超濾怎麼驗證內毒素

1. 細菌內毒素檢查方法是否必須做驗證

細菌內毒素的檢測必須進行驗證方可用於產品驗證，因每一個產品的所使用的細菌內毒素限值勻不一樣，故須進行驗證確定產品的細菌內毒素限值。並確定產品的最終稀釋倍數。

2. 熱原的檢查方法

由於家兔對熱原的反應與人基本相似，家兔法為各國葯典規定的檢查熱原的法定方法。
《中國葯典》2005年版規定的熱原檢查法系將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內，在規定時間內，觀察家兔體溫升高的情況，以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規定。
檢查結果的准確性和一致性取決於試驗動物的狀況、試驗室條件和操作的規范性。家兔法檢測內毒素的靈敏度為0.001μg/ml,試驗結果接近人體真實情況，但操作繁瑣費時，不能用於注射劑生產過程中的質量監控，且不適用於放射性葯物、腫瘤抑制劑等細胞毒性葯物制劑。 細菌內毒素檢查法系利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產生的細菌內毒素，以判斷供試品中細菌內毒素的限量是否符合規定的一種方法．細菌內毒素的量用內毒素單位（EU）表示。
細菌內毒素檢查包括凝膠法和光度測定法兩種方法，前者利用鱟試劑與細菌內毒素產生凝集反應的原理來檢測或半定量內毒素，後者包括濁度法和顯色基質法，系分別利用鱟試劑與內毒素反應過程中的濁度變化及產生的凝固酶使特定底物釋放出呈色團的多少來測定內毒素。
鱟試劑法檢查內毒素的靈敏度為0.0001μg/ml,比家兔法靈敏10倍，操作簡單易行，試驗費用低，結果迅速可靠，適用於注射劑生產過程中的熱原控制和家兔法不能檢測的某些細胞毒性葯物制劑，但其對革蘭陰性菌以外的內毒素不靈敏，鱟試劑法尚不能完全代替家兔法。
熱原除去方法
（一）除去葯液中熱原的方法
1、活性炭吸附法：即在配液時加入0.1-0.5%（溶液體積）的針用一級活性炭，煮沸並攪拌15分鍾，即能除去大部分熱原，而且活性炭還有脫色、助濾、除臭作用。但活性炭也會吸附部分葯液，故使用時應過量投料，但小劑量葯物不宜使用。
2、離子交換法：熱原在水溶液中帶負電，可被陰樹脂所交換，但樹脂易飽和，須經常再生。
3、凝膠過濾法：凝膠為一分子篩，利用熱原與葯物分子量的差異，將兩者分開。但當兩者分子量相差不大時，不宜使用。
4、超濾法：超濾膜的膜孔僅為3.0-15nm，故可有效去除葯液中的細菌與熱原。
（二）除去器具上熱原的方法
1、酸鹼法：因熱原能被強酸、強鹼或強氧化劑等破壞，所以玻璃容器、用具及輸液瓶等均可使用重鉻酸鉀硫酸清潔液浸泡以破壞熱原。
2、高溫法：注射用針頭、針筒及玻璃器皿等，先洗滌潔凈烘乾後，再在180℃加熱2小時或250℃加熱30分鍾以上處理破壞熱原。
（三）除去溶媒中熱原的方法
1、蒸餾法：利用熱原的不揮發性來制備注射用水，但熱原又具有水溶性，所以蒸餾器要有隔沫裝置，擋住霧滴的通過，避免熱原進入蒸餾水中。
2、反滲透法：用醋酸纖維素膜和聚醯胺膜制備注射用水可除去熱原，與蒸餾法相比，具有節約熱能和冷卻水的優點。

3. 內毒素去除方法

注射用水內毒素超標的因素有三個：1、注射用水管道受污染：2、注射用水管道不密封：3、出水口污染未清洗干凈

4. 細菌內毒素精密過濾器有什麼要求

精密過濾是採用成型的濾材，原液通過濾材，濾渣留在濾材壁上，濾液透回過濾材流出，從答而達到過濾的目的。成型的濾材有：濾布、濾網、濾片、燒結濾管、線繞濾芯、熔噴濾芯、微孔濾芯及多功能濾芯。因濾材的不同，過濾孔徑也不相同。保安精密過濾是介於砂濾（粗濾）與超濾之間的一種過濾，過濾孔徑一般在0.1-120μm范圍。同種形式的濾材，按外形尺寸又分為不同的規格。
過濾細菌內毒素對精密過濾器的要求主要在濾芯精度上，常規精密過濾器精度在5μm，細菌內毒素精密過濾器要求精度需要小於5μm，因此需要選擇對應精度的濾芯，具體濾芯精度和濾芯材質的選擇需要參考水質參數。

