果蔬切片包埋劑環氧樹脂

A. 如何利用電鏡技術測定病毒粒體的特徵

隨著科學的發展，電鏡已成為一種綜合的分析儀器，在植物病毒的診斷和鑒定中發揮著重要作用。植物病毒學上用得較多的是透射電鏡。

1 透射電鏡的成像原理

顯微鏡的解析度與其使用光源的波長呈負相關，即波長越短分辨本領越大。可見光的波長范圍為0.4～0.7μm，它決定了光鏡的分辨極限為0.2μm，有效放大倍數不能超過2000倍。電鏡用的光源為電子槍產生的高速電子束，其波長比可見光短十萬倍以上，因而大大地提高了解析度。電鏡解析度接近0.lnm，有效放大倍數在百萬倍以上。

在電子顯微鏡下可觀察病毒粒體外形、大小以及在寄主細胞中的位置等。植物病毒粒子常見的有球形、長桿狀、線形和彈狀。

2 制樣技術

樣品處理技術多種多樣，適用於不同的材料和觀察目的。如金屬投影和復型技術，主要用於病毒或其他大分子的表面結構和大小觀察；冰凍蝕刻用於細胞化學、生物膜等研究；另外還有放射自顯影電鏡技術、免疫電鏡技術等。而植物病毒學上廣泛應用的是負染技術和超薄切片技術。負染制樣操作簡單，所需時間少；而超薄切片制樣方法操作復雜，所需時間長，但這種方法可以觀察到病毒粒子在組織中的情況。

2.1 負染技術

負染是相對正染而言的。是指在樣品的周圍包被高電子密度的染料，背景呈深色，而樣品呈白色，反襯出樣品的輪廓。病毒負染後能很清楚地看到其大小和細微結構。此法簡便、易行、快速，為病毒診斷提供了一種可靠手段。現在鑒定病毒，一般先用病汁液做負染觀察，根據看到的病毒的大小和形狀等，能為進一步研究提供許多有用信息，如採用什麼方法提純、病毒的分類地位如何等。其中有六個病毒屬的形態特徵非常典型，幾乎可以憑此特徵就能確定它們屬於哪個病毒科、屬，見表1。

表1 六個典型特徵病毒屬

pH調節用1mol/L HCl或1mol/L NaOH，而鉬酸銨用醋酸銨調，甲酸鈾用氫氧化銨調。

強大電子束的轟擊，是造成病毒變形和失去結構細節的另一重要原因，觀察時要採用盡量低亮度光斑，動作迅速，以減少轟擊時間。Forvmor膜等在電子束照射下，容易漂移，這樣病毒會被拉長或拉寬，因此，在測量病毒顆粒大小等精確觀察時，最好使用碳膜，或在Forvmor膜上加噴一層碳膜。

（5）病毒粒體大小測量 目前病毒學工作者已經注意到，同一病毒的大小不一樣，有些甚至相差甚遠。這可能是由於不同分離物或不同株系本身就不同，但大部分可能是由於實驗誤差或方法上的差別造成的。測量病毒大小，一般不宜提純病毒，而要用病株粗提液。因為病毒在提純過程中的形態結構，會由於提純過程中離子環境等的變化和物理因素的影響發生而變化。染色要用兩種以上染料，測量病毒顆粒的數量要盡量多，尤其是線狀病毒容易斷裂，數量應在100個以上。

2.2 超薄切片技術

根據電鏡成像原理可知，用於電鏡觀察樣品其厚度要求在數十納米，而通常單個細胞的厚度在數十微米，比要求厚度大100倍，而徒手切片或用於光鏡的切片機，其切片厚度一般在單個細胞水平，所以電鏡觀察必須做超薄切片。

