超濾洗咪唑

1. 說明為什麼咪唑能在親和層析中用來洗脫蛋白質

因為咪唑能競爭性的結合到柱子上，使帶His標簽的目的蛋白喪失了結合位點，從而被洗脫下來。

2. 蛋白質純化技術的方法有哪幾種

一、電泳：
在克隆基因表達產物的檢測分析過程中，電泳是常用的方法，但在純化蛋白時，通常都不採用電泳的方法。由於某些特殊的目的，需要用聚丙烯醯胺凝膠電泳純化蛋白質，常用下述方法進行：①從電泳後的凝膠上切下所需的相應條帶，將凝膠壓碎，用緩沖液浸泡，使其中的蛋白質擴散出來，從而獲得純化的蛋白質。此法簡單但回收率低。②將電泳後的凝膠用電洗脫的方法使蛋白質從凝膠轉移到溶液中，從而達到純化的目的。此法快速，回收率高，但需要特殊的電泳裝置。
二、色譜法：
色譜法（chromatography）是蛋白純化中最常用的一種方法，這種方法既可以制備大量的純化蛋白質，又可以保持蛋白質的生物學活性。色譜的種類很多，可分為常規色譜和高效液相色譜（high-performance liquid chromatography,HPLC）。凝膠過濾色譜、離子交換色譜、親和色譜等均為常規色譜法。HPLC包括反相高效液相色譜（reversed-phase HPLC,RP-HPLC）、離子交換高效液相色譜（ion exchange HPLC）等。根據目標蛋白性質的不同可選用相應的色譜分離技術純化蛋白質。
1.凝膠過濾色譜法
凝膠過濾色譜法（gel-filtration chromatography, GFC）又稱排阻色譜。凝膠是一類具有三維空間結構的多孔網狀顆粒物質，如瓊脂糖凝膠（sepharose）、葡聚糖凝膠（sephadex），將凝膠顆粒裝入色譜柱中即可用於物質的分離。當被分離物質通過凝膠柱時，大於凝膠孔徑的分子不能進入凝膠內部，只能在凝膠顆粒之間的空隙中流動和分配，流經的路途短，可很快被洗脫出來，而小於凝膠孔徑的分子則進入凝膠顆粒內部，在凝膠內部穿行，流經的路程長，移動的速度慢，最後被洗脫出來；分別收集不同時相的洗脫液，即可得到純化的物質。
GFC可在存在有多種離子、去污劑、尿素、鹽酸胍、高或低離子強度、常溫或低溫等多種條件下進行，根據所分離物質的性質不同可選擇相應的色譜條件，從而獲得有生物學活性的純化的生物大分子。
2.離子交換色譜法
離子交換色譜法（ion exchange chromatography,IEC）是根據物質的酸鹼度、極性和分子大小的不同進行分離的技術，通常包括吸附、吸收、擴散、穿透、靜電引力等復雜的物理化學過程。自然界的包括蛋白質在內的生物大分子都帶有電荷，當所需分離的物質通過離子交換色譜柱時，由於所帶電荷、分子量等不同，有些被固定相靠靜電引力所吸附，未被吸附的物質可被緩沖液首先洗脫出來；被吸附的物質由於所帶電荷多少不同，對固定相的親和力大小也不同，可被梯度離子緩沖液先後洗脫下來，使同一溶液中的不同物質被分離。色譜柱中填充的陰離子交換劑可用於帶正電荷物質的分離，而陽離子交換劑可用於帶負電荷物質的分離。
3.親和色譜法
許多生物大分子物質具有與其結構相對應的專一分子發生可逆性結合的特徵，如酶與底物及輔助因子、酶與抑制劑、抗原與抗體、激素與受體、核酸片段與其互補的核酸序列、生物素與親合素等，分子間的這種結合能力叫作親和力。
親和色譜（affinity chromatography）是利用生物大分子間所具有的特異性親和能力進行分離的方法。該方法常把可親和的一對分子中的一方固定在不溶於水的化合物上作為色譜的支持體即載體，使之固相化，作為固定相；另一方隨流動相流經固定相，雙方即可發生特異性結合；用流動相經過一段時間的洗滌，可將雜質去除，而後再利用親和吸附的可逆特性，改用特殊的流動相使所需分離的物質被解離下來，從而得到純化的物質。親和色譜法中的載體種類很多，最常用的是瓊脂糖凝膠（sepharose），其分子上有較多的羥基，活化後可與親和分子相耦聯，另外其理化性質穩定，不會影響色譜的分離過程。
親和色譜法可在溫和條件下操作，純化過程簡單、快速、解析度高，對分離含量極少且性質不穩定的生物活性物質極為有效。但由於不是任何生物大分子之間均有特異的親和力，而針對於某一種親和分子就需要制備專一的親和色譜柱，因此親和色譜的應用具有一定的局限性，主要由於蛋白質尤其是酶、抗原、抗體的分離與純化。

