抗體陽離子交換常用的緩沖液

1. 生物制葯純化段用哪些化學品

1、抗體：（1）澄清目前我們最常用的的技術方法是離心和深層過濾。在實驗室級別的樣品制備和純化，從效率和經濟成本方面考慮，通常會使用離心的方法去除細胞和大部分顆粒碎片。在大規模的情況下一般使用深層過濾，相比較離心，深層過濾在大規模發酵料液的處理過程中效率更高，對設備要求較低（與離心機比較），並且目前市面上復合材料的深層過濾器具有去除HCP和DNA等雜質的效果。因此不同情況下應選擇不同的方案。（2）親和深層過濾之後，在絕大部分情況下會使用親和層析。親和層析是應用生物高分子與配基可逆結合的原理，將配基通過共價鍵牢固結合於載體上而製得的層析系統。這種可逆結合的作用主要是靠生物高分子對它的配基的空間結構的識別。Protein A由於其與抗體Fc片段良好的特異親和性，較高的純化倍數，工藝的簡易性而被用於大多數抗體純化工藝中的捕獲階段。親和層析的填料價格較為昂貴，因此親和層析可能需要設計通過幾次循環層析來捕獲這一批產品的目標蛋白。在這里要考慮和平衡好時間長短和經濟成本的影響。時間太長，對上樣液中目標蛋白的穩定性不利；循環次數太低，填料需求量太大，生產成本會提高。（3）離子交換層析離子交換層析有陰離子層析和陽離子層析。依據蛋白的酸鹼性，極性，所帶陰陽離子的不同。電荷不同的物質，對填料上的離子交換劑有不同的結合和力，改變沖洗液的離子強度和pH值，物質就能依次從層析柱中分離出來。這兩種層析根據蛋白的特性來選擇結合或者穿透模式進行純化。其中，往往會有一個離子交換層析主要用來分離目標蛋白中的酸性、中性和鹼性組份；另一個離子交換層析用於少量雜質，如：HCP、DNA、內毒素等物質的分離。（4）疏水層析疏水層析從分離純化生命物質的機制來看，也屬於吸附層析一類，利用固定相載體上偶聯的疏水性配基與流動相中的一些疏水分子發生可逆性結合而進行分離。該方法基於的是蛋白質的疏水差異，在高鹽溶液中，蛋白質會與疏水配基相結合，而其他的雜蛋白則沒有此種性質，利用此種性質，可以將蛋白質進行分離。在某些單抗純化的工藝中會用到疏水層析。疏水層析在去除多具體、DNA、HCP和內毒素等雜志方面都有很好的效果。但要注意的是，這種層析方法往往緩沖液條件比較極端（鹽濃度很高，硫酸銨濃度甚至可以達到2摩爾）因此對一些蛋白可能會產生不利的影響。另外，由於疏水層析洗脫下的目標蛋白可能會含有較高的鹽濃度，在超濾換液的過程中會需要更多的換液次數和體積。（5）超濾和換液超濾的原理：以膜兩側的壓力差為驅動力，以超濾膜為過濾介質，在一定的壓力下，；當料液流過膜表面時，超濾膜表面密布的許多細小的微孔只允許小分子物質通過而成為透過液，而料液中體積大於膜表面微孔徑的物質則被截留在膜的進液側，成為濃縮液，因而實現對蛋白的純化、分離和濃縮的目的。最後還可以通過不斷置換蛋白液中的緩沖體，達到換液的效果。單抗的超濾除了選擇超濾膜包之外，還可以選擇中空纖維柱。但行業中基本都是選擇超濾膜包。雖然兩者各有優勢，但卻選擇超濾膜包，其中很大的一個原因是超濾膜包的耐壓能力比中空纖維強（超濾膜包8bar，中空纖維3bar），精純後的單抗往往穩定性比較好，所以選擇超濾膜包似乎更加合適。2、重組蛋白（1）菌體收集菌體收集一般有離心和中空纖維兩種方法。離心收集菌體，一般會用管式離心機；中空纖維收集菌體則是通過中空纖維的過濾，進行菌體的收集。