超薄切片一般程序為：取材—固定—脫水—包埋—切片—染色—電鏡觀察。

（1）取材 取材要求典型、迅速，機械損傷小。材料切成1mm3大小，離體後1min之內進入固定液。應取不同寄主材料、同一寄主的不同組織和不同接種時期的樣品。

（2）固定 是用物理的或化學的方法迅速將細胞殺死，並且盡可能地使保存和固定細胞內各種結構、生物大分子生活時的狀態和位置。電鏡中常用的固定方法是化學固定。常用四氧化鋨、戊二醛、高錳酸鉀或重鉻酸鉀等固定劑。在病毒學中一般採用2%～3%戊二醛—1%～2%四氧化鋨（用0.2mol/LPBS，pH7.2配製）雙固定法，這樣細胞中的多種成分，如蛋白質、脂類、多糖、核酸等，大部分都能固定下來。戊二醛固定12～24h，四氧化鋨固定2～4h。戊二醛遇到鋨酸會形成沉澱，因此戊二醛固定後一定要用緩沖液充分清洗後再進行四氧化鋨固定。固定在超薄切片中很關鍵，固定液的種類、濃度、pH、滲透壓、離子組成、固定時間、溫度和方式都與固定的質量密切相關。因此，整個固定過程應該在4℃下進行。固定劑一定要用緩沖液配製。固定好的材料，電鏡下細胞內各種膜系統應該完整，沒有斷裂，雙層膜要基本平行，細胞質呈精細顆粒狀，沒有空白。固定後緩沖液要充分清洗後再進行下面的步驟。

（3）脫水 常用的包埋劑是疏水的，因此包埋前要用既親水又親脂的乙醇或丙酮進行脫水。從低濃度到高濃度的脫水劑脫水，最後用絕對無水的脫水劑脫水。

（4）包埋 包埋的目的是增強樣品的機械強度，使樣品具有一定的機械形狀，適於切片機工作；另一個重要作用是進一步固定細胞結構。包埋劑種類很多，有水溶性的，也有脂溶性的。常用的是Epon812等環氧樹脂。包埋過程中發生的化學反應，叫聚合過程。聚合過程中實際上發生了兩類反應，一類是環氧樹脂末端環氧基之間在胺類化合物（如DMP-30）催化下，化合生成長鏈；另一類是樹脂中間的羥基和交聯劑（也稱固定劑）的酸酐發生反應，生成橫向連橋，加固了樹脂分子之間的聯系。為了增強樹脂聚合形成的包埋塊的切割性能，常加入一些增塑劑，如樹脂、催化劑、固化劑。

（5）切片 准確、熟練地掌握切片機操作技術，包埋塊軟硬適度，修塊好，就能切出要求質量的片子來。這里技巧很重要。

（6）超薄切片的染色 也叫電鏡技術的正染色。觀察內容不一樣，採用染色方法不同，病毒內含體和細胞病理學研究則常用醋酸雙氧鈾—檸檬酸鉛染色法。切片在1%～2%醋酸雙氧鈾中染色20min，用50%乙醇沖洗後用檸檬酸鉛染色30min，0.01mol/L NaOH沖洗。染色的關鍵是要防止醋酸鈾和檸檬酸鉛生成沉澱。防止污染的主要措施是防止CO2和檸檬酸鉛反應。如用剛制備出的蒸餾水配製染料和沖洗劑，染色時在小室中進行，小室中放入吸收CO2的固體NaOH，防止人呼吸時CO2進入小室中，戴口罩等。染色和沖洗完畢，切片自然乾燥後就可以電鏡觀察。

電子顯微鏡的出現及各種電鏡技術的發展，為植物病毒的直接觀察起到了巨大的推動作用，使檢疫工作人員能得到受病毒感染的病毒粒子電鏡照片以作為直接證據。但電鏡觀察結果需要和其他方法的檢測結果相結合，才能確定病毒的分類地位。這是因為許多病毒都有類似的形態和結構。由於一些植物汁液中病毒濃度過低，在進行常規的電鏡觀察檢測中，很難發現病毒粒子，這樣就要求對一些植物病毒進行分離和提純，以便進行有效的電鏡觀察和其他理化檢測。病毒的分離和提純主要是採用差速離心、PEG沉澱的方法，進一步的純化則採用密度梯度離心和柱層析法。為了直接檢測植物體內的帶毒情況，常採用植物組織的超薄切片和電鏡觀察進行。超薄切片的電鏡觀察可以直接用於對植物組織內部的病毒形態、內含體形態、病毒所在的部位、受感染的植物組織發生的病理學變化等進行檢查。

B. 怎麼用電子顯微鏡觀察噬菌體

由於電鏡產生的電子束穿透能力很弱，必須把標本切成厚度小於0.1um以下的薄片才適用，這種薄片稱為超薄切片。常用的超薄切片厚度是50-70nm。

在透射電鏡的樣品制備方法中，超薄切片技術是最基本、最常用的制備技術。超薄切片的製作過程基本上和石蠟切片相似，需要經過取材、固定、脫水、浸透、包埋聚合、切片及染色等步驟。

一、 取材的基本要求

組織從生物活體取下以後，如果不立即進行適當處理，會由於細胞內部各種酶的作用，出現細胞自溶現象。此外，還可能由於污染，微生物在組織內繁殖使細胞的微細結構遭受破壞。因此，為了使細胞結構盡可能保持生活時的狀態，最好是在動物血流未斷之前進行,取材時必須要做到快、小、准、冷等四大要點：

