陽離子交換固相萃取柱操作

① 如何正確使用固相萃取柱

用異丙醇浸泡填料，在柱下端放微孔濾膜，開動真空泵抽，這樣填料均勻分布，上面再加一層篩板壓實。外面買的成品柱兩頭都有篩板，將填料夾在中間，這樣不會散。如果沒有條件可以試試棉花，但是這只用於大體積的制備柱。小柱還是不適合。

② 使用陽離子固相萃取柱前為什麼要用甲醇和水活化

要是使用的是高聚物基質的陽離子柱，可直接上樣，不用活化，要是使用的是硅膠基質的陽離子柱，活化是為了打開鍵合在硅膠上的碳基團鏈，使之充分發生作用，甲醇是為了與碳鏈互溶，用水過度是為了能和樣品溶液相溶。

③ 三聚氰胺用什麼儀器檢測

高效液相色譜來（HPLC）儀：配源有紫外檢測器或二極體陣列檢測器。
分析天平：感量為0.0001g和0.01g。
離心機：轉速不低於4000r/min。
超聲波水浴。
固相萃取裝置。
氮氣吹乾儀。
渦旋混合器。
具塞塑料離心管：50mL。3.3.9 研缽。

④ 乳製品中三聚氰胺檢測技術研究發展

苦味酸法
苦味酸法是國標GB/T9567-1997《工業三聚氰胺>中規定的檢測方法。將水加入試樣，加熱溶解後，加入苦味酸溶液，稱量所生成的苦味酸三聚氰胺沉澱的質量，即測得三聚氰胺純度含量。稱試樣1g（精確至0.0002g）,置於500mL錐形瓶中，同時加入400mL水，加熱溶解；冷卻後，加入酚酞指示液3滴，若顯色，加入硫酸溶液，直至溶液顏色消失，若有不溶物，需過濾，水洗；把濾液和洗液合並，移入500mL容量瓶中，加水至刻度，仔細振搖混合後，准確吸取100mL置於500mL燒杯里；將此溶液加熱至80℃，另加入已加熱至80℃的100mL苦味酸溶液，冷卻至室溫後，保持在15℃以下約8h；用已恆重的玻砂過濾器過濾，之後，先用約100mL苦味酸三聚氰胺的飽和溶液洗滌，再用10mL水洗；在100-105℃下經2h烘乾玻砂過濾器，置於乾燥器中冷卻後，稱量（精確至0.0002g）求得沉澱物質量。。

升華法
在升華裝置中將試樣在負壓下進行加熱，讓三聚氰胺完全升華後，稱其殘渣量，即測得三聚氰胺純度。稱取試樣，置於預先乾燥了的且已知質量的試樣容器里；將試樣容器置入減壓升華裝置內，待完全密閉後，開啟真空裝置緩緩吸引，並調節裝置內的溫度，經2小時升華結束；取出試樣容器，冷至室溫後，稱量試樣容器的質量。

電位滴定法
袁立勇等利用電位滴定法測定溶液中三聚氰胺的含量。硫酸溶液和三聚氰胺反應生成弱酸性化合物。以pH3為終點指示，通過硫酸溶液的消耗體積計算三聚氰胺的含量。相對標准偏差不大於0.50%。

食品中的檢測方法
2007年06月14日，農行行業標准NY/T1372-2007《飼料中三聚氰胺的檢測》中規定測定飼料中三聚氰胺的含量方法為高效液相色譜（HPLC）和氣相色譜質譜聯用法（GC-MS）。2008年10月07日，國家標准GB/T22388-2008《原料乳與乳製品中三聚氰胺檢測方法》[20]中規定原料乳、乳製品以及含乳製品中三聚氰胺檢測方法為高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜-質譜/質譜法（LC-MS/MS）和氣相色譜-質譜聯用法[包括氣相色譜-質譜法（GC-MS），氣相色譜-質譜/質譜法（GC-MS/MS）]。2008年10月15日，國家標准GB/T22400-2008《原料乳中三聚氰胺快速檢測液相色譜法》[21]中規定了液相色譜法作為快速檢測原料乳及不含添加物的液態乳製品中三聚氰胺的方法。目前，三聚氰胺的檢測方法還包括試劑盒檢測法（ELISA）、離子交換色譜-紫外檢測法等。

