強陰離子交換柱洗脫

『壹』 陰離子交換柱能去除水中的什麼

作用是用陰樹脂中的氫氧根交換掉水中的其他陰離子。混合物通過陰離子交換柱，陰離子可以被吸附從而與其他物質分開，一般來說，陰離子交換柱的吸附劑應該呈陽性。

『貳』 強離子交換柱和弱離子交換柱的區別

陰樹脂和陽樹脂有什麼不同？

交換原理：

陰離子交換樹脂體內含有大量的鹼性基團，是通過氯來與水中的雜質交換，而陽離子交換樹脂則含有大量的酸性基團，是通過鈉離子或者氫離子與水中的雜質進行交換。

交換順序：

1、混床樹脂的交換順序一般是先陽離子，然後才是陰離子，陽離子交換樹脂會釋放出酸性基團，而陰離子交換樹脂則會釋放出鹼性基團，兩者中和，成為純水。

2、離子所帶有的電荷多，就容易被樹脂吸附，而所帶有的電荷較少，則比較難吸附。

3、如果帶有相同電荷量的離子，原子序數大的元素，形成離子的水合半徑小，較易被吸著。

溫度：

陽離子交換樹脂的耐溫性比較好，所以一般陽離子交換樹脂的使用溫度或者儲存溫度都要比陰離子交換樹脂高一些。

預處理：

陰陽離子交換樹脂的功能基團不同，所以樹脂預處理時使用的溶液也不同，陰陽樹脂在使用飽和食鹽水浸泡18-20小時之後，使用清水清洗干凈。

陰樹脂使用濃度為5%的氯化氫進行浸泡4-8小時，清洗干凈，再使用濃度在2%-4%左右的氫氧化鈉浸泡4-8小時，清洗至中性即可。

而陽樹脂則使用濃度在2%-4%左右的氫氧化鈉浸泡2-4小時，清洗干凈後，使用濃度為5%的氯化氫進行浸泡4-8小時，清洗至中性即可。

『叄』 怎樣利用離子交換柱層析法分離不同的蛋白質

離子交換柱層析法的核心在於不同的蛋白質的等電點不同
所以說，利用離子交換柱層析法分離不同的蛋白質其實就是利用不同蛋白質不同的等電點來分離。比如目的蛋白等電點是5，那麼在環境pH為8.0的情況下，目的蛋白可以結合陰離子交換層析，而雜蛋白可能不能結合或者結合能力比目的蛋白弱。通過不同的鹽濃度的洗脫讓結合能力不同的蛋白在不同的組分被洗脫出來，最終完成對目的蛋白和雜蛋白的分離。

『肆』 離子交換層析中，為什麼用氯離子洗脫陰離子

離子交換層析中，為什麼用氯離子洗脫陰離子
陰離子交換柱的填料是正電填專料,在低鹽條件下可以屬通過電荷相互作用吸附樣品中的陰離子和負電荷物質（如DNA）.這些帶負電的物質由於其帶電量不同,分子大小不同,因而與正電填料之間的結合力也就不同.用梯度的氯離子（一般用氯化鈉梯度,例如從100mM氯化鈉線性梯度升高到1M氯化鈉）洗脫掛柱樣品時,氯離子會和結合上的物質競爭結合正電填料,伴隨著氯離子濃度的不斷升高,氯離子的競爭作用越來越強,與填料結合的物質會按照親和力從弱到強依次洗脫下來,形成獨立的洗脫峰,從而將這些物質分開.
陽離子交換柱與之正好相反,柱子填料為負電荷,用鈉離子洗脫結合的正電物質.