收集菌體我們往往首先想到的是離心，但是放大無疑是離心機的軟肋。中空纖維有開放式的通道，能夠處理高固含量（菌體發酵液）、高粘度（菌體裂解液）和剪切力敏感型樣品（質粒），並且具有良好的線性放大能力。因此推薦選擇中空纖維，具體見後面的菌體洗滌步驟的描述。在這一步如果是收集和洗滌大腸桿菌，推薦使用透過孔徑為500、750KD 或 0.1、0.2um 的 1 mm 內徑的中空纖維（2）洗滌菌體菌體在收集之後，因為在過程中菌體和很多雜質都被一同收集了，所以之後有必要進行洗滌，把大量的顆粒、可溶或不可溶的雜質去除掉。這樣可以減少在後續純化中的雜質；另一方面，因為去除了大量的酶，因此對產品的活性也會有一定的保護作用。菌體洗滌主要有兩種方法。第一種方法，前一步驟收集的菌體用合適的緩沖液把菌體混懸在洗滌的Tank中，進行洗滌。然後讓菌體自然沉降，之後再置換菌體洗滌液混懸。以上步驟重復2~3次，之後收集沉降的菌體液，進行離心。第二種方法，中空纖維。如果菌體收集時使用的是離心法，則需要用合適的緩沖液把菌體混懸在洗滌的Tank中，之後一邊攪拌防止菌體沉降，一邊置換洗滌液。如果之前是用中空纖維收集的菌體，則可以在之前的設備上繼續操作，置換和洗滌菌體。因此在大規模菌體收集和洗滌的應用中，我會優先選擇中空纖維，一套設備多種用處。中空纖維無論在成本、能耗、人力、時間、場地等方面都有很大的優勢。除此之外在粗純的過程中，中空纖維還有出色的應用。（3）破菌破菌主流的方法有：高壓勻漿機破菌 和 菌體裂解—鹼裂解。高壓勻漿機破菌：個人認為，高壓勻漿機破軍效率較低，對設備要求較高，破菌之前還要把菌體做相應比例的稀釋和混懸，破菌過程中噪音大，能耗也較高。但其一直是比較成熟且可靠的破菌方法，一直在被行業使用。鹼裂解：鹼裂解法由於具有操作簡便、重復性好等優點,已成為目前最為廣泛應用的破菌方法，但是一些蛋白在鹼裂解的過程中容易失活，因此要做評估和實驗比較。除此之外還有使用細菌溶解酶破菌，如果使用這個方法，在產品的檢測項目中要加入殘留檢測。（4）粗純與單抗相比，微生物破菌後，其雜質負荷非常高，很難直接使用深層過濾的方法進行處理，所以粗純方法很不相同。當破菌完成後，料液不推薦直接上色譜，因為雜質含量太高會影響層析的的解析度，降低了目標蛋白的載量，並且還可能損害樹脂的再生。粗純可以用萃取的方法，如PEG沉澱、硫酸銨沉澱或硫酸鈉沉澱等方法。如果目標蛋白是在沉澱中，則在沉澱之前還有必要進行離心去除微生物碎片。因此在規模越大的純化中這種方法越難操作。我們推薦中空纖維進行粗純，中空纖維還可以有效去除細胞碎片。之後再用更小孔徑的中空纖維進行換液，可以有效去除RNA、色素和部分 HCP、HCD 等雜質，以減少層析階段的負荷並且可以濃縮樣品，減小上樣的體積和時間。注意：在菌體收集、洗滌、粗純的過程中，超濾膜包不可替代中空纖維。雖然兩者都是切向流，但兩者的結構設計還是有很大的不同，粘稠的料液容易堵死超濾膜包。相比而言，中空纖維的設計更適合處理高粘度且固體含量高的樣品。（5）精純如果目標蛋白本身帶有標簽，則可以考慮使用親和填料。比如帶有His標簽的蛋白，我們可以用Ni親和填料進行純化。但如果蛋白不帶標簽，則可以考慮使用離子交換、疏水層析以及其他層析方式進行精純。精純的層析往往需要2步甚至3步，這里不詳述。