稱取經DeAe一纖維素一52初步純化的各多糖組分樣品20mg,溶於2ml0.1mna2so4溶液中,上樣於sephadexg一100層析柱(2.6x60cm)用0.1mna2so4溶液溶液洗脫,流速0.25ml/min,分步收集(5ml/管)。
用硫酸一苯酚法跟蹤檢測各管多糖含量(490nm處吸收值),以收集的管數為橫坐標。吸光值(490nm)為縱坐標繪制sephadexg一100色譜柱洗脫做衡曲線。依據洗脫峰型,合並相同組分,50℃旋轉蒸發濃縮,對去離子水透析48h以去除na2so4;及小分子雜質,最後將透析內液冷凍乾燥,得不同純化產品。
純化多糖得率計算公式:
純化多糖得率(%)=純化多糖質量/粗多糖質量x100%
（鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖）
（4）紙層析法呈單一集中斑點。
取0.5%的多糖樣品溶液50ul,點樣於新華中速濾紙(3cmx20cm)距端點1cm處的中部,以正丁醇:濃氨水:水(4o:50:5)為展開劑,飽和2小時以上,在室溫下展開6h,取出吹乾,用0.5%甲苯胺藍液染色,立即用95%乙醇漂洗至背景褪色,看是否只有一個清晰的斑點。
（5）瓊脂糖(Agarose)凝膠電泳法
在瓊脂糖板(厚度為0.2cm)上點樣3一5ul採用濃度為0.075mol/L,ph8.6的巴比妥緩沖液,電泳1-1.5h,電壓為64一80V,甲苯胺藍(濃度為1%)染色,醋酸乙醇混合溶液(醋酸:乙醇:水=0.1:5:5)脫色。多糖純品經電泳展開後,看是否呈現單一斑點,斑點是否清晰。
（6）紫外分光光度法
將多糖pwZ加0.9%nacI溶液溶解,配成濃度為1mg/ml的溶液,採用uV一16oA紫外可見光譜儀掃描(200nm一30onm)觀察260nm、280nm處是否有吸收峰。
多糖的分子量測定：
過去用超速離心沉降法、光散射法、滲透壓法、粘度法(:多糖質譜鑒定)等，這些方法操作復雜且誤差較大，現已少用。現在較常用的方法有凝膠過濾法和高效凝膠液相色譜法，這兩種方法須先用已知分子量的標准多糖對照測定樣品的分子量。
一般來說，多糖結構分析包括以下幾點：
（1）單糖組成分析：研究確定單糖的種類及摩爾比；
完全酸水解後用高效液相色譜方法(hpLc)或氣相色譜方法測定。
（2）糖苷鍵類型：研究確定糖苷鍵及支鏈點連接位置；
甲基化分析方法
高碘酸氧化法與smith降解法
（3）糖環大小：研究確定糖苷鍵為呋喃糖或吡喃糖；
紅外光譜
（4）異頭碳構型：研究確定糖苷殘基的a-或p-構型；
2DnmR.()光譜分析方法測
（5）確定單糖殘基和重復單元的序列
甲基化分析方法與磁共振光譜分析方法結合分析，一般會參考多糖的單糖組成及摩爾比信息以利於解析多糖結構。
高碘酸氧化法
薄層層析(TLc)——定性，
氣相色譜法
（6）取代基團位點：研究0h-修飾基團的種類和取代位點，如0-磷酸化，乙丑基取代，0-
硫酷化等；
比色分析方法
（7）多糖分子量分布的研究。
紫外光譜
定性與定量方法
薄層層析：殘基定性