『伍』 設計一個利用陰離子交換柱純化一個等電點為7.5的蛋白質的實驗

既然是抄陰離子交換，就要讓目標蛋白帶負電，那麼緩沖液PH就要大於等電點。緩沖體系的選擇也很重要，一般用TRIS-HCl，特別是弱陰離子柱不可選用帶負電強的磷酸鹽緩沖液，否則上樣液中被交換的將是磷酸根而不是目標蛋白。一般用NaCl平衡後上樣進行離子交換，然後再用較強的陰離子洗脫。

『陸』 陰離子交換色譜中陰離子洗脫強度順序

陰離子交換樹脂洗脫順序是先從上層然後到下層,對陰離子交換樹脂進行洗脫的目的是為了更好的對樹脂進行再生。

『柒』 樣本前處理（三）

蛋白提取的質量控制

我們通過上一篇筆記里介紹的各種方法把蛋白質提取出來以後，這事兒還沒完，因為我們需要對提取出來的蛋白進行一下質控，以確認是否成功提取出了足夠的蛋白，是否有污染等。

如上圖，質量控制分兩個部分：

含量測定 ：檢測是否有充足的蛋白被提取出。注意上圖里提到的不兼容問題，如果你樣品里加過SDS，就不要用Bradford法來測定蛋白濃度，而可以選用BCA方法；反之，如果你樣品里加入了還原劑，就不要用BCA方法來測定蛋白，可以選用Bradford法。

SDS-PAGE ：檢測蛋白的提取效率，以及是否有污染。比如我們上了50個樣，能看到的條帶卻很少，說明定量不準確。如果想從幾組樣品中尋找差異蛋白，特別需要做一次SDS-PAGE檢測同類樣品蛋白的提取效率。

以上圖為例，0號樣品中間的條帶不見了，可能是提取蛋白不充分引起的差異，也可能是樣品本身的差異。我們可以重新提取一次，先排除是否是提取造成的差異；如果是樣品本身的差異，建議用label free的方法，每個樣品單獨做定量，而不要用iTRAQ或TMT標記定量，否則會因為中間這個高豐度蛋白的影響，而導致定量不準。

我們再看來幾種常見的問題，以及解決方法，如下圖：

情況1：提取出來的結果差異很大。這種情況需要重新提取，以檢測到底是提取不充分造成的差異，還是樣品本身的差異；

情況2：左邊是分子量marker,右邊是實際樣品，可以看到實際樣品的條帶很少，可能是提取不充分，需要重設提取參數，使用更劇烈的條件，更長的時間，重新提取；

情況3：橫紋、縱紋比較多，很可能是核酸或脂蛋白的影響，這種情況需要進行脫鹽處理，也就是利用脫鹽柱與肽段結合，而與其它物質不結合，從而達到去除污染的目的。

情況4：兩個條帶很類似，但一條明顯比另一條淡。可能造成這種情況的原因有哪些呢？第一種情況，由於這是同樣類型的樣品，比如都是小鼠肌肉組織，一個樣品的蛋白質抽提充分，而另外一個樣品蛋白抽提不充分，就會導致兩條帶不一樣，這種情況下需要重新抽提。還有一種可能，考慮到是等量上樣跑的SDS-PAGE，如果兩個條帶顯示出的蛋白含量差別很大，則可能因為參考的含量測定結果不準確引起的，這時候需要重新定量。

脫鹽

蛋白提取後，還需要做脫鹽處理，我們來看看可以用哪些方法實現。

超濾： 可以截留10kDa及以上的蛋白分子，適用於體積較小的樣品。操作步驟可以是，從100μL超濾濃縮到40μL，再加緩沖液至100μL，再超濾到40μL，反復幾次。事實上，超濾是很難把污染（比如SDS）完全去掉的，最終仍然會有極少量的污染物存在，但當這些污染物的濃度降到一定程度時，則樣品的純凈度我們認為是可以接受的了。

Tips :

樣品中的尿素濃度需要控制在1M以下才能不對樣品造成影響，我們提取蛋白時使用的是8M尿素，直接稀釋8倍的話，造成樣品體積太大，下一步加入酶後，則酶和蛋白的濃度會特別低，酶解效果受到很大影響。另外，體積太大處理起來也不方便。這時也可以使用超濾的方法，多步稀釋，將尿素的濃度降到1M以下。