快：即取材動作迅速，組織從活體取下後應在最短時間內 (爭取在1分鍾內) 投入2.5%戊二醛固定液。

小：所取組織的體積要小，一般不超過1mm×1mm×1mm。也可將組織修成1mm×1mm×2mm大小長條形。因為固定劑的滲透能力較弱，組織塊如果太大，塊的內部將不能得到良好的固定,從而影響細胞超微結構的保存。

冷：所用的固定液、操作工具要預先冷藏，操作時環境溫度最好在低溫(0℃～4℃)下進行，以降低酶的活性，防止細胞自溶。

准：取材部位要准確，即各組實驗動物必須取材在同一臟器的同一位置，這樣才能有較可信的比較。

此外，還要避免機械損傷，解剖器械應鋒利，在修小塊的時候最好用嶄新的剃須刀片，操作宜輕，避免牽拉、挫傷與擠壓，最好採用「雙刀拉鋸法」，具體操作如下：

將取出的組織放在潔凈的蠟板上（蠟板可以用病理切片石蠟融化在培養皿中冷卻後即可使用），滴幾滴預冷的固定液，用兩片新的、鋒利的刀片成「拉鋸式」將組織切下並修小，然後用牙簽或鑷子輕輕地將組織塊移至盛有冷的固定液的小瓶中。如果組織帶有較多的血液和組織液，應先用固定液洗幾遍，然後再切成小塊固定。

二、固定

固定的目的是盡可能使細胞中的各種細胞器以及大分子結構保持生活狀態，並且牢固地固定在它們原來所在的位置上。固定的方法有物理的和化學的兩大類。物理的方法系採用冰凍、乾燥、微波等手段來保持細胞結構；化學的方法是用一定的化學試劑來固定細胞結構。現通常使用化學方法進行固定，有時用物理-化學雙固定。

常用固定劑

1、四氧化鋨 (osmium tetroxide，)是一種強氧化劑，與氮原子有較強的親和力，因而對於細胞結構中的蛋白質成分有良好的固定作用。它還能與不飽和脂肪酸反應使脂肪得以固定。此外，四氧化鋨還能固定脂蛋白，使生物膜結構的主要成分磷脂蛋白穩定。它還能與變性DNA以及核蛋白反應，但不能固定天然DNA、RNA及糖原。四氧化鋨固定劑有強烈的電子染色作用，用它固定的樣品圖象反差較好。鋨固定的時間一般為1-2小時。

2．戊二醛 (glutaraldehyde C5H8O2)， 戊二醛的優點是對糖原、糖蛋白、微管、內質網和細胞基質等有較好的固定作用，對組織和細胞的穿透力比四氧化鋨強，還能保存某些酶的活力，長時間的固定(幾周甚至1～2個月)不會使組織變脆。缺點是不能保存脂肪，沒有電子染色作用，對細胞膜的顯示較差。

組織塊固定常規採用戊二醛—鋨酸雙重固定法。分預固定和後固定，中間用磷酸緩沖液漂洗。前固定用2.5%戊二醛固定2小時以上、後固定用1%鋨酸固定液固定1～2小時，pH7.2～7.4。固定完畢，用緩沖液漂洗30分鍾後進行脫水。

三、脫水

為了保證包埋介質完全滲入組織內部，必須事先將組織內的水分驅除干凈，即用一種和水及包埋劑均能相混溶的液體來取代水，常用的脫水劑是乙醇和丙酮。急驟的脫水會引起細胞的收縮，因此，脫水應梯度進行：70% 丙酮15分鍾，80% 丙酮15分鍾，90%丙酮15分鍾，100%丙酮20分鍾(分二次進行)。游離細胞可適當縮短脫水時間。過度脫水不僅引起更多物質的抽提，而且會使細胞皺縮變形、超微結構破壞、同時引起樣品發脆，造成切片困難或無法切片。