氣相色譜：殘基定量
氣質聯用：殘基定量
高效陰離子色譜法：殘基定量
鑒定結構常用物理化學方法：
高效液相色譜:確定單糖組分和相對分子量
紅外光譜分析:測定多糖的官能團，不僅可以檢測酮糖、酵糖的恥喃糖環或呋喃糖環的構象和糖苷鍵的構型
核磁共振:α-構型與β-構型殘基的比例；判斷異頭碳構型；推斷主鏈和支鏈連接鍵型鑒定結構復合方法：
甲基化分析:推斷出多糖樣品中糖基的連接方式及各種連接鍵型的比例
高碘酸氧化法與smith降解法:判斷糖苷鍵的位置、直鏈多糖的聚合度及支鏈多糖的分支數目
糖睛乙酸酷衍生物的氣相色譜法:單糖組成和摩爾比
各種多糖化學結構鑒定方法的具體實施方案
1、酸水解
（1）完全酸水解
-1稱取20mg樣品,加入2mL2mol·L的h2so4於安培管中沸水浴水解8h,水解液用
baco3中和至ph=7,離心,取上清夜置冰箱冷藏備測。（阿魏側耳子實體多糖分離純化及其化學結構的初步研究）
（2）部分酸水解
稱取糖樣70mg，80℃條件下，0.05m三氟乙酸水解2h。降至室溫後，離心（4000r/min，10min），將沉澱乾燥，留做gc分析。上清用無水乙醇除酸至中性(ph為6～7)，蒸餾水透析48h：將袋外透析液濃縮，真空乾燥，留做gc分析；袋內液濃縮至5ml左右，加10倍體積無水乙醇，醇沉過夜，離心(4000r/min，10min)，沉澱常規乾燥，作gc分析；上清濃縮，真空乾燥，留做gc分析。
2、高效液相色譜
確定樣品的單糖組成
色譜條件為:
色譜柱為shodexKs804sugar(300mm×7.8mm)
柱溫40度
流動相為水
-1流速0.8mL·min
檢測用410RⅠ示差檢測器，數據處理用810gpc軟體進行。
同時用鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、木糖、果糖、葡萄糖、岩藻糖8種單糖進
行對照,根據峰值確定樣品的單糖組成。
分子量的測定以標準分子量的葡聚糖pulluan作分子量測定標准。讓其通過高壓液相色譜柱,條件同上,先以分子量對數與對應的保留時間作標准曲線,從標准葡聚糖pulluan的工作曲線上可以求得該成分分子量。
例如：（阿魏側耳子實體多糖分離純化及其化學結構的初步研究）
將水解後的多糖樣品pw2進行hpLc分析,結果如表所示:阿魏側耳子實體多糖pw2經過酸水解後,得到2種單糖:葡萄糖和半乳糖,摩爾比例1.77∶1。
例如：
4經hpLc測定後對照標准曲線得多糖pw2的分子量為3.18×10。（阿魏側耳子實體多糖
分離純化及其化學結構的初步研究）
4、甲基化分析
(1)基本原理
先將多糖中各種單糖殘基中的游離羥基全部甲基化，然後將多糖中的糖苷鍵進行完全酸水解，水解後得到的化合物，其羥基所在的位置，即為原來單糖殘基的連接點。同時根據不同甲基化單糖的比例，可以推測出此種連接鍵型在多糖重復結構中所佔的比例。
用此種方法得到的羥基及nabh4還原醛基後產生的羥基，經乙醯化可得到甲基化的糖醇乙酸酯(此產物易揮發，可進行gc分析)，再經gc與gc-ms分析，通過氣相色譜的出峰順序和對質譜譜圖的主要離子碎片的分析便可以較准確地確定糖的連接鍵型。