透析 ：也是可以截留10kDa及以上的蛋白分子，適用於體積比較大的樣品，比如尿液，可以將鹽透析至外面的透析液里。

丙醇沉澱 ：-20℃丙酮（V樣品：V冷丙酮=1：3以上）沉澱2個小時以上。

C18色譜柱脫鹽法 ：Waters公司生產的XBridge C18色譜柱，利用柱子上的填料與蛋白結合，而鹽類物質則流穿過去，從而達到分離的目的。

還原烷基化及酶解

脫鹽完成以後，接下來我們就要進行相當重要的一步：還原烷基化及酶解。整個流程，大夥兒看下面這張圖：

這裡面有兩件事要先跟大夥兒聊聊。

首先，我們來說說為什麼步驟里要把丙酮沉澱放在烷基化以後。通過之前的學習，我們知道丙酮可以溶解樣品的去污劑、還原劑等，而蛋白是不會在丙酮中溶解的，而是會沉澱下來，這樣就達到了去除雜質的目的。

烷基化以後，球狀蛋白變成鏈狀，再通過丙酮沉澱去掉尿素或SDS等污染物，然後復溶（即重新溶解，以備下一步酶解操作），那麼鏈狀的蛋白比球狀蛋白的復溶效果會更好，可以避免因為復溶不充分而造成的損失。因此，丙酮沉澱要放在烷基化之後再做。

另外，關於酶切這一步，有些抗體如果只用胰酶進行酶切，由於酶切位點太少，導致切出來的肽段太長，不便於質譜檢測。這種情況下可以結合其它酶，比如Lys-C，進行多酶酶切，使肽段變得短一些。經過測試我們發現，用Lys-C+胰酶酶切，比只用胰酶酶切，可以提高10%-20%的鑒定率。

酶解需要在buffer體系下完成，比如25mM碳酸氫銨體系（易揮發，pH 7-8）最為常用，或者也可以使用TEAB（ triethyl ammonium bicarbonate，三乙基二乙胺鹽，10-100mM）。

Tips :

如果做iTRAQ（或TMT）標記，最好用TEAB，而不是碳酸氫銨體系。因為iTRAQ（或TMT）試劑是標記末端氨基，碳酸氫銨上的氨基也會被標記上，影響蛋白的標記效率。

酶的用量可以參考以下的公式：

W（酶）：W（底物）=1:20 – 1:50

此外，需要注意的是胰酶酶解的兼容性問題。胰酶只能耐受最多1M的尿素，且不能與SDS同時使用。

蛋白質及肽段的預分級

前面提過，質譜儀是一種離子飽和性儀器，高豐度蛋白的存在會對低豐度蛋白的信號產生抑制，並且質譜儀反應也需要一定的時間。例如，人的細胞內通常會表達20300種蛋白，它們酶解後，每種蛋白會產生10-20種肽段，那麼就有幾十萬種肽段，質譜很難同時檢測到這么多種肽段。所以對肽段混合物進行分級，可以降低檢測的難度，得到更多的肽段/蛋白鑒定結果。

我們既可以從蛋白水平進行分離，也可以從肽段水平進行分離，還可以將多種分離手段結合起來。從蛋白水平的分離，大家都比較熟悉吧？通常我們用SDS-PAGE或IEF等技術，利用蛋白質的分子量、形狀、等電點等理化性質的不同，將混合在一起的蛋白質分開。

第二種分離方案是在肽段水平上進行，根據肽段的不同性質，使用不同填料進行分離。

SCX（Strong Cation Exchange）：是以硅膠為基質的強陽離子交換柱，可以與陽離子結合，並通過buffer進行離子交換，將陽離子分離和洗脫出來，達到與其它不帶陽離子的肽段分離的目的。

SAX（Strong Anion Exchange）：硅膠鍵合季銨基團的強陰離子交換柱，可以與陰離子結合，並通過buffer進行離子交換，將陰離子分離和洗脫出來，達到與其它不帶陰離子的肽段分離的目的。

RPLC（Reverse Phase Liquid Chromatography）：反相液相色譜柱，與正相柱在表面鍵合極性官能團不同，反相柱的表面鍵合的是非極性的官能團，例如，鍵合十八烷基官能團，稱為C18柱，其它常用的還有C8，C4和C2等。這里我們選用C18柱，根據肽段疏水性的不同，達到分離的目的。