在這里我們要注意的一點是：重組蛋白與單抗相比，往往不太穩定，容易失活和沉降，在開發過程中要尤為注意到這點。（6）超濾超濾參考單抗。3、病毒樣顆粒：病毒樣顆粒（VLP）是與病毒極為相似的分子，但由於它們不含病毒遺傳物質而具有非傳染性。它們可以是天然存在的，也可以通過病毒結構蛋白的單獨表達而合成，然後可以自組裝成病毒樣結構。來自不同病毒的衣殼蛋白的組合可用於創建重組VLP。這幾年大家談論最多的病毒樣顆粒產品有HPV疫苗，除此之外，還有HFMV等疫苗。VLP可以在多種細胞培養系統中產生，包括細菌，哺乳動物細胞系，昆蟲細胞系，酵母和植物細胞。我們就以酵母胞內表達的產品為例，因為酵母胞內表達的產品通常純化比較具有挑戰性。如果要了解動物細胞表達的純化方法，可以參考後面「慢病毒純化」的內容。（1）菌體收集、洗滌菌體、破菌、粗純這幾部分可以參照前面重組蛋白純化的方法，但在這要注意的是，中空纖維的選擇因菌體的不同，選型要有所調整。舉個例子：果是收集和洗滌的是大腸桿菌，推薦使用透過孔徑為500、750KD 或 0.1、0.2um 的 1 mm 內徑的中空纖維，如果微生物是酵母，則推薦使用通過孔徑為0.45 um、0.65 um或1 um的中空纖維進行菌體的收集和清洗。（2）精純VLP與單抗和重組蛋白相比，其分子量要大很多，顯微鏡下一般在20~100納米之間，它的穩定性較差。純化過程中應盡量選擇溫和的條件，否則VLP容易出現在形狀不規則、不均一或殘缺的情況。精純一般有1~3個步層析和超濾換液組成（根據產品的質量要求而定）。常規的層析組合如下：離子交換層析：捕獲VLP，一般離子交換層析對VLP的載量都不高（10mg/ml左右）。分子篩復合填料：如Core 700（根據VLP的大小進行選擇），以穿透的模式進一步純化。它比傳統的分子篩純化有著巨大的優勢，第一，載量大。甚至可以一次性上樣相當於10倍以上柱體積的樣品。第二，它具有吸附小分子雜質的作用（根據填料型號不同，吸附雜質大小的上限也不同），可以進一步去除DNA、HCP、內毒素、VLP碎片等雜質。疏水層析：可以去除一些不規則或者聚集的VLP，以及其他微量雜質。但疏水層析條件比較劇烈，可能會對對產品有有著負面影響。（3）超濾與超濾膜包相比，中空纖維剪切力更低。VLP對剪切力的耐受力較低，建議使用剪切力小的中空纖維，起到降低對產品的負面影響。如果可以去掉超濾步驟則更好。4、慢病毒純化目前慢病毒培養的的主流是貼壁細胞和懸浮細胞（動物細胞）。（1）澄清過濾無論是貼壁細胞還是懸浮細胞，發酵液中都會存在一些細胞、顆粒和脂質體，因此有必要進行澄清過濾。慢病毒的澄清過濾一般不推薦使用深層過濾膜包，因為深層過濾膜包容易把病毒一同去除掉。可以嘗試使用中空纖維或囊式濾器進行過濾，如：0.45μm孔徑，收集透過液。之後的精純可以根據產品的情況進行模塊組合，一般有：濃縮、離子交換層析、分子篩，以上的模塊組合不分先後，根據產品情況決定。最後超濾換液。下面我們闡述。濃縮或換液，有些公司的產品病毒表達量較低，或者產品中的培養基和者其他雜質很有必要在層析之前去掉，那麼就有必要加入濃縮或換液這個步驟。用中空纖維把料液超濾濃縮，之後換液成下一步層析的上樣緩沖溶液。慢病毒對剪切力的耐受力較低，使用超濾很容易降低病毒的收率，建議使用剪切力小的中空纖維，起到降低對產品的負面影響。離子交換層析，分子篩復合填料，可以參考之前VLP的描述。

