蒸餾水對葉綠素提取液

㈠ 葉綠素的提取和分離

一 實驗目的

1．掌握提取葉綠素的方法；

2．了解薄層層析的原理，掌握薄層層析的一般操作和定性鑒定方法

二 實驗原理

1．葉綠素提取

高等植物體內的葉綠體色素有葉綠素和類胡蘿卜素兩類，主要包括葉綠素a (C55H72O5N4Mg)、葉綠素b(C55H70O6N4Mg)、β—胡蘿卜素(C40H56)和葉黃素(C40H56O2)等4種。葉綠素a和葉綠素b為吡咯衍生物與金屬鎂的配合物，胡蘿卜素是一種橙色天然色素，屬於四萜類，為一長鏈共軛多烯，有α、β、γ三種異構體，其中，β異構體含量最多。葉黃素為一種黃色色素，與葉綠素同存在於植物體中，是胡蘿卜素的羥基衍生物，較易溶於乙醇，在乙醚中溶解度較小。根據它們的化學特性，可將它們從植物葉片中提取出來，並通過萃取、沉澱和色譜方法將它們分離開來。

2．薄層色譜

薄層層析是快速分離和定性分析微量物質的一種極為重要的實驗技術，具有設備簡單、操作方便而快速的特點。它是將固定相支持物均勻地鋪在玻片上製成薄層板，將樣品溶液點加在起點處，置於層析容器中用合適的溶劑展開而達到分離的目的。用此法分離時幾乎不受溫度的影響，可採用腐蝕性顯色劑，而且可在高溫下顯色，特別適用於揮發性小或在較高溫度下易發生反應的物質，同時也常用來跟蹤有機反應或監測有機反應完成的程度。

薄層層析的器材選擇：

（1）基板：玻璃、塑料、金屬箔，常用玻璃板。

（2）吸附劑：

吸附劑要有合適的吸附力，並且必須與展開劑和被吸附物質均不起化學反應。可用作吸附劑的物質很多，常用的有硅膠和氧化鋁，由於吸附性好，適用於各類化合物的分離，應用最廣。選擇吸附劑時主要根據樣品的溶解度、酸鹼性及極性。氧化鋁一般是微鹼性吸附劑，適用於鹼性物質及中性物質的分離；而硅膠是微酸性吸附劑，適用於酸性物質及中性物質的分離。以下簡單介紹吸附劑的幾個基本參數。

種類：常用：氧化鋁（強極性）、硅膠（中強極性）

不常用：硅藻土、纖維素、糖類、活性碳

符號：H——無任何添加劑；G——加有鍛石膏（Gypsum，CaSO4·1/2 H2O）粘合劑；

F——加有熒光素（Fluorescein）

CMC——加有羧甲基纖維素鈉（Carboxymethyl cellulose）

例：硅膠GF254表示硅膠中既加有煅石膏粘合劑，也加有熒光素，可以在波長254nm的紫外光下激發出熒光

粒度：目：1cm2內的篩孔數，數目越大，顆粒越小。薄層所用吸附劑顆粒較細，氧化鋁為200目，硅膠為100~150目。

μ：顆粒的平均直徑，以微米表示。例如：40μ的顆粒與100目相當。

活性：

吸附劑按其含水量的多少各分為五個等級：I級含水量最少，活性最高；V級含水量最多，活性最低；但並不是活性越高分離效果越好，選用哪種活性級別的吸附劑，要用實驗的方法來確定。

酸鹼性：

市售氧化鋁有酸性（用以分離酸性化合物）、中性、鹼性（用以分離生物鹼等鹼性化合物），其蒸餾水洗出液的pH值分別為4、7.5、9—10；其中以中性氧化鋁應用最廣，可用來分離各種化合物，特別是那些對酸、鹼敏感的化合物。

硅膠沒有酸鹼性之分。

（3）展開劑

在樣品組分-吸附劑-展開劑三個因素中。對一確定組分，樣品的結構和性質可看作是一不變因素，吸附劑和展開劑是可變因素。而吸附劑的種類有限，因此選擇合適的展開劑就成為解決問題的關鍵。展開劑的選擇有以下要求:

（a）對待測組分有很好的溶解度。

（b）能使待測組分與雜質分開，與基線分離。

（c）使展開後的組分斑點圓而集中，不應有拖尾現象。

（d）使待測組分的Rf值最好在0.4~0.5，如樣品中待測組分較多，Rf值則可在0.25~0.75范圈內，組分間的Rf值最好相差0.1左右。由於薄層色譜法用途非常廣泛，國內外均有現成的鋪有吸附劑的薄層板出售。一般實驗室中也可自己制備。

(e)不與組分發生化學反應，或在某些吸附劑存在下發生聚合。

(f)具有適中的沸點和較低的粘滯度。

展開劑的極性是指與樣品組分相互作用時。展開劑分子與吸附劑分子的色散作用、偶極作用、氫鍵作用及介電作用的總和。展開劑要根據樣品的極性及溶解度，吸附劑活性等因素進行選擇，總的原則是展開劑的極性能使組分的Rf值在0.5左右。常用溶劑極性次序是：石油醚<環己烷<苯<乙醚<氯仿<乙酸丁酯<正丁醇<丙酮<乙醇<甲醇。

如一種溶劑不能充分展開，可選用二元或多元溶劑系統。

4．展開槽與展開：

薄層的展開在密閉的容器即展開槽或稱為層析缸中進行。

展開：

合適的展開劑用量為浸及下端硅膠，但不浸及樣點；點樣端向下，每次只展開一塊，放在正中，以免爬斜（進而展開傾斜）。

5．顯色：

如果化合物本身有顏色，就可直接觀察它的斑點。如果本身無色，可先在紫外燈光下觀察有無熒光斑點（有苯環的物質都有），用鉛筆在薄層板上劃出斑點的位置；對於在紫外燈光下不顯色的，可放在含少量碘蒸氣的容器中顯色來檢查色點（因為許多化合物都能和碘成黃棕色斑點），顯色後，立即用鉛筆標出斑點的位置。常用

普適性顯色劑：濃硫酸、碘蒸氣、熒光素，專用顯色劑：茚三酮、三氯化鐵溶液等。

三、實驗儀器與葯品

儀器：半微量玻璃儀器一箱，小燒杯，層析缸(槽)，載玻片(100mm×25mm)乾燥器，電吹風，毛細管，移液管，研缽，布氏漏斗，抽濾裝置。

試劑：硅膠，1％ CMC，石油醚（60~90℃），乙醇，丙酮，乙醚，飽和NaCl溶液，無水Na2SO4

四、實驗步驟

1．制板：

將硅膠加 1％ CMC，調成槳狀(硅膠：CMC=1:3~4)（在平鋪玻璃板上能晃動但不能流動），將其塗在載玻片上（100mm×25mm）），為使其坦平，可將載玻片用手端平晃動，至平坦為止，放在干凈平坦的檯面上，晾乾之後放入105℃烘箱活化1小時，取出放入乾燥器內待用。

2、葉綠素的提取

在研缽中放入幾片(約5g)菠菜葉(新鮮的或冷凍的都可以．如果是冷凍的，解凍後包在紙中輕壓吸左水分)。加人10mL2:1石油醚和乙醇混合液，適當研磨。將提取液用滴管轉移至分液漏斗中，加人10 mL飽和NaCl溶液(防止生成乳濁液)除去水溶性物質，分去H2O層，再用蒸餾水洗滌兩次。將有機層轉入乾燥的小錐形瓶中，加2g入無水Na2SO4乾燥。乾燥後的液體傾至另—錐形瓶中(如溶液顏色太淺，可在通風櫃中適當蒸發濃縮)。

3、點樣

用一根內徑 1mm的毛細管，吸取適量提取液，輕輕地點在距薄板一端1.5cm處，平行點兩點，兩點相距1cm左右。若一次點樣不夠，可待樣品溶劑揮發後．再在原處點第二次，但點樣斑點直徑不得越過2mm。