5. 成品三批都需要做細菌和內毒素的方法學驗證嗎

每批次成品復都需要做細菌制和內毒素的方法學驗證
細菌內毒素檢查法在葯品的熱原限量控制中應用廣泛，通過對無菌氯化鈉溶液、配套葯盒和成品的細菌內毒素檢測，對生產過程進行質量控制。因此對細菌內毒素檢驗方法的驗證就顯得尤為重要。
參考文件 中國葯典2010年版二部附錄XI E

6. 氫氧化鈉為什麼不用檢測細菌內毒素

[摘要] 目的：建立新葯的細菌內毒素檢查方法。方法：採用鱟試驗檢查法對新葯中的細菌內毒素進行檢查。結果：介紹了如何建立新葯的細菌內毒素檢查方法，重點是細菌內毒素檢查限值的確認以及如何進行干擾試驗。結論：細菌內毒素檢查法為新葯的質量控制以及應急檢驗提供了有益的基礎。

[關鍵詞] 新葯；細菌內毒素檢查法；干擾試驗
[中圖分類號] R927.12 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-7210（2011）11（b）-159-03

How to establish the method of bacterial endotoxin test for new drugs
XIAO Guinan, SUN Qingping, SHENG Yingmei
Guangdong Institute for Drug Control in Guangdong Province, Guangzhou 510180, China
[Abstract] Objective: To establish the method of bacterial endotoxin test for new drugs. Methods: Tachepleus amebocyte lysate test was applied to detect bacterial endotoxins in new drugs. Results: How to establish the method of bacterial endotoxin test for new drugs was introced, and especially focused on how to define the limit of bacterial endotoxins and carry out the interference test. Conclusion: Bacterial endotoxin test provides useful bases in quality control and emergency test for new drugs.
[Key words] New drugs; Bacterial endotoxin test; Interference test

