凝膠過濾層析法測定蛋白質分子量實驗報告

A. 凝膠層析法為什麼能測出蛋白質的分子量原理是什麼

原理簡單說就是分子量不同通過凝膠柱的速度也不同

凝膠是一種具有多孔,網狀結構的分子篩.利用這種凝膠分子篩對大小,形狀不同的分子進行層析分離,稱凝膠層析 .
凝膠層析的應用范圍:
凝膠層析法適用於分離和提純蛋白質,酶,多肽,激素,多糖,核酸類等物質.分子大小彼此相差25%的樣品,只要通過單一凝膠床就可以完全將它們分開.利用凝膠的分子篩特性,可對這些物質的溶液進行脫鹽,濃縮,去熱源和脫色.
凝膠層析的優點
凝膠層析具有設備簡單,操作方便,分離迅速及不影響分子生物學活性等優點.目前已被廣泛應用於各種生化產品的分離和純化.
-,凝膠層析的基本原理
凝膠層析的原理
l 分子大小不同混合物上柱; 2 洗脫開始,小分子擴散進人凝膠顆粒內,大分子被排阻於顆粒之外;3 大小分子分開: 4大分子行程較短,已洗脫出層析柱,小分子尚在進行中
凝膠是一類多孔性高分子聚合物,每個顆粒猶如一個篩子.當樣品溶液通過凝膠柱時,相對分子質量較大的物質由於直徑大於凝膠網孔而只能沿著凝膠顆粒間的孔隙,隨著溶劑流動,因此流程較短,向前移動速度快而首先流出層析柱;反之,相對分子質量較小的物質由於直徑小於凝膠網孔,可自由地進出凝膠顆粒的網孔,在向下移動過程中,它們從凝膠內擴散到膠粒孔隙後再進入另一凝膠顆粒,如此不斷地進入與逸出,使流量增長,移動速率慢而最後流出層析柱.而中等大小的分子,它們也能在凝膠顆粒內外分布,部分進入顆粒,從而在大分子物質與小分子物質之間被洗脫.這樣,經過層析柱,使混合物中的各物質按其分子大小不同而被分離.

B. 為什麼用凝膠過濾層析法可測定蛋白質相對分子質量

凝膠過濾層析，即分子篩

C. 實驗室測定蛋白質分子量的方法有哪些

測定蛋白質分子量的常用方法：

粘度法、凝膠過濾層析法、凝膠滲透色譜法、SDS-凝膠電泳、滲透壓法、質譜法包括電噴霧離子化質譜技術和基質輔助激光解吸電離質譜技術、光散射法（多角度激光散射）、沉降法（超速離心法）。

1、粘度法

一定溫度條件下，高聚物稀溶液的粘度與其分子量之間呈正相關性，隨著分子量的增大，聚合物溶液的粘度增大。通過測定高聚物稀溶液粘度隨濃度的變化，即可計算出其平均分子量(粘均分子量)。

如果高聚物分子的分子量愈大，則它與溶劑間的接觸表面也愈大，摩擦就大，表現出的特性粘度也大。特性粘度和分子量之間的經驗關系式為：

8、電噴霧離子化質譜技術

電噴霧離子化質譜技術（ESI-MS）是在毛細管的出口處施加一高電壓，所產生的高電場使從毛細管流出的液體霧化成細小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發，液滴表面的電荷強度逐漸增大，最後液滴崩解為大量帶一個或多個電荷的離子，致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進入氣相的質譜技術。ESI-MS 測定蛋白質大分子是根據一簇多電荷的質譜峰群，通過解卷積的方式計算得到蛋白質的分子量，由於ESI-MS可以產生多電荷峰，因此使得測試的分子質量范圍大大擴大。

優缺點：（1）對樣品的消耗少，不會造成樣品的大量浪費；（2）對樣品分子質量測試靈敏度、分辨力和准確度都相當高；（3）能夠方便地與多種分離技術聯用，如毛細管電泳、高效液相色譜等，是解決非揮發性、熱不穩定性、極性強的復雜組分化合物的定性定量的高靈敏度檢測方法。