反應通式如下
:
（2)甲基化反應
取充分乾燥的多糖樣品10mg，溶解在2.0ml的二甲基亞礬（Dmso)中。在n2保護下快速加入乾燥的naoh粉50mg，用n2排出空氣，加蓋密封，室溫反應1.0h並間歇振盪。在n2保護下緩慢滴加碘甲烷1.0ml，用n2排出空氣，加蓋密封，室溫繼續反應1.0h並間歇振盪，反應完成後加0.5ml水終止反應。反應液先用自來水流水透析48h，再用蒸餾水透析24h，透析液冷凍乾燥得第一次甲基化樣品。第一次甲基化樣品繼續甲基化，反應步驟同上，得第二次甲基化樣品。如此重復甲基化三次。甲基化後的樣品用紅外光譜檢測，3700
cm-1—3100cm-1，附近無羥基的特徵吸收峰，表明甲基化反應完全。
（3)甲基化樣品的衍生化
上述完全甲基化多糖樣品加入2mol/1的三氟乙酸(TFA)3.0ml,120℃密閉水解2.0h。冷卻後50℃減壓蒸發干，加2.0ml甲醇再蒸發干，重復三次，最後蒸發幹得完全甲基化多糖的水解產物。加蒸餾水2.0ml使其溶解，再加硼氫化鈉25mg，振盪後室溫還原反應2.0h。反應完後滴加0.1mol/1醋酸分解過量的硼氫化鈉並調ph值至5.5~7.0弱酸性。反應液50℃減壓蒸發蒸干，加2.0ml甲醇再蒸干，重復三次，最後蒸發干。
上述蒸發干樣品加入1.0ml醋酸酐和1.0ml吡啶，封管後在沸水浴中反應1.0h。反應液50℃減壓蒸發干，加2.0ml甲醇再蒸發干，重復三次，最後蒸發干。加入丙酮1.0ml，用0.45ul尼龍微孔濾膜過濾，取樣進行gc/ms分析。
(4)衍生化樣品的gc/ms分析
多糖樣品經甲基化、水解、還原、乙醯化後得到甲基化糖醇乙酸酯，進行gc/ms聯機分析，根據文獻的相對保留時間和不同單糖的主要離子碎片(m/e），推斷出多糖樣品中糖基的連接方式及各種連接鍵型的比例。
本實驗採用的條件為:gc(Variancp3800型)和ms（Variansatum2200型)氣相一質譜聯用儀，Db-5ms石英毛細管柱(30mx0.25mmx0.25um);程序升溫，初溫80℃，保持1min，以8℃/min升至210℃，保持1min，再以20℃/min升至260℃,保持1min;氦氣作載氣，進樣口溫度250℃，分流比1:50，柱流速1.0ml/min;電子電離源(eI源)70eV，倍增器電壓350V，燈絲電流250uA，介面溫度260℃,離子源溫度180℃，質荷比(m/z)掃描范圍30~450，掃描速率2.5scan/sec。（胞式層孔菌菌絲體多糖分離純化、結構鑒定及其生物活性研究）
流程圖如下：（mAep-2a-2b是安絡小皮傘菌絲體多糖的某個過程中第某個樣品）
篇二：1多糖含量檢測
億信檢測推出單糖組成方案
簡介：gc-ms（氣相質譜聯用技術測定單糖組成）
1多糖含量檢測
方法：苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，並迅速脫水生