4、展開

先在層析缸中放入展開劑[石油醚（60~90℃）-丙酮—乙醚(體積比為3:1:1)]，加蓋使缸內蒸氣飽10min， 再將薄層板斜靠於層析缸內壁。點樣端接觸展開劑但樣點不能浸沒於展開劑中，密閉層祈缸。待展開劑上升到距薄層板另一端約1crm時，取出平放，用鉛筆或小針劃前沿線位置，晾乾或用電吹風吹乾薄層。

五、實驗注意事項

1．制板時用注意使板上硅膠厚度盡量一致。

2．植物葉片不要研成糊狀，否則會給分離造成困難

㈡ 顯微鏡觀察葉綠體中蒸餾水的作用

蒸餾水的作用是因為低滲作用，蒸餾水能去除自來水內大部分的污染物，但揮發性的雜質無法去除。

㈢ 提取葉綠素中的色素最常用的溶劑是 A.蒸餾水 B.甲醇 C.丙酮 D.乙醇

乙醇來並不能起到分離色自素的效果，植物的葉綠體里除了葉綠素還有其它的色素，用乙醇的話不能把葉綠素分離出來所以不能提取，所以用丙酮提取色素層析液分離色素。雖然丙酮有一定的毒性。
2010年。34．提取植物葉綠素時經常採用的試劑是：(D)
A．乙醇 B． 甘油 C． 重蒸水 D． 丙酮

㈣ 高中生物實驗 綠葉色素的提取

葉綠素提取的准備工作是在一個半暗的房間里，室溫保持在25℃。

提取步驟如下：

(1) 取1000克新鮮的綠葉，在韋氏攪切器中粉碎。

(2)將粉碎的1000克綠葉放進加有少量的碳酸鈣的丙酮中(溫度20℃)進行萃取，直到過濾、清洗後的葉子碎片為無色。

(3)將過濾後的丙酮提取液放到盛有1升石油醚和100ml丙酮的漏斗中，然後輕輕地旋轉，同時加放蒸餾水直到分層為止。水層的大部分丙酮和水溶雜質被丟棄，只剩石油醚溶液。

(4)將石油醚溶液用蒸餾水再次凈化後，用含有石油醚和0.01克草酸的200ml80%的甲醇溶液清洗5次以上，最後得到黃綠色懸浮液。

(5)用無水硫酸鈉對懸浮液進行乾燥，並將其滲入到3cm厚的蔗糖粉末製成柱中，然後用石油醚清洗沉澱的色素去掉類胡蘿卜素，使之只含有天然的葉綠素。

(6)含有天然葉綠素的蔗糖柱分兩層，綠層有4-10mm的葉綠素b層，另一藍層為2-6mm的葉綠素a層。

(7)將位於藍層正中的部分(約占藍層的一半) 放入醚中，對此懸浮液進行過濾、洗提，用蒸餾水清洗，用硫酸鈉乾燥，再用器皿進行過濾後，得到葉綠素a。

(8)將(6)中的綠層中間部分移出，迅速放入醚中過濾、洗提，製成葉綠素b醚溶液。

(4)蒸餾水對葉綠素提取液擴展閱讀：

葉綠素的分離

色譜法是一種很好的分離純化、鑒定有機化合物的重要方法，尤其是在微量分析中應用的更是廣泛。果蔬中色素主要包括脂溶性的胡蘿卜素、葉黃素、葉綠素和水溶性的花青素。

在提取實驗時，我們可以利用相似相溶的原理把水溶性的花青素濾掉，繼而可以利用薄層色譜、柱色譜、高效液相色譜對胡蘿卜素、葉黃素和葉綠素進行分離。

由於這三種色素的極性依次減弱，可以適當地選擇單一的有機溶劑或者不同配比的混合溶劑作為展開劑和洗脫劑，確定最佳的優化分離條件。

葉綠素-網路

㈤ 提取葉綠素方法

(1) 取1000克新鮮的綠葉，在韋氏攪切器中粉碎。

(2)將粉碎的1000克綠葉放進加有少量的碳酸鈣的丙酮中(溫度20℃)進行萃取，直到過濾、清洗後的葉子碎片為無色。

(3)將過濾後的丙酮提取液放到盛有1升石油醚和100ml丙酮的漏斗中，然後輕輕地旋轉，同時加放蒸餾水直到分層為止。水層的大部分丙酮和水溶雜質被丟棄，只剩石油醚溶液。

