去離子鉀醯胺的作用

A. DNA測序反應中Hi-Di甲醯胺起什麼作用

這么會有這么笨的答案？而居然其還被採納了？太不專業了。。。
甲醯胺是強變性劑，可以打回斷鹼基間的答氫鍵，阻止測序PCR產物形成2級結構。2級結構的形成將會通過產物的形態，來改變其遷移速度，使最終的結果出現誤差。

B. 去離子甲醯胺的一些嘗試性問題！！

甲醯胺不穩定，是因為受熱分解為氨和和一氧化碳！事實上甲酸，甲酸鹽，甲（酸專）醯胺都不穩定屬，受熱脫水生成CO。我想去離子甲醯胺並不是脫水形成的，因為脫水後就完全分解了！況且甲醯胺就這一種脫水分解的途徑！去離子甲醯胺其實就是很純的甲醯胺HCONH2！你可以看看這個http://www.biocity.biz/Catalog/Reagent/Sigma/200511/425.html

C. 電泳緩沖液加到什麼位置

電泳緩沖液加到一樣的位置。

電泳緩沖液的主要作用是使膠的導電性和體系的一致，這樣跑出的條帶才會一致；加樣緩沖液的主要作用是使PCR產物與其混合，使DNA沉於加樣孔的底部，防止DNA跑出來。

許多批號的試劑級甲醯胺，其純度符合使用要求，無須再進行處理。不過，一旦略呈黃色，則應用在磁力攪拌器上將甲醯胺與Dowex XG8混合床樹脂共同攪拌1小時進行去離子處理，並用Whatman 1號濾紙過濾2次，去離子甲醯胺分裝成小份，充氮存於-70℃。

作用

緩沖液在電泳過程中的一個作用是維持合適的pH。電泳時陽極與陰極都會發生電解反應，陽極發生的是氧化反應（4OH--4e->2H2O+O2)，陰極發生的是還原反應（4H++4e->2H2)，長時間的電泳將使陽極變酸，陰極變鹼。

電泳緩沖液的另一個作用是使溶液具有一定的導電性，以利於DNA分子的遷移，例如，一般電泳緩沖液中應含有0.01-0.04mol/L的Na+離子，Na+離子的濃度太低時電泳速度變慢；太高時就會造成過大的電流使膠發熱甚至熔化。

D. 甲醯胺使DNA變性的原理是什麼

變性原理：尿素及復甲醯胺：它制們可與鹼基間形成氫鍵
加熱：高溫（70℃以上）可破壞鹼基間的氫鍵。

離子強度：提高溶液的離子強度，可中和DNA分子鏈上磷酸基團的負電荷，降低它們之間的排斥力，穩定DNA的結構。

極端的pH值：pH＜1時，DNA的磷酸二酯鍵會被水解；pH＞11.3時，DNA的所有氫鍵斷裂。

疏水作用：甲醇可增加鹼基的溶解度，三氟醋酸鈉可降低DNA分子的疏水作用，破壞雙螺旋結構引起變性。

尿素及甲醯胺：它們可與鹼基間形成氫鍵。

鹼基堆積：氫鍵和鹼基堆積是一致的，鹼基堆積是一種協同作用，處於中間的鹼基比兩邊的鹼基穩定.

E. 去離子甲醯胺和二甲基甲醯胺

只能用98%去離子甲醯胺

F. DNA和RNA提取原理是什麼還有相關試劑盒的原理，各步的作用~~

TRIzol試劑有多組分分離作用,與其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚／SDS法、鹽酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特點是可同時分離一個樣品的RNA\DNA\蛋白質．TRIzol使樣品勻漿化，細胞裂解，溶解細胞內含物，同時因含有RNase抑制劑可保持RNA的完整性。在加入氯仿離心後，溶液分為水相和有機相，RNA在水相中。取出水相用異丙醇沉澱可回收RNA；用乙醇沉澱中間層可回收DNA；用異丙醇沉澱有機相可回收蛋白質。
TRIzol試劑可用於小量樣品（50-100mg組織、5×106細胞）也適用於大量樣品（≥1g組織、>107細胞）。對人，動物，植物組織，細菌均適用，可同時處理大量不同樣品，整個提取過程在一小時內即可完成。分離的總RNA無蛋白質和DNA污染，可用於Northern Blot，dot blot，ployA篩選，體外翻譯，RNase保護分析和分子克隆。在用於RT-PCR時如果兩條引物存在於一個單一外顯子內，建議用無RNase的DNaseⅠ處理RNA樣品，避免出現假陽性。共純化的DNA可用作標准，比較不同樣品RNA的得率，也可用於PCR和酶切。蛋白質可用於Western Blotting。