9. 多糖提取純化過程中的注意事項

多糖純化：
a、分部沉澱法：根據各種多糖在不同濃度的低級醇或丙酮中具有不同溶解度的性質，逐次按比例由小到大加入甲醇或乙醇或丙酮，收集不同濃度下析出的沉澱，經反復溶解與沉澱後，直到測得的物理常數恆定（最常用的是比旋光度測定或電泳檢查）。這種方法適合於分離各種溶解度相差較大的多糖。為了多糖的穩定，常在pH7進行，唯酸性多糖在pH7時－COOH是以－COO` 離子形式存在的，需在pH2－4進行分離，為了防止者基畢苷鍵水解，操作宜迅速。此外也可將多糖製成各種衍生物如甲醚化物、乙醯化物等，然後將多糖衍生物溶於醇中，最後加入乙醚等極性更小的溶劑進行分級沉澱分離。
b、鹽析法：在天然產物的水提液中，加入無機鹽，使其達到一定濃度或飽和，促使有效成分在水中溶解度降低沉澱析出，與其它水溶性較大的雜質分離。常做鹽析的無機鹽的有氯化鈉、硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸銨等。
c、季銨鹽沉澱法：季銨鹽及其氫氧化物是一類乳化劑，可與酸性糖形成不溶性沉澱，常用於酸性多糖的分首芹離。通常季胺鹽及其氫氧化物並不與中性多糖產生沉澱，但當溶液的PH增高或加入硼砂緩沖液使糖的酸度增高時，也會與中性多糖形成沉澱。常用的季銨鹽有十六烷基三甲胺的溴化物（CTAB）及其氫氧化物（cetyl trimethyl ammonium hydroxide，CTA－OH）和十六烷基吡啶（cetylpyridinm hydroride，CP－OH）。CTAB或CP－OH的濃度一般為1％－10％（W/V）的多糖溶液中，酸性多糖可從中性多糖中沉澱出來，所以控制季銨鹽的濃度也能分離各種不同的酸性多糖。值得注意的是酸性多糖混合物溶液的PH要小於9，而且不能有硼砂存在，否則中性多糖將會被沉澱出來
d、柱層析：
纖維素柱層析：纖維素柱層析鋒棚對多糖的分離既有吸附色譜的性質，又具有分配色譜的性質，所用的洗脫劑是水和不同濃度乙醇的水溶液，流出柱的先後順序通常是水溶性大的先出柱，水溶性差的最後出柱，與分級沉澱法正好相反。
纖維素陰離子交換柱層析：最常見的交換劑為DEAE－纖維素（硼酸型或鹼型），洗脫劑可用不同濃度的鹼溶液、硼砂溶液、鹽溶液等。此方法目前最為常用。它一方面可純化多糖，另一方面還適於分離各種酸性多糖、中性多糖和粘多糖。
凝膠柱層析：凝膠柱層析可將多糖按分子大小和形狀不同分離開來，常用的凝膠有葡聚糖凝膠（sephadex G）、瓊脂糖凝膠（sepharose bio－gel A）、聚丙烯醯胺凝膠（bio－gel P）等，常用的洗脫劑是各種濃度的鹽溶液及緩沖液，但它們的離子強度最好不低於0.02。出柱的順序是大分子的先出柱，小分子的後出柱。由於糖分子與凝膠間的相互作用，洗脫液的體積與蛋白質的分離有很大的差別。在多糖分離時，通常是用孔隙小的凝膠如sephadex G－25、G－50等先脫去多糖中的無機鹽及小分子化合物，然後再用孔隙大的凝膠sephadex G－200等進行分離。凝膠柱層析法不適合於粘多糖的分離。

10. 植物多糖一般都是什麼顏色的

一、植物多糖的提取

1 溶劑提取法

1．1 水提法

水對植物組織的穿透力強，提取效率高，在生產上使用安全、經濟。用水作溶劑來提取多糖時，可以用熱水浸煮提取，也可以用冷水浸提。一般植物多糖提取採用熱水浸提法，該法所得多糖提取液可直接或離心除去小溶物；或者利用多糖不溶於高濃度乙醇的性質，沉澱提純多糖；但由於不同性質或不同相對分子質量的多糖沉澱所需乙醇濃度不同，它也可以用於樣品中不同多糖組分的分級分離；還可按多糖不同性質在粗分階段利用混合溶劑提取法對植物中不同的多糖進行分離；其中，以乙醇沉澱最為普遍。但以根莖為主的植物體,細胞壁多糖含量高,熱水直接提取率不高。此時為破壞細胞壁,增加多糖的溶出，有兩種處理方法:一為酶解,二為弱鹼溶解。

1．2酸鹼提法

有些多糖適合用稀酸提取，並且能得到更高的提取率。但酸提法只在一些特定的植物多糖提取中佔有優勢，目前報道的並不多。而且即使有優勢，在操作上還應嚴格控制酸度，因為酸性條件下可能引起多糖中糖苷鍵的斷裂。

有些多糖在鹼液中有更高的提取率，尤其是提取含有糖醛酸的多糖及酸性多糖。採用的稀鹼多位為0．1mol／L氫氧化鈉、氫氧化鉀，為防止多糖降解，常通以氮氣或加入硼氫化鈉或硼氫化鉀。同樣，鹼提優勢也是因多糖類的不同而異。與酸提類似，鹼提中鹼的濃度也應得到有效控制，因為有些多糖在鹼性較強時會水解。另外，稀酸、稀鹼提取液應迅速中和或迅速透析，濃縮與醇析而獲得多糖沉澱。

1．4 生物酶提取法

酶技術是近年來廣泛應用到有效成份提取中的一項生物技術，在多糖的提取過程中，使用酶可降低提取條件，在比較溫和的條件中分解植物組織，加速多糖的釋放或提取。此外，使用酶還可分解提取液中澱粉、果膠、蛋白質等的產物，常用的酶有蛋白酶，纖維素酶，果膠酶等。