四、浸透和包埋

(一) 浸透

浸透就是利用包埋劑滲入到組織內部取代脫水劑，這種包埋劑在單體狀態時(聚合前)為液體，能夠滲入組織內，當加入某些催化劑，並經加溫後，能聚合成固體，以便進行超薄切片。目前常用的包埋劑是環氧樹脂(epoxy resin)。環氧樹脂是一類高分子聚合物，它的分子中含有兩種反應基團，即環氧基和羥基。當加入酸酐類時，樹脂分子中的羥基能與酸酐結合，形成分子間的橫橋連接，這種起橫橋式連接作用的交聯劑叫做硬化劑，它們參與交聯反應，並被吸收到樹脂鏈中。常用的硬化劑有十二烷基琥珀酸酐(或叫十二碳烯基丁二酸酐，簡稱DDSA)、甲基內次甲基鄰苯二甲酸酐(或叫六甲酸酐，簡稱MNA)及順丁烯二酸酐等。當加入胺類時，就引起末端環氧基相連，形成首尾相接的長鏈狀聚合物。這種促進末端相接的交聯劑叫做催化劑或加速劑。常用的加速劑有2,4,6－三(二甲氨基甲基苯酚)(簡稱DMP-30)、二乙基苯胺及乙二胺等。為了改善包埋塊的切割性能，某些環氧樹脂包埋劑配方中還加有增塑劑，使包埋塊具有適當的韌性。常用的增塑劑為鄰苯二甲酸二丁酯(簡稱DBP)。

包埋操作： 常規將組織塊包埋在多孔橡膠包埋模板中，然後置烤箱烘乾，在45℃(12小時)、60℃(36小時或更長)烤箱內加溫，即可聚合硬化，形成包埋塊。

包埋操作中應注意以下幾點：(1)所有試劑要防潮，最好存放在乾燥器中；(2)所用器皿應烘乾；(3)配包埋劑時，每加入一種試劑要攪拌均勻；(4)包埋時動作要輕巧，防止產生氣泡；(5)皮膚盡量不要接觸包埋劑，以免引起皮炎；(6)盛放過包埋劑的容器要及時用丙酮清洗干凈；（7）操作過程最好在通風櫃中進行。

五、超薄切片

(一) 超薄切片前的准備工作

1．修塊

一般用手工對包埋塊進行修整。將包埋塊夾在特製的夾持器上，放在解剖顯微鏡下，用鋒利的刀片先削去表面的包埋劑，露出組織，然後在組織的四周以和水平面成45度的角度削去包埋劑，修成錐體形。

2．半薄切片定位

利用超薄切片機切厚度為1μm-5μm的切片，稱半薄切片。將切下的片子用鑷子或小毛刷轉移到干凈的事先滴有蒸餾水的載玻片上，加溫，使切片展平，乾燥後經甲苯胺藍染色，光學顯微鏡觀察定位。如果半薄切片做得好，比一般石蠟切片更能觀察到細微結構，效果比石蠟切片要好一些。

半薄切片進行光學顯微鏡觀察的目的：(1) 定位：通過光學顯微鏡觀察，確定所要觀察的范圍，然後保留要用電鏡觀察的部分，修去其餘部分。(2)便於對同一組織的同一部位進行光學顯微鏡和電鏡的對比觀察。半薄切片定位以後，要對包埋塊作進一步的修整。通常將塊的頂端修成金字塔形，頂面修成梯形或長方形(最好是梯形)，每邊的長度為0.2mm～0.3mm。

3．制刀

超薄切片使用的刀有兩種：一種是玻璃刀，另一種是鑽石刀。由於玻璃刀價格便宜，使用者較多。制刀用的玻璃為硬質玻璃，厚度為5mm～6.5mm。

玻璃刀用專用制刀機製作。制好玻璃刀後，要圍繞刀口製作一隻水槽，以便使超薄切片漂浮在水面上。水槽有樹膠水槽和膠布水槽兩種。樹膠水槽有固定的形狀，可反復使用。膠布水槽是臨時用膠布或專用塑料條製作的。裝好水槽後，用熔化的石蠟封固介面，防止漏水。

4．載網和支持膜

4.1 載網

電鏡中使用的載網有銅網、不銹鋼網、鎳網等，一般常用銅網。載網為圓形，直徑3mm。網孔的形狀有圓形、方形、單孔形等。網孔的數目不等，有100、200、300目等多種規格，可根據需要進行選擇。

4.2 支持膜的制備

挑選並清洗好載網之後，要在載網上覆蓋一層薄膜，這層薄膜稱支持膜，厚度為10nm～20nm。對支持膜的要求是透明無結構，並能承受電子束的轟擊。常用的支持膜有火棉膠膜及聚乙烯醇縮甲醛膜(Formvar膜)，一般採用後者。

(二) 超薄切片

超薄切片需用超薄切片機進行。根據推進原理不同，將超薄切片機分為兩大類：一類是機械推進式切片機，用微動螺旋和微動杠桿來提供微小推進；另一類是熱脹冷縮式切片機，利用金屬桿熱脹或冷縮時產生的微小長度變化來提供推進。