新葯以細菌內毒素檢查方法代替既往的家兔熱原檢查法是一個趨勢，在葯害事件的應急處理中有一定的應用價值，這也符合國際上對動物實驗的「3R」原則（優化、減少、替代）的要求。現行細菌內毒素檢查方法是1968年美國科學家Levin和Bang所建立的鱟試驗法[1]。從開展內毒素檢查的現狀來看，部分單位未能參照《中國葯典》2011年版二部的要求進行實驗和設計，本文著重介紹在建立新葯細菌內毒素檢查法中容易出現問題的細菌內毒素限值的確定及干擾試驗這兩個環節，力圖為新葯的質量控制以及應急檢驗提供有益的參考依據。
1 新葯細菌內毒素檢查限值的確認
1.1 細菌內毒素檢查限值的計算公式
新葯細菌內毒素檢查限值（L）的確定是整個方法學建立的前提和基礎，現在一般按照《中國葯典》2011版二部附錄XI E進行確定[2]。計算公式為L=K/M，K為人每千克體重每小時最大可接受的內毒素劑量，以EU/（kg?h）表示，非放射性注射劑K=5 EU/（kg?h），放射性注射劑K=2.5 EU/（kg?h），鞘內用注射劑K=0.2 EU/（kg?h）；M為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量，成人體重按60 kg計算，體表面積為1.62 m2。部分抗腫瘤葯物及抗生素的使用劑量以體表面積描述時，可將每平方米體表面積劑量乘以0.027，即可轉換為每千克體重劑量。
1.2 細菌內毒素檢查限值的確認程序
首先根據所研究的新葯品種說明書，通過查閱最新版《臨床用葯須知》等相關權威資料，得到人用每千克體重每小時的最大供試品劑量（M值）並求出L值，將所求得的L值與相關的質量標准（《美國葯典》、《英國葯典》、《日本葯局方》、《歐洲葯典》）以及國家食品葯品監督管理局頒布的轉正標准或注冊標准散件中關於該品種的細菌內毒素限值進行參考對比。
還有一種方法是參考該品種的熱原檢查劑量（可視為M值），因為熱原劑量的設置一般為成人臨床用量的1～3倍，與常用的安全系數3～10倍較為接近，這種參考熱原檢查劑量的做法在以前頗為盛行，現在已逐漸少用。
1.3 細菌內毒素限值計算的常見誤區
1.3.1 將成人日均用量誤作最大用量 大多數情況下，說明書或資料往往只提供了某葯的單次或每日用量，實踐中不少人往往將單次用量誤作最大用量進行限值計算，所得限值明顯偏寬。眾所周知，除極少數情況（急性、重症患者用葯）下的單次用量可作為最大用量外，多數情況的日常用量換算成最大用量，還需考慮一定的安全系數（一般取3～10倍）。
1.3.2 誤將每日總用量當成每次最大用量 只根據說明書或資料提供的某葯的每日總用量，未考慮該葯品總量的靜脈滴注時間已經遠不止1 h，這樣求得的限值難於真實反映實際限值，因為M值是反映人用每千克體重每小時能接受的最大供試品劑量，而非全日的總用量。
1.3.3 對於大輸液的細菌內毒素限值確定過於按部就班 沒有考慮大輸液的特殊要求，大輸液的主葯成分只佔其中很少的一部分，實際多為葡萄糖注射液或生理鹽水注射液，如果按主葯成分計算細菌內毒素限值的話，容易偏寬，因而如無特殊情況一般將熱原檢查劑量10 ml/kg視為最大臨床用量，將大輸液細菌內毒素限值定為0.5 EU/ml。
1.3.4 忽視滴注時帶入的外源性細菌內毒素 某些新葯在臨床使用時是溶於大輸液進行滴注的。假設某抗生素葯品的規格是1 g/支，其使用方法是溶於5%葡萄糖注射液250 ml，在1 h內滴注完畢。可參照下述方法計算該抗生素細菌內毒素限值，此時K=5 EU/（kg?h），因而60 kg的成人每小時體內可以接受細菌內毒素的最大量為300 EU，而在1 h內250 ml的5%葡萄糖注射液最大可帶來125 EU的細菌內毒素，1 g的該葯最多隻能帶入175 EU（125～300 EU）的細菌內毒素，因而該抗生素其細菌內毒素限值可定為0.175 EU/mg。如果按常規計算的話，求得限值為0.300 EU/mg。
1.3.5 沒有考慮到主葯外的其他成分 在細菌內毒素限值的確定過程中，特別是原料，要注意扣除主葯外的其他成分（如金屬離子：頭孢噻肟鈉中的鈉，西司他丁鈉中的鈉），因為標准一般規定為每毫克中頭孢噻肟或西司他丁所含的細菌內毒素量不得過多少EU，而製成的原料往往是含鈉等其他成分的。
2 鱟試劑靈敏度復核試驗
2.1 前期准備工作
試驗所用的器皿需經處理，以去除可能存在的外源性內毒素。若使用塑料器械，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應選用標明無內毒素並且對試驗無干擾的器械。耐熱器皿常用乾熱滅菌法（250℃，30 min以上）去除，部分物品也可採用其他確證不幹擾細菌內毒素檢查的適宜方法（如強酸強鹼浸泡法），但需經過確證不幹擾鱟試驗檢查。
2.2 靈敏度復核試驗