3. 可溶性表達的蛋白如何純化純化後如何除咪唑

1，破細胞，高速離心收上清收集上清（同時平衡好柱子）；
2，既然你是His-tag，用Ni-NTA之類的柱子，兩次上柱，buffer平衡；
3，低濃度咪唑（5mM）洗5-10柱體積，以洗去雜蛋白；
4，過梯度咪唑（10-500MM），用紫外檢測儀監測280nm，收下每個峰；
5，用峰液跑SDS-PAGE，看哪個峰的蛋白濃度和純度最為理想；
6，脫咪唑以及換buffer、脫鹽，有兩種基本方法：A，透析（經濟、簡便）；B，用脫鹽柱（需要有儀器及柱子，更簡便更省時）。
關於您說的蛋白沒有活性的問題，我建議您在脫咪唑之前，就用峰液去測活性（如果咪唑不影響活性的檢測手段），一般來講，咪唑不會對蛋白的活性有太大影響。如果脫咪唑之前就已經沒有活性，那就不是脫咪唑的問題，而是要往前追溯問題。比如，有無移碼、tag對蛋白性質影響如何、破細胞的方法是否影響蛋白等等。
對可溶性蛋白的表達及純化，我有多年經驗，若有疑問，歡迎繼續討論。

4. 濃度越大的咪唑蛋白洗脫越差是為什麼

Ni柱中的氯化鎳可以與有HIs（組蛋白）標簽的蛋白結合，也可以與咪唑結合。
步驟是：過柱子前可以選擇Ni柱重生，也就是往柱子里倒氯化鎳，一個柱長體積就行了，然後平衡柱子，拿你自己的buffer，給蛋白提供最適的環境，我一般平衡4個柱長，然後蛋白上樣，你可以讓他自己掛，這樣掛柱子的效果好一些，如果流速太慢，可以加個恆流泵，但是一定不能太快，太快掛柱效果差，當然你也可以選擇循環掛柱，就是恆流泵的一頭接你裝蛋白的燒杯，從柱子中留下來的液體還用同一個燒杯接回去。掛完之後，按理想來講，你的蛋白在Ni柱中與Ni就結合了，雜蛋白多數在燒杯里，留下來了，當然肯定有少量雜蛋白也掛上了，這時候你要梯度洗脫，拿咪唑和你的buffer配，一般從0 20mM 40mM。。。。100mM這樣洗脫（當你不知道你的蛋白大概在什麼時候出來的時候）我指的是咪唑的終濃度。咪唑加入之後，會和蛋白爭奪與Ni的結合位點，雜蛋白、你的目的蛋白，會在不同的濃度被洗脫下來，洗完之後，你可以用400mM咪唑洗柱子，清理一切蛋白，然後平衡幾次，是否選擇重生你自己定咯~然後放上20%乙醇保存柱子就可以咯~
過的蛋白用不同的管子收下，然後SDS-page檢測在哪個管子里。