(4)將石油醚溶液用蒸餾水再次凈化後，用含有石油醚和0.01克草酸的200ml80%的甲醇溶液清洗5次以上，最後得到黃綠色懸浮液。

㈥ 葉綠素的提取實驗中,為什麼要加蒸餾水請您回答的詳細一點.謝謝!

葉綠體色素在葉綠體內以其親水部分與蛋白質結合,親脂部分與類脂結合,純的有機溶劑不能打破色素與蛋白質的聯系，所以必須用能與水混溶的有機溶劑並有少量水存在時,才能將葉綠素提取出來。

㈦ 怎麼樣實驗室提取葉綠素具體流程步驟

葉綠素提取的准備工作是在一個半暗的房間里，室溫保持在25℃。提取步驟如下：

(1) 取1000克新鮮的綠葉，在韋氏攪切器中粉碎。

(2)將粉碎的1000克綠葉放進加有少量的碳酸鈣的丙酮中(溫度20℃)進行萃取，直到過濾、清洗後的葉子碎片為無色。

(3)將過濾後的丙酮提取液放到盛有1升石油醚和100ml丙酮的漏斗中，然後輕輕地旋轉，同時加放蒸餾水直到分層為止。水層的大部分丙酮和水溶雜質被丟棄，只剩石油醚溶液。

(4)將石油醚溶液用蒸餾水再次凈化後，用含有石油醚和0.01克草酸的200ml80%的甲醇溶液清洗5次以上，最後得到黃綠色懸浮液。

(5)用無水硫酸鈉對懸浮液進行乾燥，並將其滲入到3cm厚的蔗糖粉末製成柱中，然後用石油醚清洗沉澱的色素去掉類胡蘿卜素，使之只含有天然的葉綠素。

(6)含有天然葉綠素的蔗糖柱分兩層，綠層有4-10mm的葉綠素b層，另一藍層為2-6mm的葉綠素a層。

(7)將位於藍層正中的部分(約占藍層的一半) 放入醚中，對此懸浮液進行過濾、洗提，用蒸餾水清洗，用硫酸鈉乾燥，再用器皿進行過濾後，得到葉綠素a。

(8)將(6)中的綠層中間部分移出，迅速放入醚中過濾、洗提，製成葉綠素b醚溶液

㈧ 葉綠素提取實驗報告，有誰知道緊急！

實驗三：葉綠體色素提取分離與理化性質及含量測定

（一）實驗目的及意義
（二）實驗原理
（三）實驗步驟
（四）實驗報告

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實驗目的和意義

因此，測定葉綠素含量便成為研究光合作用與氮代謝必不可少的手段，在作物育種、科學施肥、看葉診斷中有著廣泛的應用

綠色植物的光合作用是在葉綠體中的葉綠體色素中進行的，了解葉綠體色素的組成、性質及測定對於理解光合作用的本質很有幫助。

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葉綠體在細胞中運動視頻

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葉綠體在細胞中的分布與結構

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類囊體膜的結構及功能

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實驗原理

植物葉綠體色素是吸收太陽光能，進行光合作用的重要物質。它一般由葉綠素a、葉綠素b、胡蘿卜素和葉黃素組成。這些色素都不溶於水，而溶於有機溶劑，故可用乙醇、丙酮等有機溶劑提取。

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實驗原理

葉綠素是一種二羧酸——葉綠酸與甲醇和葉綠醇形成的復雜酯，故可與鹼起皂化反應而生成醇（甲醇和葉綠醇）和葉綠酸的鹽，產生的鹽能溶於水中，可用此法將葉綠素與類胡蘿卜素分開。