1．5 超聲提取法

超聲波是一種高頻率的機械波，其主要原理是利用超聲波產生的「空化作用」對細胞膜的破壞，有利用植物有效成分的釋放，而且超聲波能形成強大的沖擊波或高速射流，有效地減小、消除與水相之間的阻滯層，加大了傳質效率，有助於溶質的擴散。另外，超聲波的熱效應使水溫基本在57℃，對原料有水浴作用。超聲波提取與傳統的提取消鋒方法相比，有提取效率高、時間短、耗能低等優點。超聲提取的影響因素有：超聲時間、超聲頻率（一般低頻中提取效率高，但也有例外）、料液比和溫度等。

1．6 微波提取

微波是頻率介於300MHz和300GHz之間的非電離電磁波，微波提取的原理是微射線輻射於溶劑並透過細胞壁到達細胞內部，由於溶劑及細胞液吸收微波能 細胞內部溫度升高，壓力增大，當壓力超過細胞壁的承受能力時，細胞壁破裂，位於細胞內部的有效成份從細胞中釋放出來，傳遞轉移到溶劑周圍被溶劑溶解。微波技術應用於植物細胞破壁，有效地提高了收率。具有穿透力強、選擇性高、加熱效率高等特點。影響微波浸提的主要因素為浸提時間、樣品和提取溶劑的含水量，溶劑的介電常數和電導率（介電常數和電導率的溶劑對微波的吸收較好）、微波功率等。但是由於微波泄漏對操作兄橋液者影響很大，因而對設備的要求較高，這對微波的研究及應用帶來了一定的困難。

二、植物多糖的分離純化

在多糖提取物中，常會有無機鹽、蛋白質、色素及小分子物質等雜質，必須分別除去．一般是先脫除非多糖組分，再對多糖組分進行分級．

2．1 除蛋白

除蛋白質時一般選擇能使蛋白質沉澱而不使多糖沉澱的試劑來處理，如酚、三氯乙酸、鞣酸等。但必須處理時間短，溫度低，避免多糖降解。Sevage法（氯仿：戊醇/丁醇=4：1）和三氟三氯乙烷法在避免降解上有較好效果但要達到除盡游離蛋白質的目的仍需反復處理。如能加入蛋白質水解酶，使羨物蛋白質大分子進行一定程度的降解，再用Sevage法處理，一般效果更好。

為了避免使用有機溶劑也可採用反復凍融的方法除蛋白，將多糖液濃縮後，一20℃室溫反復凍融7～8次，離心除去蛋白質。另外，蛋白質在等電點時溶解度最小，用氫氧化鈣飽和液調pH10～pH11可除去偏鹼性的蛋白質，然後再用硫酸調pH5～pH6，可除去偏酸性的蛋白質。凍融和等電點沉澱除蛋白質操作簡單，但多糖液里往往有低濃度的蛋白質殘留，應與其它方法結合使用。

2．2 脫色

植物多糖提取物中含有酚類化合物而使其顏色較深，可用吸附劑(纖維素、硅藻土、活性炭等)、離子交換柱(DEAE一纖維素)、氧化劑(H2O2)等脫除。活性炭比表面積大，吸附能力強，在進行當歸多糖的提取時只向多糖液中加入了0．1％左右的活性炭，煮沸後濾過即完成了脫色操作。此法成本低廉，適合工業化生產。

2．3 除小分子雜質

小分子雜質如低聚寡糖的殘留往往影響多糖的生物活性，需要進一步脫除，提高純度。傳統的方法是透析法，該法操作簡單、技術成熟，但周期長，往往需要2一3天，常溫下操作有可能造成多糖的霉變，必要時需加入少量防腐劑或需在低溫條件下進行。隨著膜分離技術的發展，纖維濾器透析法已經發展起來了，它利用不同孔徑的膜使大小不同的分子分級，這種方式可縮短生產周期，而且條件溫和，無疑是多糖脫除雜質的一條新途徑。