當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發生了任何可能影響檢驗結果的改變時，應進行鱟試劑靈敏度復核試驗。需要注意的是，當實測靈敏度λc在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ～2.0λ，λ為鱟試劑靈敏度的標示值）時，方可用於細菌內毒素檢查，並以標示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度，日常檢驗中部分檢驗者誤將實測的靈敏度作為批鱟試劑的靈敏度來進行常規檢查或干擾試驗。
3 鱟試驗檢查的干擾試驗
3.1 最大有效稀釋倍數（MVD）的確認
MVD是指在試驗中供試品溶液被允許達到稀釋的最大倍數，計算公式為MVD=C?L/λ，式中L為供試品的內毒素限值，λ為鱟試劑的標示靈敏度（EU/ml），或是在光度測定法中所使用的標准曲線上最低的內毒素濃度；C為供試品液的濃度，當L以EU/ml表示時，則C等於1.0；如供試品為注射用無菌粉末或原料葯，則MVD取1，可計算供試品的最小有效稀釋濃度C=λ/L。
此處往往根據市售主要的鱟試劑靈敏度范圍（0.03～1.00 EU/ml）來計算干擾試驗中的有效濃度稀釋范圍。
3.2 干擾預試驗
取本品1支（原料精密稱取不低於10 mg的量），按照擬定內毒素限值，原料或注射用粉針加內毒素檢查用水溶解並稀釋至不超過MVD規定的系列濃度，注射液直接稀釋至不超過最小有效稀釋濃度的系列濃度，預試驗時一般可取一個廠家靈敏度為0.125 EU/ml或0.250 EU/ml的鱟試劑，對供試品原液及其系列稀釋液（供試品陰性對照，NPC）進行干擾檢驗，另外設立陽性對照（PC）、陰性對照（NC）、供試品陽性對照（PPC），每個濃度平行做兩管，最終得出供試品（批號：20110802）在某濃度及以下濃度對鱟試驗檢查不產生干擾作用（PPC首次出現「++」的濃度）的結論。供試液的干擾預試驗結果，見表1。
由表1可以看出，供試品在不高於20 mg/ml的濃度下不幹擾鱟試驗的檢查。
3.3 正式干擾試驗
按表2制備各系列溶液，使用的供試品溶液應為未檢驗出內毒素且不超過MVD的溶液，參照鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作，記錄供試液的干擾情況。

只有當供試品溶液和陰性對照溶液的平行管都為陰性，且鱟試劑標示靈敏度的對照系列溶液的結果在鱟試劑靈敏度范圍內時，試驗方為有效，計算系列鱟試劑標示靈敏度的對照系列溶液和干擾試劑系列溶液的反應終點濃度的幾何平均值（Es和Et）。當Es在0.5λ～2.0λ及Et在0.5Es～2.0Es時，認為供試品在該濃度下無干擾作用。若供試品溶液在小於MVD的稀釋倍數下對試驗有干擾，應將供試品溶液進行不超過MVD的進一步稀釋，再重復干擾試驗。
當進行新葯的內毒素檢查試驗前或無內毒素檢查項的品種建立內毒素檢查法時，須進行干擾試驗；當鱟試劑、供試品的處方、生產工藝改變或試驗環境中發生了任何有可能影響試驗結果的變化時，須重新進行干擾試驗。
4 排除供試液干擾的方法[3]
4.1 樣品稀釋法
選用較高靈敏度的鱟試劑，將供試品進一步稀釋（低於最大有效稀釋倍數）後進行干擾試驗，一般情況下大部分的干擾作用均能得到有效控制。
4.2 調節pH法
測定供試液的pH值，若不在鱟試劑的有效緩沖pH范圍（6.0～8.0），可選用一定濃度的HCl或NaOH將pH值調節至6.0～8.0，但要注意應進行方法學驗證（干擾試驗），確保不幹擾鱟試驗檢查，且對內毒素檢查結果無影響。
4.3 超濾法
通過專用超濾系統，將影響內毒素檢查的葯物小分子雜質濾除，內毒素則留存於濾器內，濾器內加入相應的內毒素檢查用水進行檢查，可在幾乎不影響內毒素濃度的前提下盡量避免小分子葯物的干擾作用。
4.4 其他方法
微溫保持加熱法；使用去G因子鱟試劑或廠家提供的專用抗增液對樣品進行稀釋（此時須進行干擾試驗）。
5 常規檢查
使用最大有效稀釋倍數（MVD） 並且已經排除干擾的供試品溶液來制備溶液供試品溶液和供試品陽性對照溶液，進行細菌內毒素的常規檢測。
6 討論
建立新葯品種的細菌內毒素檢查法，首先要結合臨床最大用量確定其細菌內毒素限值，應用兩個廠家的鱟試劑對3批樣品進行鱟試驗檢查（普通凝膠法或動態濁度法定量試驗），如結果能證實樣品在不低於最大有效稀釋濃度時對細菌內毒素檢查無干擾作用，且樣品的細菌內毒素常規檢查結果為陰性，此時方可建立該品種的細菌內毒素檢查法[4-7]。
根據臨床最大用量規定及實驗結果，將所研究的新葯細菌內毒素限值定為每毫克主葯（或每毫升）中含內毒素的量應小於若干EU。經干擾實驗確證，該新葯在某個濃度或低於該濃度時（但不低於最大有效稀釋濃度MVC）對細菌內毒素檢查無干擾作用。取本品3批，按擬定的標准檢驗，其內毒素檢查結果均符合規定。