色素分離的方法有多種，紙層析是最簡便的一種。當溶劑（有機推動劑）不斷從紙上流過時，由於混合物（葉綠素提取液）中各種成分在固定相（濾紙纖維素所吸附的水分）和流動相（有機推動劑）間具有不同的分配系數，所以移動速度不同，經過一定時間後，可將各種色素分開。

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實驗原理

葉綠素中的鎂可以被氫離子所取代而成褐色的去鎂葉綠素。去鎂葉綠素遇銅則成為銅代葉綠素，銅代葉綠素很穩定，在光下不易破壞，故常用此法製作綠色多汁植物的浸漬標本。

葉綠素與類胡蘿卜素都具有光學活性，表現出一定的吸收光譜，可用分光光度計精確測定。葉綠素吸收光量子而轉變成激發態，激發態的葉綠素分子很不穩定，當它變回到基態時可發射出紅光量子，因而產生熒光。葉綠素的化學性質很不穩定，容易受強光的破壞，特別是當葉綠素與蛋白質分離以後，破壞更快，而類胡蘿卜素則較穩定。

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實驗步驟(1)

今欲測定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量，只需測定該提取液在三個特定波長下的吸光度D，並根據葉綠素a、b及類胡蘿卜素在該波長下的吸光系數即可求出其濃度。
Ca=12.7D663 –2.69 D645（3）
Cb=22.9 D645 –4.68D663（4）
Ck=4.7D440- 0.27Ca+b

根據朗伯一比爾定律，某有色溶液的吸光度D與其中溶液濃度C和液層厚度L成正比，即：
D＝KCL
D：吸光度，即吸收光的量，C：溶液濃度, K：為比吸收系數（吸光系數）， L：液層厚度，通常為1cm.
如果溶液中有數種吸光物質，則此混合液在某一波長下的總吸光度等於各組分在相應波長下吸光度的總和，這就是吸光度的加和性。

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實驗材料和器材

器材：721型分光光度計、電子天平、量筒、研缽、剪刀、漏斗、濾紙、移液管（1mL）、試管及試管架、洗耳球、酒精燈等。
試劑：丙酮、80%丙酮、醋酸酮、5%鹽酸、碳酸鈣、石英砂等

實驗材料
鹵地菊葉片

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實驗步驟(1)

分離：在大試管中加入推動劑，然後將濾紙固定於膠塞的小鉤上，插入試管中，使尖端浸入溶劑內（色點要高於葉面，濾紙條邊緣不可碰到試管壁），蓋緊膠塞，直立於陰暗處層析。
當推動劑前沿接近濾紙邊緣時，取出濾紙，風干，觀察色帶的分布。葉綠素a為藍綠色，葉綠素b為黃綠色，葉黃素為黃色，胡蘿卜素為橙黃色。用鉛筆標出各種色素的位置和名稱。

1.葉綠體色素的提取
（1）取植物新鮮葉片1克，洗凈，擦乾，去掉中脈剪碎，放人研缽中。
（2）研缽中加入少量石英砂及碳酸鈣粉，2-3 mL95%乙醇，研磨至糊狀，再加2-3 mL95％乙醇，過濾，即得色素提取液。
2.葉綠體色素的分離
點樣：取前端剪成三角形的濾紙條，用毛細管取葉綠素提取液，如圖點樣於「色點」處，注意每次所點溶液不可過多，點樣後晾乾，再重復操作數次。

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理化性質測定

2.氫和銅對葉綠素分子中鎂的取代作用
方法一；取兩支試管。第一支試管加葉綠體色素提取液2mL，作為對照。第二支試管加葉綠體色素提取液2 mL，再加入稀鹽酸1滴，搖勻，觀察溶液顏色變化。當溶液變竭後，再加入少量醋酸銅粉末，微微加熱，觀察記錄溶液顏色變化情況，並與對照試管相比較。解釋其顏色變化原因。

將上一個實驗中提取的葉綠體色素溶液適當稀釋後，進行以下實驗：
1.熒光現象的觀察。
取l支試管加入濃的葉綠體色素提取液，在直射光下觀察溶液的透射光與反射光顏色有何不同，可觀察到反射出暗紅色的熒光。