預防RNase污染注意事項：
1． 經常更換新手套，皮膚上常帶有的細菌，黴菌可能成為RNase的來源。
2． 使用滅過菌的RNA專用塑料製品避免交*污染。
3． RNA在TRIzol試劑中時不會被RNase污染，但提取後繼續處理過程中應使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小時，塑料製品可在0.5M NaOH中浸泡10分鍾，然後用水徹底清洗，高壓滅菌，即可去除RNase。
4． 配製溶液應使用無RNase的水（將水加入處理過不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至終濃度0.01℅v/v,放置過夜,高壓滅菌。註：DEPC有致癌之嫌，需小心操作。）

RNA的提取
准備試劑：氯仿，異丙醇，75℅乙醇，無RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC處理過的水配製)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決於細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鍾，使核酸蛋白復合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可於2-8℃10000×g離心10分鍾，取上清。離心得到的沉澱中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，劇烈振盪15秒，室溫放置3分鍾。
6. 2-8℃10000×g離心15分鍾。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見後。用異丙醇沉澱水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鍾。
8. 2-8℃10000×g離心10分鍾，離心前看不出RNA沉澱，離心後在管側和管底出現膠狀沉澱。移去上清。
9. 用75℅乙醇洗滌RNA沉澱。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超過7500×g離心5分鍾，棄上清。
10.室溫放置乾燥或真空抽干RNA沉澱，大約晾5-10分鍾即可.不要真空離心乾燥，過於乾燥會導致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl無RNase的水或0.5℅SDS,用槍頭吸打幾次,55-60℃放置10分鍾使RNA溶解.如RNA用於酶切反應,勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去離子甲醯胺溶解，-70℃保存。
注意事項：
1.從少量樣品（1-10mg組織或102-104細胞）中提取RNA時可加入少許糖原以促進RNA沉澱。例如加800ml TRIzol勻漿樣品，沉澱RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原會與RNA一同沉澱出來，糖原濃度不高於4mg/ml是不影響第一鏈的合成，也不影響PCR反應。
2．勻漿後加氯仿之前樣品可以在-60至-70℃保存至少一個月。RNA沉澱可以保存於75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。
3．分層和RNA沉澱時也可使用台式離心機，2600×g離心30-60分鍾。
預期產量：1mg組織或1×106細胞提取RNA分別為：
肝和脾6-10μg ,腎3-4μg ,骨骼肌和腦組織1-1.5μg ,胎盤1-4μg ,上皮細胞8-15μg ,成纖維細胞5-7μg 。
常見問題分析：
得率低：A.樣品裂解或勻漿處理不徹底
B．RNA沉澱未完全溶解
A260/A280<1.65 ：A.檢測吸光度時，RNA樣品沒有溶於水，而溶於了TE中。低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高
B．樣品勻漿時加的試劑量太少
C．勻漿樣品時未在室溫放置5分鍾
D．吸取水相時混入了有機相
E．RNA沉澱未完全溶解。
RNA降解：A.組織取出後沒有馬上處理或冷凍
B.待提取RNA的樣品沒有保存於-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃
C.細胞在用胰酶處理時過度
D.溶液或離心管未經RNase去除處理
E.電泳時使用的甲醛pH值低於了3.5
DNA污染: A. 樣品勻漿時加的試劑量太少
B.樣品中含有有機溶劑(如乙醇,DMSO等),強緩沖液或鹼性溶液
蛋白聚糖和多糖污染: 沉澱RNA的過程中作以下改進可去除這些污染，步驟7中,每使用1ml TRIzol在水相中加0.25ml異丙醇和0.25ml高鹽溶液(0.8M檸檬酸鈉和1.2M NaCl)混合離心,按之前操作進行。這種方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉澱出純RNA。從含有大量多糖的植物中提取RNA時應在勻漿後離心，並加上以上操作步驟。