7. 超濾 能否去除 熱源，內毒素之類的

那就要看產品選擇的超濾膜是什麼樣的型號了。
一般比較好的超濾，會選擇膜透過回孔徑為5000道爾頓，這樣的膜答能絕對去除微生物、熱源、內毒素，因為這些雜質最小的也在20000以上。
但是有的產品超濾膜選擇20000道爾頓，這樣或多或少會有極少量的微生物物質遺漏。

8. 如何建立新葯的細菌內毒素檢查方法

[摘要] 目的：建立新葯的細菌內毒素檢查方法。方法：採用鱟試驗檢查法對新葯中的細菌內毒素進行檢查。結果：介紹了如何建立新葯的細菌內毒素檢查方法，重點是細菌內毒素檢查限值的確認以及如何進行干擾試驗。結論：細菌內毒素檢查法為新葯的質量控制以及應急檢驗提供了有益的基礎。

[關鍵詞] 新葯；細菌內毒素檢查法；干擾試驗
[中圖分類號] R927.12 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-7210（2011）11（b）-159-03

How to establish the method of bacterial endotoxin test for new drugs
XIAO Guinan, SUN Qingping, SHENG Yingmei
Guangdong Institute for Drug Control in Guangdong Province, Guangzhou 510180, China
[Abstract] Objective: To establish the method of bacterial endotoxin test for new drugs. Methods: Tachepleus amebocyte lysate test was applied to detect bacterial endotoxins in new drugs. Results: How to establish the method of bacterial endotoxin test for new drugs was introced, and especially focused on how to define the limit of bacterial endotoxins and carry out the interference test. Conclusion: Bacterial endotoxin test provides useful bases in quality control and emergency test for new drugs.
[Key words] New drugs; Bacterial endotoxin test; Interference test