高效液相色譜法（HPLC)
試樣中的三聚氰胺用三氯乙酸溶液提取，提取液離心後經混合型陽離子交換固相萃取柱凈化，洗脫物吹乾後用甲醇溶液溶解，用高效液相色譜儀進行測定。在添加濃度2mg/kg～10mg/kg濃度范圍內，回收率在80%～110%之間，相對標准偏差小於10%。稱取5g試樣，准確加入50ml 10g/L三氯乙酸溶液，加入2ml 22g/L乙酸鉛溶液。搖勻，超聲提取20min。靜止2min，取上層提取液約30ml轉入離心管。在10000r/min離心機上離心5min。分別用3ml甲醇，3ml水活化混合型陽離子交換固相萃取柱，准確移取10ml離心液分次上柱，控制過柱速度在1ml/min以內。再用3ml水和3ml甲醇洗滌混合型陽離子交換固相萃取柱，抽干後用氨水甲醇3ml洗脫。洗脫液50℃氮氣吹乾，准確加入甲醇溶液，渦旋震盪1min，過0.45µm濾膜，上機測定。

氣相色譜-質譜聯用法（GC-MS和GC-MS/MS）[20]
試樣經超聲提取、固相萃取凈化後，進行硅烷化衍生，衍生產物採用選擇離子監測質譜掃描模式（SIM）或多反應監測質譜掃描模式（MRM），用化合物的保留時間和質譜碎片的豐度比定性，外標法定量。其中GC-MS法在添加濃度0.05mg/kg～2mg/kg濃度范圍內，回收率在70%～110%之間，相對標准偏差小於10%；GC-MS/MS法在添加濃度0.005mg/kg～1mg/kg濃度范圍內，回收率在90%～105%之間，相對標准偏差小於10%。

GC-MS法，稱取1g（精確至0.01g）試樣於50mL具塞塑料離心管中，加入25mL 1%三氯渦漩振盪30s，再加入15mL三氯乙酸溶液，超聲提取15min，加入2mL乙酸鉛溶液，用三氯乙酸溶液定容至刻度。充分混勻後，轉移上層提取液約30mL至50mL離心試管，以不低於4000r/min離心10min。上清液待凈化。若樣品中脂肪含量較高，可以先用乙醚脫脂後再用三氯乙酸溶液提取。准確移取5mL的待凈化濾液至固相萃取柱中。再用3mL水、3mL甲醇淋洗，棄淋洗液，抽近干後用3mL 5%氨化甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，50℃下氮氣吹乾。

GC-MS/MS法，稱取0.5g（精確至0.01g）試樣，加入5mL甲醇水溶液，渦旋混勻2min後，超聲提取15min-20min，以不低於4000r/min離心10min，取上清液200μL用微孔濾膜過濾，50℃下氮氣吹乾。取氮氣吹乾殘留物，加入600μL的吡啶和200μL衍生化試劑，混勻，70℃反應30min後，供GC-MS或GC-MS/MS法定量檢測或確證。

液相色譜-質譜/質譜法（LC-MS/MS
試樣用三氯乙酸溶液提取，經陽離子交換固相萃取柱凈化後，用液相色譜-質譜/質譜法測定和確證，外標法定量。在添加濃度0.01mg/kg～0.5mg/kg濃度范圍內，回收率在80%～110%之間，相對標准偏差小於10%。稱取1g（精確至0.01g）試樣於50mL具塞塑料離心管中，加入8mL 1%三氯乙酸溶液和2mL乙腈，超聲提取10min，再振盪提取10min後，以不低於4000r/min離心10min。上清液經三氯乙酸溶液潤濕的濾紙過濾後，做待凈化液。若樣品中脂肪含量較高，可以用三氯乙酸溶液飽和的正己烷液-液分配除脂後再用SPE柱凈化。將上述待凈化液轉移至固相萃取柱中。依次用3mL水和3mL甲醇洗滌，抽至近干後，用6mL氨化甲醇溶液洗脫。整個固相萃取過程流速不超過1mL/min。洗脫液於50℃下用氮氣吹乾，殘留物（相當於1g試樣）用1mL流動相定容，渦旋混合1min，過微孔濾膜後，供LC-MS/MS測定。

試劑盒檢測法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay ELISA）
試劑盒檢測法即為酶聯免疫吸附劑測定，是利用萃取液通過均質及震盪的方式提取樣品中的三聚氰胺進行免疫測定的一種方法。
將三聚氰胺HRP酶標記物、標樣及樣品提取液加入包被三聚氰胺抗體的試驗孔中孵育在30min的孵育過程中，樣品中的三聚氰胺與HRP酶標記物競爭結合三聚氰胺抗體。孵育完後，傾去孔內液體洗滌除去未結合的三聚氰胺和HRP酶標記物。每孔加入清澈的底物溶液，結合的酶標記物將無色的底物轉化為藍色的物質。孵育30min後終止反應，用酶標儀讀取450nm下各孔的OD值。比較未知樣品的OD值與標樣的OD值，就可計算出樣品中的三聚氰胺濃度，最低可檢測到10ppb以下的三聚氰胺殘留，檢測過程約需65min