9、基質輔助激光解吸電離質譜技術

基質輔助激光解吸電離質譜技術（MALDI-MS）是將待測物懸浮或溶解在一個基體中，基體與待測物形成混晶，當基體吸收激光的能量後，均勻傳遞給待測物，使待測物瞬間氣化並離子化。基體的作用在於保護待測物不會因過強的激光能量導致化合物被破壞。MALDI的原理是用激光照射樣品與基質形成的共結晶薄膜，基質從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過程中將質子轉移到生物分子或從生物分子得到質子，而使生物分子電離的過程。TOF的原理是離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據到達檢測器的飛行時間不同而被檢測即測定離子的質荷比（M/Z）與離子的飛行時間成正比，檢測離子。

優缺點：（1）同ESI-MS 一樣對樣品的消耗很少；（2）隨著質量分析器的不斷改進、新的基質的不斷發現和應用以及延遲萃取技術的使用，使得MALDI-MS 的最高解析度不斷提高，甚至超過ESI-MS；（3）MALDI-MS 單電荷峰佔主要部分，碎片峰少，非常有利於對復雜混合物的分析，且能忍受較高濃度的鹽、緩沖劑和其他難揮發成分，降低了對樣品預處理的要求；（4）MALDI-TOF 質譜對生物大分子分子量的測定范圍是所有測試技術中最廣的。

D. 測定蛋白質分子量的常用方法

蛋白定量的測試方法有很多種，其中較為常見的有五種，分別是Bradford法、Bradford斑點試驗、Coomassie 斑點試驗、紫外分光度檢測法及BCA法這五種。

在生化實驗中，對樣品中的蛋白質進行准確可靠的定量分析，是經常進行的一項非常重要的工作。蛋白質是一種十分重要的生物大分子，它的種類很多，結構不均一，分子量又相差很大，功能各異，這樣就給建立一個理想而又通用的蛋白質定量分析的方法帶來了許多具體的因難。

(4)凝膠過濾層析法測定蛋白質分子量實驗報告擴展閱讀

蛋白定量分析也就涉及到生產科研的多個領域及行業，也是生物學科、食品檢驗及摻假摻偽、臨床檢驗、診斷疾病和質量檢驗中最常見的方法。

蛋白定量是生物學實驗不可缺少的一部分。為驗證細胞裂解是否成功，或為了將多個樣品進行平行實驗比較或標准化保存，需對細胞裂解液進行蛋白定量。

為了判定蛋白的產量，需對純化好的蛋白進行定量。為了將純化好的蛋白用生物素或者報告酶進行標記，同樣需首先對蛋白樣品進行定量，以保證標記反應在適當的化學濃度下進行。

E. SDS-PAGE和分子篩過濾層析測定蛋白質分子量在原理和方法上有何不同。

sds分離靠的是在電場中蛋白質分子跟page的結合後的分子量大小從而在凝膠中跑的速度不同而分開的。

分子篩是根據不同分子量的分子大小不同,從而進行蛋白質分離,達到測量分子量的目的的。

SDS-PAGE：聚丙烯醯胺凝膠電泳，作用：用於分離蛋白質和寡核苷酸。

作用原理：聚丙烯醯胺凝膠為網狀結構，具有分子篩效應。它有兩種形式：非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳（Native-PAGE）和SDS-聚丙烯醯胺凝膠（SDS-PAGE）；非變性聚丙烯醯胺凝膠，在電泳的過程中，蛋白質能夠保持完整狀態，並依據蛋白質的分子量大小、蛋白質的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開。

而SDS-PAGE僅根據蛋白質亞基分子量的不同就可以分開蛋白質。該技術最初由shapiro於1967年建立，他們發現在樣品介質和丙烯醯胺凝膠中加入離子去污劑和強還原劑（SDS即十二烷基硫酸鈉）後，蛋白質亞基的電泳遷移率主要取決於亞基分子量的大小（可以忽略電荷因素）。

F. 用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳測定蛋白質的分子量，為什麼有時和凝膠層析法所得結果有所不同

兩種方法原理不同，有差異是正常的。如果差距較大，要仔細分析。
一般凝膠層析是非變性的，SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳是變性的，二硫鍵也被還原，所以是亞基（肽鏈）分子量。
凝膠層析與分子形狀有關，一般marker都是球狀蛋白，所以測球狀蛋白分子量較准