新葯以細菌內毒素檢查方法代替既往的家兔熱原檢查法是一個趨勢，在葯害事件的應急處理中有一定的應用價值，這也符合國際上對動物實驗的「3R」原則（優化、減少、替代）的要求。現行細菌內毒素檢查方法是1968年美國科學家Levin和Bang所建立的鱟試驗法[1]。從開展內毒素檢查的現狀來看，部分單位未能參照《中國葯典》2010年版二部的要求進行實驗和設計，本文著重介紹在建立新葯細菌內毒素檢查法中容易出現問題的細菌內毒素限值的確定及干擾試驗這兩個環節，力圖為新葯的質量控制以及應急檢驗提供有益的參考依據。
1 新葯細菌內毒素檢查限值的確認
1.1 細菌內毒素檢查限值的計算公式
新葯細菌內毒素檢查限值（L）的確定是整個方法學建立的前提和基礎，現在一般按照《中國葯典》2010版二部附錄XI E進行確定[2]。計算公式為L=K/M，K為人每千克體重每小時最大可接受的內毒素劑量，以EU/（kg・h）表示，非放射性注射劑K=5 EU/（kg・h），放射性注射劑K=2.5 EU/（kg・h），鞘內用注射劑K=0.2 EU/（kg・h）；M為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量，成人體重按60 kg計算，體表面積為1.62 m2。部分抗腫瘤葯物及抗生素的使用劑量以體表面積描述時，可將每平方米體表面積劑量乘以0.027，即可轉換為每千克體重劑量。
1.2 細菌內毒素檢查限值的確認程序
首先根據所研究的新葯品種說明書，通過查閱最新版《臨床用葯須知》等相關權威資料，得到人用每千克體重每小時的最大供試品劑量（M值）並求出L值，將所求得的L值與相關的質量標准（《美國葯典》、《英國葯典》、《日本葯局方》、《歐洲葯典》）以及國家食品葯品監督管理局頒布的轉正標准或注冊標准散件中關於該品種的細菌內毒素限值進行參考對比。
還有一種方法是參考該品種的熱原檢查劑量（可視為M值），因為熱原劑量的設置一般為成人臨床用量的1～3倍，與常用的安全系數3～10倍較為接近，這種參考熱原檢查劑量的做法在以前頗為盛行，現在已逐漸少用。
1.3 細菌內毒素限值計算的常見誤區
1.3.1 將成人日均用量誤作最大用量 大多數情況下，說明書或資料往往只提供了某葯的單次或每日用量，實踐中不少人往往將單次用量誤作最大用量進行限值計算，所得限值明顯偏寬。眾所周知，除極少數情況（急性、重症患者用葯）下的單次用量可作為最大用量外，多數情況的日常用量換算成最大用量，還需考慮一定的安全系數（一般取3～10倍）。
1.3.2 誤將每日總用量當成每次最大用量 只根據說明書或資料提供的某葯的每日總用量，未考慮該葯品總量的靜脈滴注時間已經遠不止1 h，這樣求得的限值難於真實反映實際限值，因為M值是反映人用每千克體重每小時能接受的最大供試品劑量，而非全日的總用量。
1.3.3 對於大輸液的細菌內毒素限值確定過於按部就班 沒有考慮大輸液的特殊要求，大輸液的主葯成分只佔其中很少的一部分，實際多為葡萄糖注射液或生理鹽水注射液，如果按主葯成分計算細菌內毒素限值的話，容易偏寬，因而如無特殊情況一般將熱原檢查劑量10 ml/kg視為最大臨床用量，將大輸液細菌內毒素限值定為0.5 EU/ml。
1.3.4 忽視滴注時帶入的外源性細菌內毒素 某些新葯在臨床使用時是溶於大輸液進行滴注的。假設某抗生素葯品的規格是1 g/支，其使用方法是溶於5%葡萄糖注射液250 ml，在1 h內滴注完畢。可參照下述方法計算該抗生素細菌內毒素限值，此時K=5 EU/（kg・h），因而60 kg的成人每小時體內可以接受細菌內毒素的最大量為300 EU，而在1 h內250 ml的5%葡萄糖注射液最大可帶來125 EU的細菌內毒素，1 g的該葯最多隻能帶入175 EU（125～300 EU）的細菌內毒素，因而該抗生素其細菌內毒素限值可定為0.175 EU/mg。如果按常規計算的話，求得限值為0.300 EU/mg。
1.3.5 沒有考慮到主葯外的其他成分 在細菌內毒素限值的確定過程中，特別是原料，要注意扣除主葯外的其他成分（如金屬離子：頭孢噻肟鈉中的鈉，西司他丁鈉中的鈉），因為標准一般規定為每毫克中頭孢噻肟或西司他丁所含的細菌內毒素量不得過多少EU，而製成的原料往往是含鈉等其他成分的。
2 鱟試劑靈敏度復核試驗
2.1 前期准備工作
試驗所用的器皿需經處理，以去除可能存在的外源性內毒素。若使用塑料器械，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應選用標明無內毒素並且對試驗無干擾的器械。耐熱器皿常用乾熱滅菌法（250℃，30 min以上）去除，部分物品也可採用其他確證不幹擾細菌內毒素檢查的適宜方法（如強酸強鹼浸泡法），但需經過確證不幹擾鱟試驗檢查。
2.2 靈敏度復核試驗

當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發生了任何可能影響檢驗結果的改變時，應進行鱟試劑靈敏度復核試驗。需要注意的是，當實測靈敏度λc在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ～2.0λ，λ為鱟試劑靈敏度的標示值）時，方可用於細菌內毒素檢查，並以標示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度，日常檢驗中部分檢驗者誤將實測的靈敏度作為批鱟試劑的靈敏度來進行常規檢查或干擾試驗。
3 鱟試驗檢查的干擾試驗
3.1 最大有效稀釋倍數（MVD）的確認
MVD是指在試驗中供試品溶液被允許達到稀釋的最大倍數，計算公式為MVD=C・L/λ，式中L為供試品的內毒素限值，λ為鱟試劑的標示靈敏度（EU/ml），或是在光度測定法中所使用的標准曲線上最低的內毒素濃度；C為供試品液的濃度，當L以EU/ml表示時，則C等於1.0；如供試品為注射用無菌粉末或原料葯，則MVD取1，可計算供試品的最小有效稀釋濃度C=λ/L。
此處往往根據市售主要的鱟試劑靈敏度范圍（0.03～1.00 EU/ml）來計算干擾試驗中的有效濃度稀釋范圍。
3.2 干擾預試驗
取本品1支（原料精密稱取不低於10 mg的量），按照擬定內毒素限值，原料或注射用粉針加內毒素檢查用水溶解並稀釋至不超過MVD規定的系列濃度，注射液直接稀釋至不超過最小有效稀釋濃度的系列濃度，預試驗時一般可取一個廠家靈敏度為0.125 EU/ml或0.250 EU/ml的鱟試劑，對供試品原液及其系列稀釋液（供試品陰性對照，NPC）進行干擾檢驗，另外設立陽性對照（PC）、陰性對照（NC）、供試品陽性對照（PPC），每個濃度平行做兩管，最終得出供試品（批號：20100802）在某濃度及以下濃度對鱟試驗檢查不產生干擾作用（PPC首次出現「++」的濃度）的結論。供試液的干擾預試驗結果，見表1。
由表1可以看出，供試品在不高於20 mg/ml的濃度下不幹擾鱟試驗的檢查。
3.3 正式干擾試驗
按表2制備各系列溶液，使用的供試品溶液應為未檢驗出內毒素且不超過MVD的溶液，參照鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作，記錄供試液的干擾情況。