HILIC（Hydrophilic interaction liquid chromatography ）：親水色譜柱可以用來分離極性化合物。由於強極性肽段在反相色譜柱中保留情況都比較差，很難將它們分開，而親水色譜柱卻可以用來固定強極性的肽段，並結合高比例有機相與低比例水相組成的流動相，來實現分離的目的，且這樣的流動相組成尤其有利於提高電噴霧離子化質譜（ESI-MS）的靈敏度。

High pH - Low pH RPLC：用pH10的液相條件，結合pH2的RPLC酸性條件，進行分離。

Tips :

通常，我們通過RPLC與質譜聯用。因為RPLC體系是用水和乙腈，易揮發，不含鹽，可以直接送入質譜進行檢測。而像SCX/SAX這類正相柱，需要通過高鹽的體系將樣品洗脫下來，所以它與質譜不兼容。我們在做多級分離時，前面都會有各種鹽的洗脫，最後才是RPLC，然後就可以直接連質譜了。

多維分離：例如，先從蛋白水平進行分離，再從肽段水平進行分離，或者多種肽段水平的分級分離結合起來使用。接下來我們重點聊一下各種多維分離的策略和效果。

我們先來看看上面這張圖。左上角的「A圖「展示的是通過High pH - Low pH RPLC將樣品分成了40個餾分，然後進行叉開的合並，合並為20個餾分，這樣的合並可以讓樣品中的肽段分布更加均勻。

右上角的」B圖」展示的是通過SDS-PAGE進行分離，也分成20個餾分，然後用兩種合並方案，分別合並為5個餾分和6個餾分，這樣做的目的也是為了讓樣品的肽段分布更加均勻。

左下角的「C圖」針對同一種樣品，對High/Low pH RPLC和SDS-PAGE兩種分離策略進行了比較，發現經過兩種分離方法後，有5408個蛋白是都可以鑒定到的，另外有1951種蛋白是只在High/Low pH RPLC分離策略中鑒定到的，而用SDS-PAGE分離，則可以鑒定到其它389種蛋白。從這個圖上看，兩種方法有互補性。

右下角的四幅小圖說明，當我們在做分級分離時，分的級別越多，能鑒定到的蛋白也就越多。不過這種增長並不是呈線性關系的，分級的級數達到一定程度時，能鑒定到的蛋白數量的增長就會飽和。所以比較省時省力又能保證效果的做法時，選擇一個合適的分級數即可。

我們來看一下目前發表的文獻里，利用多級分離所能鑒定到的蛋白數量。

一篇2013年發表在MCP上的文獻報道，採用RP-RPLC兩級分離，分成常規的24個餾分，上樣量為100μg，在一天內能檢測到8000多個蛋白。

一篇2013年發表在Nat Comm上的文獻報道，先採用RP柱分級，再使用SAX分離，然後通過1米的長柱子反相色譜分離。樣品為人的胚胎幹細胞，上樣量仍然為100μg，在線分離8天檢測了9818個蛋白，如果分離時間延長到24天，則可以檢測13075個蛋白。

一篇2014年發表在Nat Method上的文獻報道，採用IEF（等電聚焦電泳，isoelectric focusing）與RPLC結合，樣品是人的上皮癌細胞，上樣量為800μg，分成了360個餾分，耗時超過15天，一共分析到13078個蛋白。

就像前面說到的，對蛋白及多肽分離的級數越多，能鑒定到的蛋白也就越多，但常常因為機時的限制，再加上這種變化趨勢到一定程度總會飽和，所以我們通常有個權衡。比如常規的分10個餾分，基本上可以鑒定到5000-8000個蛋白。如果是血清樣品，可以餾分更多一些，尤其是RPLC一維，如果分到40或60個餾分，再合並為10或20個餾分，比直接分成10個或20個餾分能鑒定到的蛋白要多30%左右！

Tips :