離子交換色譜-紫外檢測法
何強建立離子交換色譜-紫外檢測法測定乳製品中三聚氰胺。樣品用水和乙腈提取，分析時用LC-SCX離子交換色譜柱分離，濃度為0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液（pH3.0）-乙腈（70：30）為流動相，在紫外波長240nm處檢測。三聚氰胺為0.5mg/L-100.0mg/L時，質量濃度與色譜峰面積呈良好的線性關系（r=0.9999），最低檢出限為1.0mg/kg，加標回收率為93.8%～102.5%，RSD<3.5%。

其他檢測法
利用抗原與抗體相互識別的原理，製作出能識別三聚氰胺的抗體試紙，將試紙插入稀釋的奶製品中，則可檢測出其中是否含有三聚氰胺。使用膜分離技術萃取樣品溶液，然後採用紫外可見光度法或化學檢驗的方法檢測樣品中三聚氰胺的含量。

⑤ 國家標准檢測蛋白質含量測定方法

蛋白質含量測定方法就是檢測元素的含量，像三聚氰胺的問題，就是通過增加N的含量使「蛋白質」含量提高的。

國家標准檢測蛋白質含量的方法叫做凱氏定氮法，食物中的蛋白質在催化加熱條件下分解，導致氨和硫酸結合產生硫酸銨。 鹼蒸餾採用無硫，硼酸吸收，用硫酸或鹽酸標准滴定溶液滴定，根據酸耗計算氮含量，再乘以轉化系數，即蛋白質含量。

具體操作步驟如下：

1.樣品處理

精確稱量0.2-2.0g固體樣品或2-5g半固體樣品或吸收10-20ml液體樣品（約30-40mg氮當量）。將其轉移至乾燥的100毫升或500毫升氮氣固定瓶中，加入0.2克硫酸銅，6克硫酸鉀和20毫升硫酸，輕輕搖動，在瓶口放置一個小漏斗，將瓶子傾斜石棉網上有45度角，有小孔。

加熱小火後，內容物碳化，泡沫完全停止，加強火力，保持瓶內液體稍微沸騰，直至液體呈藍綠色澄清透明，然後繼續加熱0.5小時。取出並冷卻，小心加入20毫升水，冷卻，移入100毫升容量瓶中，用少量水洗凈氮氣瓶，洗凈液放入容量瓶中，然後用水沖洗至刻度，混勻備用。

取相同量的硫酸銅，硫酸鉀和濃硫酸作為試劑進行空白試驗。然而，這種方法很危險，很難在實驗室中證明。大多數實驗室都有一個消化器，可以一次處理16個以上的樣品和一個可以自行設定溫度的呼吸機。它更安全，更可操作。

(5)陽離子交換固相萃取柱操作擴展閱讀

除了凱氏定氮法以外，標準的測量方法還有：

• 分光光度法

食品中的蛋白質在催化加熱條件下被分解，分解產生的氨與硫酸結合生成硫酸銨，在pH4.8的乙酸鈉-乙酸緩沖溶液中與乙醯丙酮和甲醛反應生成黃色的3,5-二乙醯-2,6-二甲基-1,4-二氫化吡啶化合物。在波長400nm 下測定吸光度值，與標准系列比較定量,結果乘以換算系數，即為蛋白質含量。

• 燃燒法

樣品在900~1200℃下燃燒。在燃燒過程中，產生混合氣體。 諸如碳，硫和鹽的干擾氣體被吸收管吸收，氮氧化物被還原成氮。 形成的氮氣流由熱導檢測器（TCD）檢測。

⑥ 固相萃取上樣後需要靜置一段時間嗎

洗脫率與吸附劑、洗脫溶劑、保留體積、 流速等因素都有關，一般可達90%~%。

相關資料：

1、固相萃取柱（英文, 簡稱SPE column，或Solid Phase extraction Cartridges，簡稱SPE cartridges）是從層析柱發展而來的一種用於萃取、分離、濃縮的樣品前處理裝置。

2、原理：

固相萃取（Solid Phase Extraction，SPE）技術基於液相色譜原理，可近似看作一個簡單的色譜過程。原理是利用固體吸附劑將液體樣品中的目標化合物吸附，與樣品的基體和干擾化合物分離，然後再用洗脫液洗脫或加熱解吸附，達到分離和富集目標化合物的目的。固相萃取可分為在線萃取和離線萃取。前者萃取與色譜分析同步完成，而後者萃取與色譜分析分步完成，兩者在原理上是一致的。

3、固相萃取柱的使用

最簡單的固相萃取可以通過手工方式完成，即在固相萃取柱上端連接一個器，通過對器的擠壓將萃取柱內的液體排擠出萃取柱。另外，也可以使用正壓或負壓固相萃取裝置對批量樣品進行固相萃取操作。隨著科技的發展和樣品數量的增多，越來越多的分析實驗室開始使用自動固相萃取儀，特別是多通道固相萃取儀對批量樣品進行處理。