只有當供試品溶液和陰性對照溶液的平行管都為陰性，且鱟試劑標示靈敏度的對照系列溶液的結果在鱟試劑靈敏度范圍內時，試驗方為有效，計算系列鱟試劑標示靈敏度的對照系列溶液和干擾試劑系列溶液的反應終點濃度的幾何平均值（Es和Et）。當Es在0.5λ～2.0λ及Et在0.5Es～2.0Es時，認為供試品在該濃度下無干擾作用。若供試品溶液在小於MVD的稀釋倍數下對試驗有干擾，應將供試品溶液進行不超過MVD的進一步稀釋，再重復干擾試驗。
當進行新葯的內毒素檢查試驗前或無內毒素檢查項的品種建立內毒素檢查法時，須進行干擾試驗；當鱟試劑、供試品的處方、生產工藝改變或試驗環境中發生了任何有可能影響試驗結果的變化時，須重新進行干擾試驗。
4 排除供試液干擾的方法[3]
4.1 樣品稀釋法
選用較高靈敏度的鱟試劑，將供試品進一步稀釋（低於最大有效稀釋倍數）後進行干擾試驗，一般情況下大部分的干擾作用均能得到有效控制。
4.2 調節pH法
測定供試液的pH值，若不在鱟試劑的有效緩沖pH范圍（6.0～8.0），可選用一定濃度的HCl或NaOH將pH值調節至6.0～8.0，但要注意應進行方法學驗證（干擾試驗），確保不幹擾鱟試驗檢查，且對內毒素檢查結果無影響。
4.3 超濾法
通過專用超濾系統，將影響內毒素檢查的葯物小分子雜質濾除，內毒素則留存於濾器內，濾器內加入相應的內毒素檢查用水進行檢查，可在幾乎不影響內毒素濃度的前提下盡量避免小分子葯物的干擾作用。
4.4 其他方法
微溫保持加熱法；使用去G因子鱟試劑或廠家提供的專用抗增液對樣品進行稀釋（此時須進行干擾試驗）。
5 常規檢查
使用最大有效稀釋倍數（MVD） 並且已經排除干擾的供試品溶液來制備溶液供試品溶液和供試品陽性對照溶液，進行細菌內毒素的常規檢測。
6 討論
建立新葯品種的細菌內毒素檢查法，首先要結合臨床最大用量確定其細菌內毒素限值，應用兩個廠家的鱟試劑對3批樣品進行鱟試驗檢查（普通凝膠法或動態濁度法定量試驗），如結果能證實樣品在不低於最大有效稀釋濃度時對細菌內毒素檢查無干擾作用，且樣品的細菌內毒素常規檢查結果為陰性，此時方可建立該品種的細菌內毒素檢查法[4-7]。
根據臨床最大用量規定及實驗結果，將所研究的新葯細菌內毒素限值定為每毫克主葯（或每毫升）中含內毒素的量應小於若干EU。經干擾實驗確證，該新葯在某個濃度或低於該濃度時（但不低於最大有效稀釋濃度MVC）對細菌內毒素檢查無干擾作用。取本品3批，按擬定的標准檢驗，其內毒素檢查結果均符合規定。

9. 無菌原料葯細菌內毒素檢查法驗證K值確認應如何確認

根據將來原料葯製成的制劑的臨床用量來計算就可以了。如果已經有比較成熟的制劑，且也是用內毒素檢查法檢測的，原料葯可直接使用制劑的內毒素限值，很多抗生素就是這樣的。