5. 咪唑的合成方法

1、由乙二醛經環合；中和而得。將乙二醛、甲醛、硫酸銨投入反應鍋，攪拌加熱至85-88℃，保溫4h。冷至50-60℃，用石灰水中和至pH為10以上。加熱至85-90℃，排氨1h以上，稍冷，過濾，濾餅用熱水洗滌，合並洗；濾液，減壓濃縮至無水蒸出時，繼續減壓蒸餾至低沸物全部蒸完，收集105-160℃（0.133-0.267kPa）餾分，得咪唑。收率約45%。
2、另一種製法是使鄰苯二胺與甲酸環合生成苯駢咪唑，再經雙氧水反應開環為4,5-二羥基咪唑，最後脫羧製得咪唑。4,5-二羥基咪唑也可由d-酒石酸經硝化、環合而得。4,5-二羧基咪唑的脫羧製取咪唑的工藝過程如下：將4,5-二羥基咪唑與氧化銅混合，加熱至100-280℃，放出大量二氧化碳氣體，收集餾出液即得粗品，用苯重結晶得成品，收率76%。
3、咪唑的化學合成路線有乙二醛合成法、腈類合成法、酒石酸法、鄰苯二胺與甲酸環合法、溴乙醛法等。
（1）工業乙二醛合成法將乙二醛、甲醛、硫酸銨投入反應釜，攪拌加熱至85～88℃，保溫4h。然後冷卻至50～60℃，用石灰水中和至pH值10以上，再加熱至85～90℃，排氨1h以上。稍冷後，過濾，濾餅用熱水洗滌，合並洗、濾液，加入到蒸餾裝置中，先減壓濃縮至無水蒸出，再繼續減壓蒸餾至低沸物全部蒸完，然後收集105～160℃/133.3～266.7Pa餾分，得咪唑。收率約45%。每噸產品消耗乙二醛4172kg，甲醛（37%）2344kg，硫酸銨（99%）3826kg，石灰2571kg。反應式如下：
該法由於收率和產品質量不盡如人意，文獻報道了一些改進方法，如採用異丙醚萃取的方法、用烏洛托品代替甲醛的合成方法、用氨水代替硫酸銨的合成方法、用草酸銨代替硫酸銨的合成方法等。如用草酸銨代替硫酸銨可使收率提高到65%。
4、鄰苯二胺與甲酸環合法將鄰苯二胺與甲酸環合生成苯並咪唑，再經雙氧水反應開環為4,5-二羧基咪唑，最後脫羧製得咪唑
5、溴乙醛法用醋酸乙烯酯與溴加成，再用乙醇處理，生成溴代乙醛，再與溴化氫、乙醇作用生成縮醛。縮醛在乙二醇及濃鹽酸作用下生成環狀縮醛，用過量甲醯胺與縮醛在不斷通入氨氣情況下反應，生成咪唑，產率為50%。
6、以乙二醛為原料，在甲醛中與硫酸銨(或氨)在85～90℃下反應，先製得咪唑的硫酸鹽，然後用氫氧化鈣中和，可得咪唑粗製品，過濾，用水洗滌，合並濾液和洗滌液，減壓蒸發濃縮，結晶，可製得。如果直接用氨，則無硫酸鹽的處理步驟，可一步製得。無論是用硫酸銨或氨，此法的收率較低，約45%。
以鄰苯二胺和甲酸為原料，環合，生成苯並咪唑，再在硫酸溶液中氧化，生成二羧基咪唑，最後在氧化銅作用下，於100～150℃下脫羧，可製得粗品，再在苯溶液中重結晶，可得咪唑成品。以D-酒石酸為原料，在硫酸中，用硝酸進行硝化，製得2，3-二硝基酒石酸，再在甲醛中與氨反應，可製得二羧基咪唑，然後脫羧，可製得。
7、其制備方法是將乙二醛、甲醛、硫酸銨投入反應鍋，攪拌加熱至85～88℃，保溫4h，冷至50～60℃，用石灰水中和至pH=10以上，加熱至85～90℃，排氨1h以上，稍冷，過濾，濾餅用熱水洗滌，合並洗濾液，減壓濃縮至無水蒸出時，繼續蒸餾至低沸物全部蒸完，收集105～160℃/133～266Pa餾分得咪唑。
也可用鄰苯二胺為原料，加入到甲酸中攪拌加熱，在95～98℃保溫2h，降溫到50～60℃，用10%NaOH調節至pH=10，降至室溫，過濾水洗，乾燥得苯並咪唑。在攪拌下將苯並咪唑投入濃硫酸，升溫至100℃，慢慢滴入H2O2。加畢，在140～150℃攪拌反應1h，降溫至40℃，加水稀釋，析出結晶，過濾，水洗，乾燥，得4，5-二羧基咪唑。將4，5-二羧基咪唑與氧化銅混合，加熱至100～280℃，放出大量二氧化碳氣體，收集餾出液，即得白色塊狀物粗品，用苯重結晶得精品咪唑。