超薄切片的步驟包括：(1)安裝包埋塊；(2)安裝玻璃刀；(3)調節刀與組織塊的距離；(4)調節水槽液面高度與燈光位置；(5)調節加熱電流及切片速度，切片；(6)將切片撈在有支持膜的載網上。

六．超薄切片的染色

未經染色的超薄切片，反差很弱。因此，要進行染色處理，以增強樣品的反差。一般是用重金屬鹽與組織細胞中某些成分結合或被組織吸附來達到染色的目的。重金屬的原子對電子束形成散射，從而提高圖象的反差。常用的染色劑有醋酸鈾和檸檬酸鉛。染色方法有兩種：

1．組織塊染色

在脫水至70%乙醇或丙酮時，將組織塊放在用70%乙醇或丙酮配製的飽和醋酸鈾溶液中，染色時間2小時以上，或在冰箱中過夜。

2．切片染色

預先取一個清潔的培養皿，將石蠟溶解製作成蠟板，然後滴數滴染液於蠟板上，用鑷子夾住載網的邊緣，把貼有切片的一面朝下，使載網浮在液滴上，蓋上培養皿，染色10～20分鍾。載網從染液中取出後，必須盡快用蒸餾水清洗干凈。在染色過程中，鉛染液容易與空氣中的二氧化碳結合形成碳酸鉛顆粒，而污染切片。因此，在保存和使用染液時，要盡量減少與空氣的接觸。為防止鉛沉澱污染，可在培養皿內放置少許氫氧化鈉，以吸收空氣中的二氧化碳。

七、電鏡觀察、拍片、記錄等。

做好觀察記錄，選好范圍拍片，准確記錄底片號碼及相應內容，然後在電腦中備案。如果使用CCD系統，則遵照CCD操作程序進行，並在觀察後作好圖片的拷貝或刻錄工作

C. 有哪些材料可以用作包埋劑

在製作切片或超薄切片時，由於組織是柔軟的，或局部的軟硬不均，這樣製作厚薄均勻的切片是困難的。所以有必要用一定物質浸透組織內部，使整個組織一樣硬化，以利於切成薄片，這種物質叫做包埋劑。一般用光學顯微鏡觀察的切片，用石蠟、火棉膠、炭蠟、明膠等作包埋劑；電子顯微鏡則用環氧樹脂、聚苯乙烯樹脂、異丁烯樹脂及水溶性樹脂。

D. 製作冰凍切片過程中OCT包埋劑怎麼使用，怎麼將組織至於切片機上

將組織置於冷凍托上將otc擠出覆蓋在組織上，放置快速冷凍架上1分鍾即可，把冷凍托放在標本夾頭上切就可以了

E. 812包埋劑的配方

用於透射電鏡樣品的包埋液,數年來一直延用幾種固定的配方,即常用的812、國產樹脂618、Spurr等等,各種包埋劑各有其優缺點.
Spurr包埋劑:粘度低,浸透容易,包埋聚合時間短,硬度及韌性均很好,經免疫標記的樣品,常用此液進行包埋.另外還可用於難以浸透、硬度高、緻密性較高組織.但此包埋液價格昂貴,不宜作為常規的包埋液來使用.
812包埋液:粘度低,韌性好,易切出較大的超薄切片,但組織包埋塊易吸潮,不易保存 ,包埋液的價格也較高.
國產樹脂618:價格便宜,購買方便,組織塊不易吸潮,保存方便,切割性能較好.但此包埋液粘度高,浸透速度緩慢,配製時不易攪拌均勻.
根據以上常用的幾種包埋液的優缺點,我室經數年的摸索,按自己的條件,重組了國產61 8樹脂包埋液配方:
618環氧樹脂 5ml
DDSA(十二碳烯基丁二酸酐) 2ml
MNA(甲基內次甲基四氫鄰苯二甲酸酐) 2.5ml
DBP(苯二甲酸二丁酯) 1ml
DMP-30(2-4-6-三(二甲氨基甲基)苯酚) 0.11ml
該包埋液中的增塑劑DBP可根據季節的變化或組織的硬度進行適當的調整(冬季包埋時, DBP可增加至1.5ml,使包埋塊的韌性增加).
此配方的優點是:粘度降低,浸透力增強,聚合後的組織塊顏色淡黃,硬度均等,韌性良好 ,切割性能較佳.經我室數年使用,對不易製片的眼球、耳蝸、皮膚、血管等組織,均取得了較好的超薄切片效果,現已成為我室的常規配方.

