親和樹脂成分

『壹』 為什麼要做gst-pulldown實驗

因為此方法簡單易行,操作方便。
GST pull-down實驗是一個行之有效的驗證酵母雙雜交系統的體外試驗技術,近年來越來越受到廣大學者的青睞。
其基本原理是將靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巰基轉移酶）融合蛋白親和固化在谷胱甘肽親和樹脂上,作為與目的蛋白親和的支撐物,充當一種「誘餌蛋白」,目的蛋白溶液過柱,可從中捕獲與之相互作用的「捕獲蛋白」(目的蛋白),洗脫結合物後通過SDS-PAGE電泳分析,從而證實兩種蛋白間的相互作用或篩選相應的目的蛋白,「誘餌蛋白」和「捕獲蛋白」均可通過細胞裂解物、純化的蛋白、表達系統以及體外轉錄翻譯系統等方法獲得。

『貳』 玻纖與酚醛樹脂的親和性好嗎

玻纖二氧化硅和酚醛以及環氧樹脂都能良好兼容，最常見就是各種電路板pcb和橙色電木為兩者混合物。表面改性時加入適量的硅烷偶聯劑能增大粘合強度。

『叄』 幾種常用的蛋白標簽的功能和優點

重組蛋白表達技術現已經廣泛應用於生物學各個具體領域。特別是體內功能研究和蛋白質的大規模生產都需要應用重組蛋白表達載體。上周小知了給大家簡單介紹了大腸桿菌原核表達的整體思路，這里給大家簡要介紹幾個常用的蛋白標簽及其功能和優點。

GST(谷胱甘肽巰基轉移酶) 標簽蛋白本身是一個在解毒過程中起到重要作用的轉移酶，它的天然大小為26KD。將它應用在原核表達的原因大致有兩個，一是因為它是一個高度可溶的蛋白，希望可以利用它增加外源蛋白的可溶性；另一個是它可以在大腸桿菌中大量表達，起到提高表達量的作用。

GST融合表達系統廣泛應用於各種融合蛋白的表達，可以在大腸桿菌和酵母菌等宿主細胞中表達。結合的融合蛋白在非變性條件下用10mM 還原型谷胱甘肽洗脫。

在大多數情況下，融合蛋白在水溶液中是可溶的，並形成二體。GST標簽可用酶學分析或免疫分析很方便的檢測。標簽有助於保護重組蛋白免受胞外蛋白酶的降解並提高其穩定性。在大多數情況下GST融合蛋白是完全或部分可溶的。

純化：該表達系統表達的GST標簽蛋白可直接從細菌裂解液中利用含有還原型谷胱甘肽瓊脂糖凝膠(Glutathionesepharose)親和樹脂進行純化。GST標簽蛋白可在溫和、非變性條件下洗脫，因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。GST在變性條件下會失去對谷胱甘肽樹脂的結合能力，因此不能在純化緩沖液中加入強變性劑如：鹽酸胍或尿素等。

如果要去除GST融合部分，可用位點特異性蛋白酶切除。

檢測：可用GST抗體或表達的目的蛋白特異性抗體檢測。

6×His是指六個組氨酸殘基組成的融合標簽，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。當某一個標簽的使用，一是能構成表位利於純化和檢測；二是構成獨特的結構特徵（結合配體）利於純化。組氨酸殘基側鏈與固態的鎳有強烈的吸引力，可用於固定化金屬螯合層析(IMAC)，對重組蛋白進行分離純化。

使用His-tag有以下幾個優點：

1.標簽的分子量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分別為~26KD和~30KD，一般不影響目標蛋白的功能；

2.His標簽融合蛋白可以在非離子型表面活性劑存在的條件下或變性條件下純化，前者在純化疏水性強的蛋白得到應用，後者在純化包涵體蛋白時特別有用，用高濃度的變性劑溶解後通過金屬螯和親和層析去除雜蛋白，使復性不受其它蛋白的干擾，或進行金屬螯和親和層析復性；

3.His標簽融合蛋白也被用於蛋白質-蛋白質、蛋白質-DNA相互作用研究；

4.His標簽免疫原性相對較低，可將純化的蛋白直接注射動物進行免疫制備抗體；

5.可應用於多種表達系統，純化的條件溫和；

6.可以和其它的親和標簽一起構建雙親和標簽。

MBP（麥芽糖結合蛋白）標簽蛋白大小為40kDa，由大腸桿菌K12的malE基因編碼。MBP可增加在細菌中過量表達的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。MBP標簽可通過免疫分析很方便地檢測。有必要用位點專一的蛋白酶切割標簽。如果蛋白在細菌中表達，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。

純化：融合蛋白可通過交聯澱粉親和層析一步純化。結合的融合蛋白可用10mM麥芽糖在生理緩沖液中進行洗脫。結合親和力在微摩爾范圍。一些融合蛋白在0.2% Triton X-100或0.25% Tween 20存在下不能有效結合，而其他融合蛋白則不受影響。 緩沖條件為pH7.0到8.5，鹽濃度可高達1M，但不能使用變性劑。如果要去除MBP融合部分，可用位點特異性蛋白酶切除。