6. 蛋白純化過程中，超濾能除咪唑嗎

您好！可以的，但是超濾除的不是很乾凈，用分子篩干凈些。

網路教育團隊【海納百川團】為您解答。
感謝您的採納 O(∩_∩)O 。如有疑問，歡迎追問。

7. 生物樣品中蛋白質的處理方法有哪些

一。蛋白質沉澱方法
1.中性鹽鹽析法
⑴在一定的
ph值及溫度條件下，改變鹽的濃度（即離子強度）達到沉澱的目的，稱為「ks」分級鹽析法。
（ks鹽析：固定ph,
溫度，改變鹽濃度）
⑵在一定的離子強度下，改變溶液的ph值及溫度，達到沉澱的目的，稱為「β」分級鹽析法。
（β鹽析：固定離子強度，改變ph及溫度。）
2.等電點沉澱法
蛋白質等電點沉澱法是基於不同蛋白質離子具有不同等電點這一特性，依次改變溶液ph值的辦法，將雜蛋白沉澱除去，最後獲得目標產物。
3.有機溶劑沉澱法
許多能與水互溶的有機溶劑如乙醇、丙酮、甲醇和乙腈，常用於低鹽濃度下沉澱蛋白質。
4.非離子型聚合物沉澱法
20世紀60年代非離子型聚合物開始用於分離血纖維蛋白原和免疫球蛋白，從此高相對分子質量非離子聚合物沉澱蛋白質的方法被廣泛使用，如：聚乙二醇（peg）、聚乙烯吡咯烷酮（pvp）、葡聚糖等。
5.金屬沉澱法
能與羧基、胺基等含氮化合物以及含氮雜環化合物強烈結合的金屬離子，如：mn2+、fe2+、co2+、ni2+、cu2+、zn2+、cd2+；
能與羧酸結合而不與含氮化合物結合的金屬離子，如：ca2+、ba2+、mg2+、pb2+；
與巰基化合物強烈結合的金屬離子，如：hg2+、ag+、pb2+。
實際使用時，金屬離子的濃度常為0.02
mol/l。
6.親和沉澱
初始階段：將一個目標蛋白質與鍵合在可溶性載體上的親和配體絡合成沉澱；
所得沉澱物用一生中適當的緩沖溶液進行洗滌，洗去可能存在的雜質；
用一種適當的試劑將目標蛋白質從配體中離解出來。
7.選擇性變性沉澱法
（1）例如對於α-澱粉酶等熱穩定性好的酶，可以通過加熱進行熱處理，使大多數雜蛋白受熱變性沉澱而被除去。
（2）根據欲分離物質所含雜質的特性，通過改變ph值或加進某些金屬離子等使雜蛋白變性沉澱而被除去。
8.反膠束萃取蛋白質
菌體細胞提取
固液分離是生物產品生產中的重要單元操作。培養基、發酵液、某些中間產品和半成品等都需進行固液分離。發酵液由於種類多、粘度大及成分復雜，其固液分離最為困難。
固液分離的方法很多，生物工業中常規的方法有分離篩、重力沉降、浮選分離、離心分離和過濾等，其中用於發酵液固液分離的方法主要是離心分離和過濾。
二。超濾膜濾去。

8. 蛋白純化過程中,lysis buffer,wash buffer和Elution buffer所含的咪唑的作用

lysis buffer中加咪唑的目的是與雜蛋白競爭，使那些與填料親和力弱的雜蛋白不能掛柱；
wash buffer中加咪唑是為了洗去大部分已掛柱的雜蛋白（也會洗去少量目的蛋白）；
elution buffer中加梯度咪唑，而且咪唑濃度漸高，是咪唑和目的蛋白競爭性結合填料，從而把目的蛋白從柱上洗脫。
這是我的理解，歡迎繼續討論，祝愉快！

9. 超濾蛋白 咪唑濃度在多少一下可以了

超濾蛋白不需要考慮咪唑的濃度
咪唑是小分子試劑，分子量68.07，正常的超濾管截留分子量一般都是3KD~10KD
咪唑這樣的小分子會直接透過濾膜進入到下層濾出液中，而蛋白會被留在上層溶液中
超濾蛋白如果不添加溶液，咪唑濃度是不會改變的，只會是提高蛋白的濃度
所以超濾蛋白不需要去考慮咪唑的濃度