DNA的分離
准備試劑：乙醇 0.1M檸檬酸鈉(含10%乙醇) 75%乙醇 8mM NaOH
操作步驟:
1. 樣品加氯仿分層後,移去上層水相,用乙醇沉澱中間層和有機相中的DNA。每使用1ml TRIzol加0.3ml無水乙醇混勻，室溫放置3分鍾，2-8℃不超過2000×g離心5分鍾。
2. 移去上清，（如需分離蛋白質，可保留，進一步操作見後）用含10%乙醇的0.1M檸檬酸鈉洗滌DNA沉澱。每用1ml TRIzol加入1ml檸檬酸鈉，室溫放置30分鍾，2-8℃2000×g離心5分鍾，棄上清，重復一次。
3. 用75%乙醇再洗一遍DNA沉澱，每用1ml TRIzol加入1.5-2 ml 75%乙醇,室溫放置10-20分鍾(不時顛倒混合)2-8℃2000×g離心5分鍾, 棄上清。
4. 室溫放置晾乾DNA 5-15分鍾，用8mM NaOH溶解DNA。從50-70mg組織或107細胞中分離的DNA溶於300-600μl 8mM NaOH，DNA的濃度通常為0.2-0.3μg/μl 。提取的DNA沉澱不易溶於水和Tris緩沖液中，建議用弱鹼溶解，8mMNaOH的pH值為9，溶解DNA後可用TE，HEPES調節pH。從某些樣品（尤其是組織）中提取的DNA中可能包含一些膠狀不溶物可>12000×g離心10分鍾除去。
DNA的定量：取一份溶於8mM NaOH的DNA加水測A260值。一單位A260值相當於50μg/ml雙鏈DNA。根據DNA產量可估計細胞數，人，大鼠，小鼠1×106二倍體細胞含DNA的量分別為7.1μg , 6.5μg , 5.8μg 。
預期產量：1mg組織或1×106細胞提取DNA分別為肝和腎3-4μg 骨骼肌，腦組織，胎盤2-3μg 人，大鼠，小鼠培養細胞（1×106）5-7μg 成纖維細胞5-7μg
應用：1.用於PCR 溶於8mM NaOH的DNA用0.1M HEPES調pH至8.4,取0.1-1μg DNA用作模板。
2.酶切反應 用HEPES或1mM EDTA調節pH至適當值。每μg DNA使用3-5單位的酶，80-90%的DNA是可消化的。
1ml 8mM NaOH溶解的DNA樣品pH值調節
Final pH 0.1M HEPES(μl) Final pH 1M HEPES(μl)
8.4 86 7.2 23
8.2 93 7.0 32
8.0 101
7.8 117
7.5 159
注意事項：
1. DNA在中間層和有機相中時可在2-8℃保存過夜。
2．DNA沉澱在75%乙醇中2-8℃可保存幾個月。
3．DNA在8mM NaOH溶液中4℃可放置過夜，如長期保存需用HEPES調節pH至7-8並且加EDTA至1mM，可置於4℃或-20℃長期保存。

G. 熒光原位雜交會用到哪些試劑

一、 實驗材料、試劑、儀器耗材：

人的MyoD1（MYF3)基因探、人外周血中期染色體細胞標本

指甲油、甲醯胺、氯化鈉、檸檬酸鈉、氫氧化鈉、吐溫20等

恆溫水浴鍋、培養箱、染色缸、載玻片、Nikon E-400熒光顯微鏡、蓋玻片、封口膜、200μL移液器、暗盒等

二、相關溶液的配製

（1）20×SSC：175.3 g NaCl，88.2 g檸檬酸鈉，加水至1 000 mL（用10 mol/L NaOH調pH 至7.0）。

（2）去離子甲醯胺（DF）：將10 g混合床離子交換樹脂加入100 mL甲醯胺中。電磁攪拌30 min，用Whatman l號濾紙濾。

（3）體積分數70%甲醯胺/2×SSC：35 mL甲醯胺，5 mL 20×SSC，10 mL水。

（4）體積分數50%甲醯胺/2×SSC：100 mL甲醯胺，20 mL 20×SSC，80 mL水。

（5）體積分數50%硫酸葡聚糖（DS）：65℃水浴中融化，4℃或-20℃保存。

（6）雜交液：8 μL體積分數25%DS，20 μL 20×SSC混合。（或40 μL體積分數50% DS，20 μL 20×SSC，40

μL ddH2O混合）取上述混合液50 μL，與5 μL DF混合即成。其終濃度為體積分數10% DS，2×SSC，體積分數50% DF。

（7）PI/antifade溶液

PI原液：先以雙蒸水配置溶液，濃度為100 μg/mL，取出1 mL，加39 mL雙蒸水，使終濃度為2.5 μg/mL。

Antifade原液：以PBS緩沖液配製該溶液，使其濃度為10 mg/mL，用0.5 mmol/L的NaHCO3調pH值為8.0。取上述溶液1 mL，加9 mL甘油，混勻。

PI/antifade溶液：PI與antifade原液按體積比1:9比例充分混勻，－20℃保存備用。

（8）DAPI/antifade溶液：用去離子水配製1mL/mg DAPI儲存液，按體積比1:300，以antifade溶液稀釋成工作液。

（9）封閉液I：體積分數5% BSA 3 mL，20×SSC 1 mL，ddH2O 1mL，Tween20 5 μL混合。

（10）封閉液II：體積分數5% BSA 3mL，20×SSC 1mL，goat serum 250 μL，ddH2O 750 μL，Tween20 5 μL混合。

（11）熒光檢測試劑稀釋液：體積分數5% BSA 1mL，20×SSC 1mL，ddH2O 3mL，Tween20 5μL混合。

（12）洗脫液：100 mL 20×SSC，加水至500 mL，加Tween20 500 μL。