F. 光學顯微鏡的樣品要求是什麼

光學和電子顯微鏡樣品制備 optical and electron micros，preparation of specimens for 將生物材料製成適於在顯微鏡下觀察的薄片的技術。 光學顯微製片技術 光學顯微鏡製片首先要盡量保持生物材料的天然狀態，避免贗像、變形和失真，因此須將生物材料做固定處理；製片必須薄而透明，才能在光學顯微鏡下成像，除將材料切成薄片或通過輕壓或其他手段使之分散外，還需採用其他方法使它透明和染色，以便更好地觀察到結構的細節。需長期保存的製片，還應進行脫水和封固。

G. 透射電子顯微鏡的樣品製作要求有哪些

①快速冷凍，用致冷劑（如液氮、液體氟利昂、液體丙烷等）或其他方法使生物材料急劇冷凍，使組織和細胞中的水只能凍結成體積極小的冰晶甚至無定形的冰──玻璃態。這樣，細胞結構不致被冰晶破壞，生物大分子可保持天然構型，酶及抗原等能保存其生物活性，可溶性化學成分（如小分子有機物和無機離子）也不致流失或移位。用冷凍的組織塊，可進行切片、冷凍斷裂、冷凍乾燥和冷凍置換等處理。用此法固定的樣品既可提供組織、細胞結構的形態學信息，又可提供相關的細胞化學信息。②化學固定，固定劑有凝聚型和非凝聚型兩種，前者如光學顯微術中常用的乙醇、二氯化汞等，此法常使大多數蛋白質凝聚成固體,結構發生重大變化,常導致細胞的細微結構出現畸變。非凝聚型固定劑包括戊二醛、丙烯醛和甲醛等醛類固定劑和四氧化鋨，四氧化鉬等，適用於電子顯微。它們對蛋白質有較強的交聯作用,可以穩定大部分蛋白質而不使之凝聚,避免了過分的結構畸變。它們與細胞蛋白質有較強的化學親和力，固定處理後，固定劑成為被固定的蛋白質的一部分。如用含有重金屬元素的固定劑四氧化鋨（也是良好的電子染色劑）進行固定，因為鋨與蛋白質結合，增強了散射電子的能力，提高了細胞結構的反差。採用一種以上固定劑的多重固定方法，如採用戊二醛和四氧化鋨的雙固定法，能較有效地減少細胞成分的損失。此外，固定劑溶液的濃度、pH及所用的緩沖劑類型、滲透壓、固定時間和溫度等對固定效果都有不同程度的影響。
固定操作方法通常是先將材料切成 1立方毫米左右小塊，浸在固定液中，保持一定溫度（通常為4℃）,進行一定時間的固定反應。取材操作要以盡可能快的速度進行，以減少組織自溶作用造成的結構破壞。對某些難以固定的特殊組織，如腦、脊髓等，最好使用血管灌注方法固定，即通過血管向組織內灌注固定液，使固定液在組織發生缺氧症或解剖造成損傷之前，快速而均勻地滲透到組織的所有部分。灌注固定的效果比浸沒固定好得多。
脫水化學固定後，將材料浸於乙醇、丙酮等有機溶劑中以除去組織的游離水。為避免組織收縮，所用溶劑需從低濃度逐步提高到純有機溶劑，逐級脫水。
浸透脫水之後，用適當的樹脂單體與硬化劑的混合物即包埋劑，逐步替換組織塊中的脫水劑，直至樹脂均勻地浸透到細胞結構的一切空隙中。
包埋浸透之後,將組織塊放於模具中,注入樹脂單體與硬化劑等混合物，通過加熱等方法使樹脂聚合成堅硬的固體。用作包埋劑的樹脂有甲基丙烯酸酯、聚酯和環氧樹脂等。最廣泛使用的是某些類型的環氧樹脂，如618樹脂、Epon812、Araldite和 Spurr等商品樹脂。它們具有良好的維持樣品特性、低收縮率和較強的耐電子轟擊能力等優點。
切片制備超薄切片要使用特製超薄切片機（大多是根據精密機械推進或金屬熱膨脹推進原理製成）和特殊的切片刀（用斷裂的玻璃板製成的玻璃刀或用天然金剛石研磨而成的金剛石刀）。先將樹脂包埋塊中含有生物材料的部分，用刀片在立體顯微鏡下修整成細小的金字塔形,再用超薄切片機切成厚度適中（500埃左右）的超薄片，切片應依次相互聯接形成切片帶。切片帶漂浮於裝在切片機上的水槽中的水面上。
通過裝置在切片機上的解剖顯微鏡，監控切片過程。用熒光燈照射水面上的切片，並根據由此產生的干涉光顏色來判斷切片的實際厚度（見表）。