10. 咪唑有毒嗎

二甲基-2-咪唑啉酮
別名：DMI
作為一種有機溶劑和原材料廣泛應用於醫葯、農葯、染料、液晶材料等領域。是清洗電子部件和模具的試劑，及高聚物的聚合溶劑。在醫葯領域作為葯物透皮吸收劑應用效果顯著；在高分子領域，可促進原料和催化劑的混合，改善聚合物化學性能、熱性能和機械性能；在液晶材料領域，可獲得優質多孔超濾膜，是儲存性能穩定的液晶定位劑；在分子間，分子內的縮合制備大分子雜環化合物，鹼性條件下的親核取代、還原、氧化、消除、鹵素交換反應、Kolbe-Sschmill反應、Ullmann反應領域的應用都具有良好效果。作為一種有機溶劑和原材料廣泛應用於醫葯、農葯、染料、液晶材料等領域。是清洗電子部件和模具的試劑，及高聚物的聚合溶劑。在醫葯領域作為葯物透皮吸收劑應用效果顯著；在高分子領域，可促進原料和催化劑的混合，改善聚合物化學性能、熱性能和機械性能；在液晶材料領域，可獲得優質多孔超濾膜，是儲存性能穩定的液晶定位劑；在分子間，分子內的縮合制備大分子雜環化合物，鹼性條件下的親核取代、還原、氧化、消除、鹵素交換反應、Kolbe-Sschmill反應、Ullmann反應領域的應用都具有良好效果。
1 反應溶劑
由於DMI 的熱穩定性、化學穩定性，它對無機和有機化合物的溶解能力，以及它作為非質子傳遞型極性溶劑的催化作用，使其成為一種特別有效的反應溶劑。通過DMI的應用，能夠在較短的時間內以較高的收率得到較高純度的反應產物。
它對於各種親核取代反應是非常有效的，例如，在如後圖解所示的苯基醚衍生物、氨基化合物以及氟苯衍生物的合成等。它的高介電常數和對陽離子的溶劑化作用能夠催化陰離子親核反應。這些合成產物在農用化學品、醫葯、染料以及高性能樹脂的單體等的合成中用作中間體。
2 聚合物
DMI 是唯一適用於耐熱的熱塑塑料的生產過程的溶劑，它還能有效地用作各種聚合物合成工藝的溶劑，並且用作聚合反應及塑料成型加工時的清模劑。在聚醯胺和聚醯亞胺樹脂的生產中，DMI 能加速醯胺和亞胺基團的形成，得到高分子量的聚合物。在聚苯硫醚樹脂的生產中，用DMI可以獲得電子材料中需要的含極少量有機雜質的產品。在聚苯醚碸樹脂生產中，DMI 能有效控制副反應的發生，得到高質量的聚合物產品。在聚醯亞胺樹脂和聚碸樹脂成膜加工以及聚醚酮樹脂薄膜的延展加工時，用DMI進行處理可以使薄膜更均勻。
3 洗滌劑
把DMI添加到表面活性劑、鹼、醇和聚氧乙烯烷基醚的混合物中去，能得到一種強力洗滌劑。由於DMI很容易溶解污垢，它還能用來配製一種高效清洗液用於清洗玻璃和金屬。
4 染料和顏料
用DMI為溶劑組分與染料及顏料混合製作的墨水，能噴繪出對比鮮明，圖像畫面清晰。
5 電子材料
由於DMI的粘度低，介電常數高，它可以用作非水電池的電解質溶液的溶劑。此外，它還可以作為光致刻蝕用的剝離劑，與通常所用的剝離劑不同，它不涉及因通常所用的剝離劑的水不溶性而導致的一系列復雜工藝過程，也不會對環境產生負面影響。
6 表面處理劑
為了提高環氧樹脂粘合劑的粘接強度，一種SDN (鈉、鉀或鋰的聚丙烯絡合物)的DMI溶液被用於TEFLON® (聚四氟乙烯)的表面處理。
7 石油產品
DMI 具有高沸點和高熱穩定性，並且不易與其它物質構成共沸混合物，所以，它可以在液-液萃取、逆流分布、提取蒸餾和逆流洗滌等許多工業過程中應用。
由於DMI 能夠溶解芳香化合物和不飽和烴，卻不能溶解鏈烷烴，因此它是最好的BTX（苯、甲苯和二甲苯）萃取劑