2．4 多糖的分級純化

採用一般方法提取的多糖通常是多糖的混合物，分級的方法可達到純化的目的．可按溶解性不同進行分級、按分子大小和形狀分級(如分級沉澱、超濾、分子篩、層析等)，也可按分子所帶基團的性質分級．

2．4．1按溶解性不同分離

2.4.1.1分步沉澱法

分步沉澱法是根據不同多糖在不同濃度低級醇、酮中具有不同溶解度的性質，從小到大按比例加入甲醇或乙醇或丙酮進行分步沉澱．

2.4.1.2 鹽析法

鹽析法是根據不同多糖在不同鹽濃度中溶解度不同而將其分離的一種方法。常用的鹽析劑有氯化鈉、氯化鉀、硫酸銨等，其中以硫酸銨最佳。

2.4.2 按電離性質不同分離

2.4.2.1季胺鹽沉澱法

季胺氫氧化物是一類乳化劑，能與酸性多糖形成不溶性化合物季銨絡合物，此絡合物在低離子強度的水溶液中不溶解而產生沉澱。若提高多糖液pH值或加入硼砂緩沖液，也可使中性多糖沉澱分離。常用季銨鹽有十六烷基三甲基季銨鹽的溴化物及其氫氧化物和十六烷基吡啶。

2．4．3 柱層析法

2.4.3.1凝膠柱層析法

凝膠柱層析法常用的凝膠有葡聚糖凝膠(Sephadex)和瓊脂糖凝膠(Sepharose)，以不同濃度的鹽溶液和緩沖溶液作為洗脫劑，從而使不同大小的多糖分子得到分離純化，但不適宜粘多糖的分離。

2.4.3.2纖維素陰離子交換劑柱層析法

纖維素陰離子交換劑柱層析法常用的交換劑為DEAE一纖維素和ECTEOLA一纖維素，分類硼砂型和鹼型兩種，洗脫劑可用不同濃度鹼溶液、硼砂溶液、鹽溶液，其優點可吸附雜質、純化多糖，並適用於分離各種酸性、中性多糖和粘多糖。如百合多糖、北沙參多糖、太子參多糖等。

2.4.3.3 活性炭柱層析法

活性炭吸附量大、效率高，是分離水溶性物質的常用吸附劑。柱層析時活性炭中常拌入等量的硅藻土作稀釋劑，以增加溶液的流速。糖溶液上柱後先用水洗脫無機鹽、單糖等再依次增加乙醇濃度進行洗脫。

2.4.3.4 離子交換柱層析和普通凝膠柱層析聯用法

有些植物的多糖成分復雜， 除中性多糖外，還含有糖醛酸等，因此往往兩種不同性質的色譜柱聯用才能得到單一多糖組分。

2.4.3.5 三種層析柱聯用

採用離子交換葡聚糖凝膠柱、丙烯葡聚糖凝膠柱和葡聚糖凝膠柱三者聯用，即先進行DEAE—SephadexA柱層析，用蒸餾水洗脫。水洗組分進一步用SephacrylS柱層析，得到主要組分再用SephadexG一100柱層析，有時會有較高的得率。

三、多糖的純度鑒定

經過分級純化的多糖在測定結構前須進行純度鑒定．而且多糖的純度不能用通常化合物的純度標准來衡量，因為即便是多糖純品，其微觀也並不均一，僅代表相似鏈長的多糖分子的平均分布，通常所謂的多糖純品也只是一定相對分子質量范圍的多糖的均一組分．目前常用於多糖純度的鑒定方法有：高效液相、 凝膠層析法、電泳法、色譜法、旋光度法等．

四、常見問題

多糖制備過程中蛋白質的脫除是目前分離純化多糖的難點。Sevag法需要消耗大量的有機溶劑，且操作煩瑣；三氟三氯乙烷的沸點較低(bp56℃)易揮發，不宜大量應用；三氯乙酸可引起多糖的降解，從而影響其生理活性；酶價格昂貴，不適合工業化生產。可以借鑒其它蛋白質脫除的方法，例如用天然澄清劑能簡化提取工藝，提高多糖純度。 脫色也是多糖提取純化過程中面臨的一個難題。活性炭會吸附多糖而造成多糖的損失；H2O2氧化脫色容易引起有些多糖的降解。