切片通常用敷有薄的支持膜的特製金屬載網，從水面上撈取。快速冷凍固定的生物材料，可用冷凍超薄切片裝置製成切片。用醛類或冷凍方法固定的組織，可通過超薄切片術與生物化學技術、免疫技術等結合使用,進行超微結構水平上的蛋白質、核酸、酶及抗原等生物活性物質的定位甚至定量研究。這就是電鏡細胞化學技術（見細胞化學）和電鏡免疫細胞化學技術。
染色電子顯微鏡主要是依賴散射電子成像，為了增強細胞結構的電子反差，需要對切片進行染色。染色是依據各種細胞結構與染色劑（重金屬鹽）結合的選擇性，而形成不同的對電子散射能力，從而產生藉以區別各種結構的反差。電子染色方法分塊染色和切片染色兩種：①塊染色法，在脫水劑中加入染色劑，在脫水過程中對組織塊進行電子染色。②切片染色法，最常用，即將載有切片的金屬載網漂浮或浸沒在染色液中染色。也可使用有微處理機控制的染色機進行自動化染色。一般切片染色所使用的染色劑為金屬鈾鹽和鉛鹽的雙重染色。為顯示某種特殊結構，則可採用與該結構有特異性結合的選擇性染色劑。
冷凍置換法用有機溶劑（如丙酮、乙醚等）在低溫條件下（通常，-80～-90℃），緩慢地置換冷凍固定的小塊組織中的冰（「惰性脫水」），這樣可減少常規方法脫水過程中有機溶劑對組織中化學組分的抽取。然後再按常規方法進行樹脂包埋、超薄切片和染色等。用冷凍置換法，可以很好地保存快速變化過程中物質的狀態和非常脆弱的超微結構以及細胞內某些化學組分。
電鏡放射自顯影技術用超薄切片術與放射性同位素標記技術相結合的電鏡放射自顯影術(見同位素技術)可獲得同位素標記的化合物在組織細胞內存在部位，以及在代謝過程中物質的合成、分解、轉運及分泌的信息。
負染色和投影技術 研究分散的顆粒狀生物材料,為增強其反差，常採用的方法。
負染色研究以蛋白質為主要成分的顆粒狀材料的最常用方法。以某些在電子束轟擊下穩定而又不與蛋白質相結合的重金屬鹽類作為負染色劑，使之在支持膜上將顆粒材料包圍，形成具有高電子散射能力的背景，襯托出低電子散射能力的顆粒的形態細節。其所成的電子顯微像的反差與常規電子染色相反，即暗的背景和亮的顆粒形態的所謂陰性反差。負染色方法簡便，所獲得的顆粒的電子顯微圖像反差強,解析度也高於超薄切片,可廣泛用於研究蛋白質分子、細菌鞭毛、蛋白質結晶，以及生物膜及分離的細胞的細微結構，特別適用於蛋白質大分子及病毒顆粒結構的三維重建研究。常用的負染色劑有醋酸鈾、磷鎢酸鈉或磷鎢酸鉀、 硅鎢酸、 銅酸銨及甲酸鈾等。用液滴法或噴霧法將顆粒材料的懸液加在載網的支持膜上，然後滴加負染色劑溶液。或將顆粒的懸液與負染色劑按一定濃度混合滴加或噴撒到支持膜上，吸去多餘液體，待乾燥後，即可用電鏡觀察。樣品顆粒在支持膜上的均勻分散是成功的關鍵之一。染色劑溶液的pH則是成功的另一關鍵。一般染色劑的pH應在中性偏酸范圍（pH 5～7）,但對不同種類的顆粒材料和染色劑，最適pH也不盡相同。
投影 在真空蒸發器的高真空腔中,加熱某些金屬至熔化後，金屬以細小顆粒沿直線方向蒸發出來。當金屬微粒以一定入射角噴鍍在載有顆粒材料的載網支持膜表面上時,顆粒向蒸發源的一面即被鍍上一層金屬薄膜,而背蒸發源的一面及附近區域形成無金屬沉積的「陰影」，並且由於各部位散射電子能力存在著差別，這樣就能構成具有強烈反差和立體感的電子顯微圖像。常用於投影的蒸發材料，有金、 鉻、 鉑、鈀以及鉑-銥、鉑-鈀、鉑-碳等金屬或合金。此外，還可利用電子槍投影裝置使鎢、鉭等高熔點金屬以極微細顆粒蒸發，從而獲得高解析度投影。
蛋白質展膜技術用電子顯微鏡研究核酸分子常用的方法。某些鹼性球蛋白，如細胞色素c,可以在低濃度鹽溶液或蒸餾水表面展成單分子層，在展開過程中，能為蛋白質的鹼性氨基酸側鏈基團所吸附的、帶負電荷的核酸分子同時展開成完整的線狀分子。然後，用帶有支持膜（有機膜或碳膜）的載網撈起這些蛋白質──核酸展膜,並用染色或金屬投影法提高核酸分子的反差,可在電鏡下直接觀察核酸分子的形態、DNA的雙螺旋結構,並可通過分子長度的測量來計算核酸分子量。
冷凍斷裂和冰凍蝕刻技術研究細胞超微結構，特別是生物膜結構的一種獨特的樣品制備技術。利用快速冷凍方法固定的生物組織塊具有剛性和脆性。在對其施加外力後，組織即在結構上結合最薄弱的部位發生「脆性斷裂」，這就是「冷凍斷裂」。對於生物膜，斷裂沿膜內部疏水區發生，從而暴露出膜內部結構。利用投影和復型技術，制備斷裂面的復型,然後將組織腐蝕掉,並用載網撈起復型膜，就可用電鏡來研究組織斷裂表面所顯示的細胞的或生物膜內部超微結構。在高於 10毫米汞柱真空度和-100℃溫度下，冷凍組織的斷裂表面上的冰升華為水蒸汽，而使原表面高度下降，即謂之「冰凍蝕刻」。由於組織各部分結構的含水量不同，冰的升華造成各部分結構的表面高度下降程度有差異，因此冰凍蝕刻的斷裂表面的投影、復型所顯示的斷裂表面形態具有很強的立體感。冷凍斷裂和冰凍蝕刻技術，為細胞超微結構，特別是關於細胞聯接、細胞融合、細胞分化以及生物膜的通透性的研究提供了許多重要信息。也為流行的生物膜結構模型，即「流動鑲嵌模型」的研究提供了有利的證據。