2. 在對凝血因子fviii作離子交換層析時，所用緩沖液為什麼要添加枸櫞酸鈉

檸檬酸鈉在食品、飲料工業中用作風味劑、穩定劑；在醫葯工業中用作抗血凝劑、專化痰葯和利尿葯；在洗滌劑工屬業中，可替代三聚磷酸鈉作為無毒洗滌劑的助劑；在化學上是優良的螯合劑/絡合劑,在工業上對檸檬酸鈉的應用都是利用此一特性。還用於釀造、注射液、攝影葯品和電鍍等。
檸檬酸鈉是目前最重要的檸檬酸鹽，主要由澱粉類物質經發酵生成檸檬酸，再跟鹼類物質中和而產生，具有以下優良性能：(1)安全無毒性能。由於制備檸檬酸鈉的原料基本來源於糧食，因而絕對安全可靠，對人類健康不會產生危害。聯合國糧農與世界衛生組織對其每日攝入量不作任何限制，可認為該品屬於無毒品。（2）具有生物降解性。檸檬酸鈉經自然界大量的水稀釋後，部分變成檸檬酸，兩者共存於同一體系中。

3. ph值測定常用的標准緩沖溶液有哪幾種

草酸鹽標准緩沖溶液
酒石酸鹽標准緩沖溶液
苯二甲酸氫鹽標准緩沖溶液
磷酸鹽標准緩沖溶液
硼酸鹽標准緩沖溶液
氫氧化鈣標准緩沖溶液

4. 過離子交換柱時，pH梯度洗脫緩沖液一般用什麼緩沖液

如果不限定純化方法，可以考慮親和層析或離子交換，但根據你問題的意思，是選定離子交內換。
此時就容要考慮你蛋白的等電點了，如果等電點在你穩定pH之上，就用陽離子交換柱：
設計陽離子交換層析：將你的樣品置換到你所指的穩定pH的running buffer。同時裝柱，平衡，然後上樣，平衡，洗脫（因為你的pH不穩定，建議鹽洗脫），收峰。得你的蛋白；
如果你的等電點在穩定pH之下，就用陰離子交換柱，其步驟如上，只是改變柱子類型。

5. 常用蛋白質提取緩沖液有哪些

1.SDS:強烈,可以把疏水性蛋白也充分提取出來,如膜蛋白
2.尿素:有膜蛋白的損失
3.RIPA:用於磷酸化蛋白的溫和裂解,不破壞磷酸基團

6. 包被抗體為什麼要用偏鹼性的緩沖液

需要，第一步即用包被液稀釋抗原，4°C包被過夜。包被液為碳酸鹽緩沖液：碳酸氫鈉 2.93g；碳酸鈉1.59g 配成水溶液1L，PH=9.6；4°C保存。

7. 用離子交換法純化蛋白如何選定緩沖液

也可以用AEC，主要以流穿模式做。sspxiaoji(站內聯系TA)用陽離子交換柱，可以考慮pH6.0-7.0的緩沖液，因內為容大部分蛋白質的等電點在這附近，帶電荷少，這樣容易穿透除去其他雜蛋白。而你的目的蛋白PI在11，掛柱應該比較牢固。但是有個問題需要注意，PH離你的目標蛋白PI太遠，有可能導致掛柱後難以洗脫。

8. 如何選擇離子交換層析的離子交換劑和緩沖液

這個就要看你要純化的樣品的具體性質來定啦，如果是處於摸索條件的間斷，可以嘗試最常用的Tris緩沖液。。

9. 單克隆抗體的純化技術操作步驟

從培養液或腹腔積液獲得的單克隆抗體，不需要純化即可應用於日常診斷或定性研究。如果用於免疫標記測定，須分離和純化。可用半飽和、飽和硫酸銨進行沉澱，進行初步濃縮和純化；可用親和層析法進一步純化。

一、腹水型單抗的純化

在單抗純化之前，一般均需對腹水進行預處理，目的是為了進一步除去細胞及其殘渣、小顆粒物質、以及脂肪滴等。常用的方法有二氧化硅吸附法和過濾離心法，以前者處理效果為佳，而且操作簡便。

1、二氧化硅吸附法

新鮮採集的腹水（或凍存的腹水），2000r/min 15分鍾，除去細胞成分（或凍存過程中形成的固體物質）等；取上層清亮的腹水，等量加入PH7.2巴比妥緩沖鹽水（VBS；0.004mol/L巴比妥，0.15mol/L NaCl，0.8mmol/L Mg2+，0.3mmol/L Ca2+）稀釋；然後以每10ml稀釋腹水中加150mg二氧化硅粉末，混勻，懸液在室溫孵育30分鍾，不時搖動；2000g離心20分鍾，脂質等通過該法除去，即可得澄清的腹水。