檢測：可用MBP抗體或表達的目的蛋白特異性抗體檢測。

Flag標簽蛋白為編碼8個氨基酸的親水性多肽（DYKDDDDK），同時載體中構建的Kozak序列使得帶有FLAG的融合蛋白在真核表達系統中表達效率更高。

使用Flag標簽的優點：

FLAG作為標簽蛋白，其融合表達目的蛋白後具有以下優點：

1.FLAG作為融合表達標簽，其通常不會與目的蛋白相互作用並且通常不會影響目的蛋白的功能、性質，這樣就有利用研究人員對融合蛋白進行下游研究。

2.融合FLAG的目的蛋白，可以直接通過FLAG進行親和層析，此層析為非變性純化，可以純化有活性的融合蛋白，並且純化效率高。

3.FLAG作為標簽蛋白，其可以被抗FLAG的抗體識別，這樣就方便通過Western Blot、ELISA等方法對含有FLAG的融合蛋白進行檢測、鑒定。

4.融合在N端的FLAG，其可以被腸激酶切除（DDDK），從而得到特異的目的蛋白。因此現FLAG標簽已廣泛的應用於蛋白表達、純化、鑒定、功能研究及其蛋白相互作用等相關領域。

SUMO標簽蛋白是一種小分子泛素樣修飾蛋白（Small ubiquitin-likemodifier），是泛素(ubiquitin)類多肽鏈超家族的重要成員之一。

在一級結構上，SUMO與泛素只有18%的同源性，然而兩者的三級結構及其生物學功能卻十分相似。研究發現SUMO可以作為重組蛋白表達的融合標簽和分子伴侶，不但可以進一步提高融合蛋白的表達量，且具有抗蛋白酶水解以及促進靶蛋白正確折疊，提高重組蛋白可溶性等功能。

此外SUMO還有一項重要的應用，就是可用於完整地切除標簽蛋白，得到天然蛋白。因為SUMO蛋白水解酶能識別完整的SUMO標簽蛋白序列，並能高效地把SUMO從融合蛋白上切割下來。切除SUMO後，經過親和層析，去除標簽蛋白部分，就得到和天然蛋白一樣的重組蛋白。所以SUMO標簽也常用於和其他標簽一起應用，作為特異酶切水解位點。

C-Myc標簽蛋白，是一個含11個氨基酸的小標簽，標簽序列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu，這11個氨基酸作為抗原表位表達在不同的蛋白質框架中仍可識別其相應抗體。C-Myc tag已成功應用在 Western-blot雜交技術、免疫沉澱和流式細胞計量術中, 可用於檢測重組蛋白質在靶細胞中的表達。

分別是增強型綠色熒光蛋白/增強型黃綠色熒光蛋白/增強型黃綠色熒光蛋白/單體紅色熒光蛋白,具有不同的激發波長發射波長為，均由野生型熒光蛋白通過氨基酸突變和密碼子優化而來。

就eGFP而言，相對於GFP，其熒光強度更強、熒光性質更穩定。同時載體中構建的Kozak序列使得含有eGFP的融合蛋白在真核表達系統中表達效率更高。

mCherry是從DsRed演化來的性能最好的一個單體紅色熒光蛋白，可以和GFP系列熒光蛋白共用，實現多色標記體內、外實驗表明，mCherry在N端和C端融合外源蛋白時，熒光蛋白活性和被融合的目標蛋白功能相互沒有明顯影響。

蛋白標簽是指與目的蛋白一起融合表達的一種多肽或者蛋白，以便於目的蛋白的表達、檢測、示蹤和純化等。隨著技術的不斷發展，研究人員相繼開發出了具有各種不同功能的蛋白標簽。我們在選用不同標簽時要搞清楚自己的需求，靈活運用各個標簽。

『肆』 親和層析純化蛋白的步驟

親和層析是蛋白質純化技術，通過利用靶蛋白和配體之間的親和性進行分離和純化。以下是一般的親和層析純化蛋白的步驟：

准備親和樹脂：選擇適合的親和樹脂，其中含有與目標蛋白質特異結合的配體。常用的親和樹脂例如Ni-NTA樹脂（與帶有His標簽的蛋白質結合）、葡萄糖結合蛋白樹脂（與帶有葡萄糖結合域的蛋白質結合）等。根據實驗需要將親和樹脂進行准備和平衡。

樣品處理：將含有目標蛋白質的樣品進行預處理。預處理包括細胞裂解、蛋白質提取，以及對樣品的調節，例如對pH值、鹽濃度、緩沖液成分等的調節。

樣品載入：將經過預處理的樣品加到親和樹脂上，充分混勻和接觸。使樣品中的目標蛋白質與親和樹脂上的配體結合。

洗脫非特異結合物：用緩沖液洗脫樣品中的非特異結合物。通過選定適當的洗滌緩沖液，可以去除與親和樹脂上的配體結合不緊密的其他蛋白質和雜質。

洗脫目標蛋白質：通過改變條件或使用特定的洗脫劑，使目標蛋白質從親和樹脂上解離。洗脫劑的選擇應考慮到與目標蛋白質結合的強度，以及後續實驗對純度和活性的要求。

濃縮和儲存：將洗脫得到的目標蛋白質集中，並根據需要進行濃縮。根據實驗要求，可以選擇適當的方法如超濾、離心等。最後將純化得到的蛋白質在適當的緩沖液中儲存。

親和層析純化蛋白的具體步驟可能會因研究對象、目標蛋白質的性質以及實驗條件的不同而有所差異。因此，在進行親和層析純化前，建議參考相關文獻和技術手冊，以獲得更詳細和特定的步驟。