H. 製作人體標本的方法

NHK : 樓上錯了~~...製作塑化屍體標本...根本不會使用傳統的福爾馬林(Formalin)...塑化屍體技術(Plastination)是由德國人在70年代末發明的...製作過程挺復雜的...不是一般人在家裡可以跟著做的...根據塑化屍體技術發明者在1977/78年度發表的 Polymer Impregnation of Perishable, Biological Specimens 一文...小弟只能做下面的簡介...有興趣的話...你可以自行上網...查閱該文章的內容...首先...屍體要經過脫水和脫蛋白的處理...讓它變成枯屍...要完成第一個步驟...己經是高難度...然後...再將相同份量的樹脂(Resin)注入屍體體內...用樹脂來保存人體外表和器官的色澤...也讓皮膚可以保持彈性...請留意...在這種新的標本製作方法下...屍體的內臟可以取出...也可以不取出...連軀體一並製作成標本也可以的...用樹脂這種物料...除了可以消除屍臭以外...也不會孳生細菌...當塑化完成以後...就算不再添加其他防腐物...也不用冷藏...只要置放在室溫下...屍體也可以長期保存的..........

I. 一般顯微觀察樣品的預處理,主要包括什麼

在光學顯微鏡的樣品制備過程中，樣品的切片厚度在2～25um之間；電鏡的切片厚度在50-100nm以內（高壓電鏡除外，其樣品厚度可達到1um），所以採用的切片方法，也不盡相同。

在載體方面，光學顯微鏡的的切片的載體是玻片，而電鏡切片的載體是載網。

在固定方面，光學顯微鏡的切片使用復合固定液固定，而電鏡切片，只用單一固定液進行重復固定

在染色方面，光學樣品的染色較為簡單，根據不同的觀測樣品及光學顯微鏡的類型，通常以固定的一些染色劑染色就行了。而電鏡樣品再染色方面的方法很多，而且也很復雜，比如負染色、銀染色等等。

在包埋方面，光學顯微鏡切片使用石蠟、火棉膠、明膠等做包埋劑；電鏡切片則用環氧樹脂、聚苯乙烯樹脂、異丁烯樹脂及水溶性樹脂等做包埋劑。