2、過濾離心法

用微孔濾膜過濾腹水，以除去較大的凝塊及脂肪滴；用10000g 15分鍾高速離心（4℃）除去細胞殘渣及小顆粒物質。

3、混合法

即上述兩法的組合，先將腹水高速離心，取上清液再用二氧化硅吸附處理。

二、單抗的粗提

1、硫酸銨沉澱法

（1）飽和硫酸銨溶液的配製

500g硫酸銨加入500ml蒸餾水中，加熱至完全溶解，室溫過夜，析出的結晶任其留在瓶中。臨用前取所需的量，用2mol/L NaOH調PH至7.8。

（2）鹽析

吸取10ml處理好的腹水移入小燒杯中，在攪拌下，滴加飽和硫酸銨溶液5.0ml；繼續緩慢攪拌30分鍾；10000r/min離心15分鍾；棄去上清液，沉澱物用1/3飽和度硫酸銨懸浮，攪拌作用30分鍾，同法離心；重復前一步1-2次；沉澱物溶於1.5ml PBS（0.01mol/L PH7.2）或Tris-HCl緩沖液中。

（3）脫鹽

常用柱層析或透析法。柱層析法是將鹽析樣品過Sephadex G-50層析柱，以PBS或Tris-HCl緩沖液作為平衡液和洗脫液，流速每分鍾1ml。第一個蛋白峰即為脫鹽的抗體溶液。透析法是將透析袋於2% NaHCO3，1mmol/L EDTA溶液中煮10分鍾，用蒸餾水清洗透析袋內外表面，再用蒸餾水煮透析袋10分鍾，冷至室溫即可使用（並可於0.2mol/L EDTA溶液中，4℃保存備用）。將鹽析樣品裝入透析袋中，對50-100倍體積的PBS或Tris-HCl緩沖液透析（4℃）12-24小時，其間更換5次透析液，用萘氏試劑（碘化汞11.5g，碘化鉀8g，加蒸餾水50ml，待溶解後，再加20% NaOH 50ml）檢測，直至透析外液無黃色物形成為止。

（4）蛋白質含量的測定

（Pr）（mg/ml）=（1.45×OD280-0.74×OD260）×稀釋倍數；或（Pr）=OD280×稀釋倍數/1.3

（5）分裝凍存備用

2、辛酸-硫酸銨沉澱法

該法簡單易行，適合於提純IgG1和IgG2b，但對IgG3和IgA的回收率及純化效果差。其主要步驟如下：取1份預處理過的腹水加2份0.06mol/L PH5.0醋酸緩沖液，用1mol/L HCl調PH至4.8；按每毫升稀釋腹水加11ul辛酸的比例，室溫攪拌下逐滴加入辛酸，於30分鍾內加完，4℃靜置2小時，取出15000g離心30分鍾，棄沉澱；上清經尼龍篩過濾（125um），加入1/10體積的0.01mol/L PBS，用1mol/L NaOH調PH至7.2；在4℃下加入飽和硫酸銨至45%飽和度，作用30分鍾，靜置1小時；10000g離心30分鍾，棄上清；沉澱溶於適量PBS（含137mmol/L NaCl，2.6mol/L KCl，0.2mmol/L EDTA）中，對50-100倍體積的PBS透析，4℃過夜，其間換水3次以上；取出10000g離心30分鍾，除去不溶性沉渣，測定蛋白質含量後，分裝，凍存備用。

3、優球蛋白沉澱法

該法適用於IgG3和IgM型單抗的提取，所獲製品的抗體活性幾乎保持不變，對IgG3單抗的回收率高於90%，對IgM單抗的回收率為40-90%不等。其操作步驟如下：取一定量的預處理過的腹水，先後加入NaCl和CaCl2，使各自的濃度分別達0.2mol/L和25mmol/L，隨之可見纖維蛋白的產生；經濾紙過濾後，濾液對100倍體積的去離子水透析，4℃ 8-15小時（若是IgG3單抗，也可室溫2小時），其間換水1-2次；取出後22000g離心30分鍾，棄上清；將沉澱溶於PH8.0 1mol/L NaCl，0.1mol/L Tris-HCl溶液中，重復上述的透析與離心；將沉澱的優球蛋白濃度調至5-10mg/ml，分裝凍存備用。