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理化性質測定

2.氫和銅對葉綠素分子中鎂的取代作用
方法一；取兩支試管。第一支試管加葉綠體色素提取液2mL，作為對照。第二支試管加葉綠體色素提取液2 mL，再加入稀鹽酸1滴，搖勻，觀察溶液顏色變化。當溶液變竭後，再加入少量醋酸銅粉末，微微加熱，觀察記錄溶液顏色變化情況，並與對照試管相比較。解釋其顏色變化原因。

將上一個實驗中提取的葉綠體色素溶液適當稀釋後，進行以下實驗：
1.熒光現象的觀察。
取l支試管加入濃的葉綠體色素提取液，在直射光下觀察溶液的透射光與反射光顏色有何不同，可觀察到反射出暗紅色的熒光。

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理化性質測定

4. 葉綠體色素吸收光譜曲線
將上述葉綠體色素提取液注入1cm比色杯中，另取95%乙醇作空白，於400-700nm之間，每間隔10nm讀取光密度值。根據測定結果，以波長為橫坐標繪制曲線，此即葉綠體色素的吸收光譜曲線。用同樣的方法測定皂化作用中分離出綠色素與黃色素的吸收光譜曲線，並對結果進行分析。

3.皂化作用（綠色素與黃色素的分離）
取葉綠體色素提取液2 mL於大試管中，加入4mL乙醚，搖勻，再沿試管壁慢慢加人3～6mL蒸餾水，輕輕混勻，靜置片刻，溶液即分為兩層，色素已全部轉入上層乙醚中。用滴管吸取上層綠色層溶液，放入另一試管中，再用蒸餾水沖洗一、二次。在色素乙醚溶液中加入30％KOH－甲醇溶液，充分搖勻，再加入蒸餾水約3 mL，搖勻靜置。可以看到溶液逐漸分為兩層，下層是水溶液，其中溶有皂化的葉綠素a和b，上層是乙醚溶液，其中溶有黃色的胡蘿卜素和葉黃素。將上下層放入兩試管中，可供觀察吸收光譜用。

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含量測定

(3）轉移到25mL棕色容量瓶中，用少量80％丙酮沖洗研缽、研棒及殘渣數次，最後連同殘渣一起倒入容量瓶中。最後用80％丙酮定容至25mL，搖勻。離心或過濾。

(4）將上述色素提取液倒入光徑1cm的比色杯內。以80％丙酮為空白，在波長663nm、645nm、652nm和440nm下測定光密度。

（1）取新鮮植物葉片，擦凈組織表面污物，剪碎，混勻。
（2）稱取剪碎的新鮮樣品0.5g，放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及2～3mL80％丙酮，研成勻漿，再加80％丙酮5mL，繼續研磨至組織變白。

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四、實驗結果計算

將測得的光密度值代入公式，分別計算葉綠素a、b、a+b和類胡蘿卜素的濃度（mg／L）。
並按下式計算組織中單位鮮重或乾重的各色素的含量：
色素濃度（mg／L）×提取液總體積×稀釋倍數
色素在葉片中的含量（%）= ×100% 樣品重量（mg）×1000
稀釋倍數：若提取液未經稀釋，則取1

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實驗報告

1.試述葉綠體色素的吸收光譜特點及生理意義。
2.在皂化反應中加入乙醚有什麼作用？

㈨ 提取葉綠體中的色素，最常用的溶劑是（） A．蒸餾水 B．甲醇 C．丙酮 D．乙醇

葉綠體中的色素都是不溶於水、易溶於有機溶劑的有機物，常用的提取劑為丙酮，也可溶於甲醇、乙醇、石油醚等，所以用丙酮可提取葉綠體中色素．
故選：C．

㈩ 生物問題：為什麼不能用蒸餾水提取葉綠體色素

葉綠素是脂溶性的，根據相似相溶的原理，不溶於極性的分子，水是極性分子，一般生物實驗室用丙酮或者乙腈，石油醚，提取葉綠素。