4、萃取步驟

1. 柱預處理（柱活化）

2. 用適當的溶劑淋洗SPE 柱，以使吸附劑保持濕潤，可以吸附目標化合物或干擾化合物。不同模式固相萃取小柱活化用的溶劑不同，其目的有2 個：一是除去填料中可能存在的雜質；二是使填料溶劑化，提高固相萃取的重現性。

3. 2. 上樣

4. 將液態或溶解後的固態樣品倒入預處理後的SPE 柱，然後利用抽真空、加壓或離心的方法使樣品通過SPE柱，在該步驟中，分析物被保留在吸附劑上。

5. 3. 淋洗和洗脫

6. 樣品進入SPE柱、目標化合物被吸附後，視分離模式和樣品性質而定，可採用適當的洗脫劑將目標化合物直接淋洗下來；也可先將干擾化合物淋洗掉，再用適當的洗脫劑將目標化合物洗脫，通常採用後一種方法更有利於樣品的凈化。淋洗和洗脫同上所述，可採用抽真空、加壓或離心的方法使淋洗液或洗脫液流過吸附劑。

7. 5、影響因素

8. 1) 吸附劑

9. 目前常用的吸附劑有正、反相吸附劑、離子交換吸附劑和抗體鍵合吸附劑等，試驗時盡量選擇與目標化合物極性相似的吸附劑，其用量大小與目標物性質（極性、揮發性）及其在水樣中的濃度直接相關。

10. 2) 洗脫溶劑

11. 在SPE中，洗脫溶劑的選擇與目標物性質及使用的吸附劑有關，樓蔓藤等給出了常見有機溶劑的極性和洗脫強度，試驗過程中可根劇被測物的物理、化學性質選用。洗脫劑體積應以淋洗完全為前提，體積最小的為最佳，可通過多次洗脫法（小體積），根據回收率的變化曲線找到最佳的洗脫液體積，顯然，洗脫體積越小富集倍數越高。

12. 3) 保留體積

13. 在加樣過程中，保留體積是SPE 技術的關鍵因素之一，它代表了進行痕量富集時能有效處理的水樣體積。根據色譜分析儀的最小檢出量和水樣中有機物的濃度，可以估算出欲富集的最小水樣體積。另外，樣液的pH 值也影響樣品的吸附效率。

14. 4) 流速

15. 流速的控制對SPE至關重要，流速過大將引起SPE柱的穿漏，流速太小則處理速度太慢。柱預處理過程中流速適中，保證溶液充分濕潤吸附劑即可，上樣和洗脫過程則要求流速盡量慢些，以使分析物盡量保留在柱內或達到完全洗脫，否則會導致分析物流失，影響回收率的大小。尤其離子交換過程，進行比較緩慢，應採用較低的流速（0.5~2.0 mL/min）。
    

⑦ 固相萃取柱的固相萃取柱使用

固相萃取柱的使用
最簡單的固相萃取可以通過手工方式完成，即在固相萃取柱上端連接一個注射器，通過對注射器的擠壓將萃取柱內的液體排擠出萃取柱。另外，也可以使用正壓或負壓固相萃取裝置對批量樣品進行固相萃取操作。隨著科技的發展和樣品數量的增多，越來越多的分析實驗室開始使用自動固相萃取儀，特別是多通道固相萃取儀對批量樣品進行處理。

⑧ 固相萃取柱的使用方法圖示

最簡單的固相萃取可以通過手工方式完成，即在固相萃取柱上端連接一個注射器，通過對注射器的擠壓將萃取柱內的液體排擠出萃取柱。另外，也可以使用正壓或負壓固相萃取裝置對批量樣品進行固相萃取操作。隨著科技的發展和樣品數量的增多，越來越多的分析實驗室開始使用自動固相萃取儀，特別是多通道固相萃取儀對批量樣品進行處理。

⑨ 固相萃取柱的介紹

固相萃取柱（英文, 簡稱SPE column，或Solid Phase extraction Cartridges，簡稱SPE cartridges）是從層析柱發展而來的一種用於萃取、分離版、濃縮的權樣品前處理裝置。主要應用於各種食品、農畜產品、環境樣品以及生物樣品中目標化合物的樣品前處理。固相萃取技術已經被廣泛地使用在許多國標（GB/T）以及行業分析標准中。固相萃取柱的容量是指固相萃取柱填料的吸附量。對於以硅膠為基質的固相萃取柱，其容量一般在1~5 mg/100 mg，也就是柱容量是填料質量的1%~5%。而鍵合硅膠離子交換吸附劑填料的容量以meq/g表示，即每克填料的容量為X毫克當量。這類填料的容量通常在0.5~1.5 meq/g。