對於分餾分，通常是利用C18的色譜柱來分級分餾分，這個沒有試劑盒。

『捌』 有誰知道HiTrap SP column 和HiTrap Mono Q column

HiTrap SP column 是一種來強陰離子源交換柱，而HiTrap Mono Q column則是一種強陽離子交換柱。可以根據分離純化樣品的等電點來決定用哪個柱子。可以根據洗脫溶液的鹽濃度或者pH來分離蛋白質。

它們一般有散裝的，自己裝柱，便宜一些。但是公司一般都有預裝柱，分1mL和5mL規格，象GE公司的SP預裝柱5 × 1 ml，價格在100美元左右。monoQ稍貴。自己裝柱，需要自己組裝整個設備。但是預裝柱需要有HPLC或者FPLC的儀器。

使用規則和一般的離子交換沒什麼差別，同時要參照柱子的說明和儀器說明書。

『玖』 離子交換分離操作中，以高濃度鹽溶液進行洗脫的原理是

用離子交換樹脂進行分離的操作程序包括三個步驟,具體操作過程如下文中所述.
(1)交換柱的制備首先選擇合適的離子交換樹脂類型,用相應的溶液進行處理,如強酸性陽離子交換樹脂需要在稀鹽酸中浸泡,以除去雜質並使之溶脹和完全轉變成H式.然後用蒸餾水洗至中性,裝入充滿蒸餾水的交換柱中.注意防止氣泡進入樹脂層.
(2)交換使待處理水樣以合適的流速通過交換柱進行離子交換.交換完畢後用蒸餾水洗去殘留的溶液及交換過程中形成的酸、鹼或鹽類等.
(3)洗脫洗脫是將已交換到樹脂上的離子分離出來的過程.選擇合適的洗脫液,使之以適宜速度通過交換柱進行洗脫.（更多質量檢測、分析測試、化學計量、標准物質相關技術資料請參考中檢所對照品查詢 www.rmhot.com）
陽離子交換樹脂常用鹽酸溶液作為洗脫液；陰離子交換樹脂常用鹽酸溶液、氯化鈉或氫氧化鈉溶液作洗脫液.對於分配系數相近的離子,可用含有機絡合劑或有機溶劑的洗脫液,以提高洗脫過程的選擇性.
離子交換技術在富集和分離微量或痕量元素方面應用很廣.例如分離水中的鋰離子、錳離子、銅離子、鐵離子、鋅離子等多種金屬離子,首先加入鹽酸使一部分離子轉變為絡合陰離子,然後將水樣通過強鹼性陰離子交換樹脂,各種離子均被交換在樹脂上,最後用不同濃度的鹽酸溶液進行洗脫分離.鋰離子不生成絡合陰離子,不發生交換,可用12mol／L HCl溶液最先洗脫出來

『拾』 急！急！如何裝陰離子交換柱，使用時候出現氣泡怎麼除去謝謝

可以用適量的有機溶劑潤洗一下層析柱，柱子體積較小的話就用玻璃棒攪勻排除一下氣泡。

不管是干柱和濕柱，都要加層析液，不能要求一開始就沒有氣泡的。要用洗脫劑不停的洗脫，就是用配置好的試劑一邊一邊對柱子進行洗脫，這樣不但可以消除氣泡，還可以使硅膠充分沉降，讓層析效果更好。等柱子沒有氣泡後在上樣用洗脫液進行層析。

若柱中留有氣泡或各部分松緊不勻（更不能有斷層）時，會影響滲透速度和顯色的均勻。去除就是用玻璃棒攪拌，趕走氣泡。

(10)強陰離子交換柱洗脫擴展閱讀：

水溶液中一些陽離子進入了反離子層，而原來的反離子層中的陽離子進入了水溶液。這種在正常濃度下，反離子層與水溶液之間的各向同性離子交換稱為離子交換作用。

離子交換主要發生在擴散層與正常水溶液之間。由於粘土顆粒表面通常帶有負電荷，離子交換主要是陽離子交換，所以又稱陽離子交換。離子交換嚴格遵循等價定律，即進入反離子層的陽離子等價於從反離子層排開的陽離子等價。