⑴ 雙向電泳過程中電壓上不去需要停止聚焦嗎
第一向的伏特小時數過量
延長聚焦時間不一定能提高解析度。實際上，它可能引起水平條紋。一些蛋白樣品更易聚焦，因此必須對每個樣品類型及每種緩沖液獨立開展伏特小時數的優化，以確定穩態的IEF模式。
第一向的不完全聚焦
不完全聚焦也會引起水平條紋(Rabiloud 2000)。確保總的伏特小時數適用於所使用IPG膠條的長度和pH范圍。聚焦不止一種樣品類型，或同時聚焦不同pH范圍的IPG膠條(即在同一個聚焦盤中)常常被忽視，但也是其中一個樣品不完全聚焦的可能解釋。IEF槽設定了整個盤的總電流限制。如果某個樣品導電性較好，它將吸引大部分電流，減慢了托盤中其他蛋白樣品的聚焦。這導致不完全聚焦和水平條紋的出現。因此，電導率相差很大的樣品應當單獨運行。
蛋白過載
上樣到IPG膠條上的蛋白總量通常取決於膠條的長度以及觀察結果所使用的染料(詳見下表)。某些情況需要更多考慮，如某個蛋白佔了總蛋白的大部分。血清白蛋白就是如此，它佔了血清總蛋白的70-90%。因此，將建議量的蛋白上樣可能使其他許多蛋白無法顯示，因為它們被白蛋白所遮蓋。在這些情況下，抑制通過上樣更多蛋白來補償的沖動 – 這可能使水平條紋變得更糟。相反，利用Aurum™ Affi-Gel® Blue mini columns去除血清白蛋白，隨後將建議量的蛋白上樣。
在杯上樣時將太多蛋白上樣到樣品杯中，或使用IPG膠條進行預運行，都會導致高蛋白載量，從而使蛋白聚集。這會導致某一蛋白在等電點(pI沉降)沉澱，並引起水平條紋。略微提高IPG膠條的溶脹體積(~10%)可能使聚焦改善。下文關於使用還原-烷基化及更強去垢劑的建議也能幫助減少蛋白之間的相互作用，從而解決一些問題。
表. 樣品上樣到IPG膠條的指南。
IPG膠條長度
7 cm
11 cm
17 cm
18 cm
24 cm
每個膠條的溶脹體積
125 μl
185 μl
300 μl
315 μl
410 μl
蛋白載量
銀染
5-20 μg
20-50 μg
50-80 μg
50-80 μg
80-150 μg
考馬斯亮藍G-250
50-100 μg
100-200 μg
200-400 μg
200-400 μg
400-800 μg
樣品制備問題
離子凈電荷的任何污染將影響等電聚焦，並引起水平條紋(Rabiloud，2000)。常見的污染包括鹽、去垢劑、肽段、核酸、脂類和酚醛化合物。以極低電壓運行時(PROTEAN® IEF槽的默認值為50 μA/膠條)，若IEF的目標電流很早就達到，則離子污染也很明顯。如果設定的伏特小時數不足以去除離子污染並實現蛋白的平衡聚焦，那麼較低電壓會導致IEF運行延長和水平條紋的出現。有時，這可能導致IPG膠條過熱或燃燒。解決問題的最簡單辦法是降低蛋白樣品的離子強度。如果您知道問題在於樣品中的鹽，那麼試試脫鹽柱或透析。Bio-Rad的ReadyPrep™ 2-D cleanup kit能夠去除大部分離子污染和鹽。
一些帶電荷的去垢劑，如SDS，能夠包被蛋白，並徹底改變它們的凈電荷，最終影響它們的等電點，導致條紋出現以及IPG膠條中樣品的損失。
樣品的核酸污染也會導致水平條紋的出現(Görg 1997)。許多蛋白與核酸結合，產生了蛋白-核酸的混合物，每個都有著不同的等電點。在等電聚焦之前用核酸酶處理樣品，可去除樣品中的核酸(Garfin and Heerdt 2000)。或者，在精胺存在時通過超速離心也可去除核酸(Rabiloud 1996)。
包含唾液酸且帶負電荷的多糖也能產生與核酸類似的水平條紋。不帶電荷的多糖通過阻塞凝膠孔，阻礙樣品進入IPG膠條，以及在物理上阻止聚焦，而導致條紋出現。超速離心通常足以去除碳水化合物。
此外，多肽的氨甲醯化也能使個別蛋白產生電荷異質性，盡管在某些條件下常常形成離散的斑點串 – 正如使用寬pH梯度一樣 – 但斑點間的彌散也可能存在。蛋白樣品應當使用高純度尿素制備，切勿加熱至30°C以上。
樣品制備方面導致水平條紋的最後一個原因是二硫鍵形成(Walsh 1998)。在雙向電泳之前，若蛋白樣品中存在二硫鍵，則它們是隨機存在於分子 內部或分子之間的。二硫鍵形成產生了多種蛋白構象，包括較小的pI變體(在雙向凝膠上顯示為單個蛋白點的變寬)以及同一蛋白的多聚物(以點、幻影點、缺失點的條紋尾和拖尾出現)。防止二硫鍵的形成能避免這些假象。二硫鍵假象在兩種情況下特別成問題：1)鹼性蛋白的分析，及2)較長IPG膠條的使用。因二硫鍵形成而造成的水平條紋可利用ReadyPrep rection-alkylation kit結合IPG膠條的杯上樣(Bio-Rad bulletin 4006216)來減少。
蛋白溶解度差
未能徹底溶解樣品中的所有蛋白將引起水平條紋。雙向電壓中所使用的標准樣品緩沖液中的主要組分是尿素、非離子去垢劑(如NP-40)或兩性去垢劑(如CHAPS)及還原劑(如DTT)。此混合物中包含的其他組分，如硫脲(Rabiloud 1998)或新型去垢劑，特別是氨基硫代甜菜鹼家族中的那些(如ASB-14)(Rabiloud 1996)也能改善膜蛋白的溶解性。這些試劑的綜合作用是通過更好地溶解蛋白的疏水區域以及減少因蛋白中的氫鍵或與IPG凝膠基質的相互作用而產生的聚集。另外，在IEF前通過離心去除不溶蛋白也是一種好的做法，能防止它們干擾其他蛋白進入凝膠基質。
電滲流
作為鹼性蛋白等電聚焦時的主要問題，電滲流也能引起水平條紋，因為水從陰極運輸到陽極。水流可減慢蛋白向相反方向遷移，導致聚焦不完全。此外，IPG膠條在陰極端的脫水可縮小凝膠的孔大小，導致蛋白遷移減慢和聚焦不完全。脫水還能導致蛋白聚集，從而形成水平條紋。這個問題的解決方案包括用新鮮水浸泡過的芯取代陰極的紙芯，向溶脹/樣品溶液中加入有機改性劑，如甘油、異丙醇或甲基纖維素(Görg 1997)。