三、單抗純化的方法

單抗純化的方法有很多種，應根據具體單抗的特性和實驗條件選擇適宜的方法，常用的技術有DEAE離子交換層析柱、凝膠過濾法和親和層析法三種。

1、離子交換層析：

分離蛋白質是根據在一定pH 條件下，蛋白質所帶電荷不同而進行的分離方法。常用於蛋白質分離的離子交換劑有弱酸型的羧甲基纖維素(CM纖維素) 和弱鹼型的二乙基氨基乙基纖維素(DEAE纖維素)。前者為陽離子交換劑，後者為陰離子交換劑。

離子交換層析中，基質是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱之陰離子交換樹脂；而帶有負電荷的稱之陽離子樹脂。離子交換層析同樣可以用於蛋白質的分離純化。由於蛋白質也有等電點，當蛋白質處於不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質，所以這類蛋白質被留在柱子上，然後通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質洗脫下來。結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質，結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來

2、凝膠過濾法：

一定型號的凝膠網孔大小一定，只允許相應大小的分子進入凝膠顆粒內部，大分子則被排阻在外。洗脫時，大分子隨洗脫液從顆粒間隙流下來，洗脫液體積小，小分子則在顆粒網狀結構中穿來穿去，歷程長，後洗脫下來，洗脫體積大。

缺點：從凝膠過濾的原理可知，蛋白質分子通過凝膠柱的速度(即洗脫體積的大小)並不直接取決於分子的質量，而是它的斯篤克半徑，利用凝膠過濾法測定蛋白質分子量時，標准蛋白質(已知分子量和斯篤克半徑)和待測蛋白質必須具有相同的分子形狀(接近球體)，否則不能得到比較准確的分子量。分子形狀為線形的或與凝膠能發生吸附作用的蛋白質，則不能用此方法測定分子量。而且柱子成本比較高，整個實驗過程耗時很長。

3、免疫親和層析法：

是利用生物體內存在的抗原、抗體之間高度特異性的親和力進行分離的方法。親和層析的應用主要是生物大分子的分離、純化。利用抗原、抗體之間高特異的親和力而進行分離的方法又稱為免疫親和層析。例如將抗原結合於親和層析基質上，就可以從血清中分離其對應的抗體。在蛋白質工程菌發酵液中所需蛋白質的濃度通常較低。

用離子交換、凝膠過濾等方法都難於進行分離，而親和層析法則是一種非常有效的方法。將所需蛋白質作為抗原，經動物免疫後制備抗體，將抗體與適當基質偶聯形成親和吸附劑，就可以對發酵液中的所需蛋白質進行分離純化。

10. 什麼是緩沖溶液常用的有什麼

緩沖溶液（英文：buffer solution）是一種能在加入少量酸或鹼和水時大大減低pH變動的溶液。pH緩沖系統對維持生物的正常pH值和正常生理環境起到重要作用。

常用作緩沖溶液的酸類

由弱酸及其共軛酸鹽組合成的溶液具有緩沖作用。生化實驗室常用的緩沖系主要有磷酸、檸檬酸、碳酸、醋酸、巴比妥酸、Tris（三羥甲基氨基甲烷）等系統，生化實驗或研究工作中要慎重地選擇緩沖體系，因為有時影響實驗結果的因素並不是緩沖液的pH值，而是緩沖液中的某種離子。如硼酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽和三羥甲基甲烷等緩沖劑都可能產生不需要的化學反應。
硼酸鹽：硼酸鹽與許多化合物形成復鹽、如蔗糖。
檸檬酸鹽：檸檬酸鹽離子容易與鈣結合，所以存在有鈣離子的情況下不能使用。
磷酸鹽：在有些實驗，它是酶的抑止劑或甚至是一個代謝物，重金屬易以磷酸鹽的形式從溶液中沉澱出來。而且它在pH7.5以上時緩沖能力很小。
三羥甲基氨基甲烷：它可以和重金屬一起作用，但在有些系統中也起抑製作用。其主要缺點時溫度效應。這點往往被忽視，在室溫pH是7.8的Tris緩沖液，4℃時是8.4，37℃時是7.4，因此，4℃配製的緩沖液在37℃進行測量時，其氫離子濃度就增加了10倍。在pH7.5以下，其緩沖能力極為不理想。