凱氏蒸餾裝國標

㈠ 凱氏定氮法在蒸餾時為什麼吸收液一直未變成藍綠色

溴甲酚綠-甲基紅混合指示劑在鹼性溶液中呈綠色、藍綠色。沒變色說明吸收液版中氨的量不夠，有可能的原因權:蒸餾時加入的NaOH量不夠；漏斗下端未保持液封，有氨逸出；微量凱氏定氮蒸餾裝置的密封性不好；消化時加入的硫酸鉀過多，使消化體系溫度過高，引起已生成的銨鹽發生熱分解而造成氨損失。

㈡ 國家標准檢測蛋白質含量測定方法

蛋白質含量測定方法就是檢測元素的含量，像三聚氰胺的問題，就是通過增加N的含量使「蛋白質」含量提高的。

國家標准檢測蛋白質含量的方法叫做凱氏定氮法，食物中的蛋白質在催化加熱條件下分解，導致氨和硫酸結合產生硫酸銨。 鹼蒸餾採用無硫，硼酸吸收，用硫酸或鹽酸標准滴定溶液滴定，根據酸耗計算氮含量，再乘以轉化系數，即蛋白質含量。

具體操作步驟如下：

1.樣品處理

精確稱量0.2-2.0g固體樣品或2-5g半固體樣品或吸收10-20ml液體樣品（約30-40mg氮當量）。將其轉移至乾燥的100毫升或500毫升氮氣固定瓶中，加入0.2克硫酸銅，6克硫酸鉀和20毫升硫酸，輕輕搖動，在瓶口放置一個小漏斗，將瓶子傾斜石棉網上有45度角，有小孔。

加熱小火後，內容物碳化，泡沫完全停止，加強火力，保持瓶內液體稍微沸騰，直至液體呈藍綠色澄清透明，然後繼續加熱0.5小時。取出並冷卻，小心加入20毫升水，冷卻，移入100毫升容量瓶中，用少量水洗凈氮氣瓶，洗凈液放入容量瓶中，然後用水沖洗至刻度，混勻備用。

取相同量的硫酸銅，硫酸鉀和濃硫酸作為試劑進行空白試驗。然而，這種方法很危險，很難在實驗室中證明。大多數實驗室都有一個消化器，可以一次處理16個以上的樣品和一個可以自行設定溫度的呼吸機。它更安全，更可操作。

(2)凱氏蒸餾裝國標擴展閱讀

除了凱氏定氮法以外，標準的測量方法還有：

• 分光光度法

食品中的蛋白質在催化加熱條件下被分解，分解產生的氨與硫酸結合生成硫酸銨，在pH4.8的乙酸鈉-乙酸緩沖溶液中與乙醯丙酮和甲醛反應生成黃色的3,5-二乙醯-2,6-二甲基-1,4-二氫化吡啶化合物。在波長400nm 下測定吸光度值，與標准系列比較定量,結果乘以換算系數，即為蛋白質含量。

• 燃燒法

樣品在900~1200℃下燃燒。在燃燒過程中，產生混合氣體。 諸如碳，硫和鹽的干擾氣體被吸收管吸收，氮氧化物被還原成氮。 形成的氮氣流由熱導檢測器（TCD）檢測。

㈢ 凱氏定氮法測定蛋白質含量的基本原理

樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質分解，其中碳、氫被氧化為CO2和H2O逸出回，而樣品中的答有機氮轉化為氨與硫酸結合成硫酸銨，硫酸銨用NaOH中和生成NH3`H2O，加熱又分解為氨，用硼酸吸收，吸收氨後的硼酸再以標准鹽酸或硫酸溶液滴定，根據標准酸消耗量計算蛋白質的含量。

㈣ 凱氏定氮法測定食品中蛋白質含量的原理和基本操作方法是什麼

原理：有機含氮化合物與濃硫酸共熱消化，氮轉化為氨，再與硫酸結合成硫酸銨。硫酸銨與強鹼反應，放出氨。將氨蒸餾到過量的標准無機溶液中，再用標准鹼溶液進行滴定。根據測得的氨量，計算樣品的總氮量。

、試劑與材料：

濃硫酸、硫酸鉀-硫酸銅粉末(稱取80g硫酸鉀和20g硫酸銅(五水)，0.3g二氧化硒研細混合)、30%氫氧化鈉溶液、2%硼酸溶液、0.01M標准鹽酸、混合指示劑(田氏指示劑)儲存液(取50ml0.1%甲烯藍乙醇溶液與200ml0.1%甲基紅溶液混合，儲存於棕色瓶中備用。此指示劑在PH5.2為紫色;PH為5.4為暗灰色或灰色;PH5.6為綠色;變色點為PH5.4)、硼酸-田氏指示劑混合液(100ml2%硼酸溶液，滴加約1ml田氏指示劑，搖勻後，溶液呈紫紅色)、蛋白質樣品、容量瓶、吸管、凱氏燒瓶、凱氏定氮蒸餾裝置、微量滴定管、電爐

三、操作方法

1、樣品處理：固體樣品，應在105℃乾燥至恆重。液體樣品可直接吸取一定量，也可經適當稀釋後，吸取一定量進行測定，使每一樣品的含氮量在0.2-1.0mg范圍內。

2、消化：取一定量樣品，於50ml乾燥的凱氏燒瓶內。加入300mg硫酸鉀-硫酸銅混合粉末，再加入3ml濃硫酸。用電爐加熱，在通風廚中消化，瓶口加一小漏斗。先以文火加熱，避免泡沫飛濺，不能讓泡沫上升到瓶頸，待泡沫停止發生後，加強火保持瓶內液體沸騰。時常轉動燒瓶使樣品全部消化完全，直至消化液清澈透明。

另取凱氏瓶一個，不加樣品，其它操作相同，作為空白試驗，用以測定試劑中可能含有的微量含氮物質，以對樣品進行校正。

3、蒸餾：將微量凱氏蒸餾裝置洗滌(先用水蒸氣洗滌)干凈。將凱氏燒瓶中的消化液冷卻後，全部轉入100ml的容量瓶，用蒸餾水定容至刻度。

吸取20ml稀釋消化液，置於蒸餾裝置的反應室中，加入10ml30%氫氧化鈉溶液，將玻璃塞塞緊，於漏斗中加一些蒸餾水，作為水封。

取一三角瓶，加入10ml硼酸-田氏指示劑混合液，置於冷凝管之下口，冷凝管口應浸沒在硼酸液面之下，以保證氨的吸收。

加熱水蒸汽發生器，沸騰後，夾緊夾子，凱氏蒸餾。三角瓶中的硼酸-指示劑混合液，吸收蒸餾出的氨，由紫紅色變為綠色。蒸餾15min，讓硼酸液面離開冷凝管口，再蒸1-2min以沖洗冷凝管口。空白試驗按同樣操作進行。

4、滴定：樣品和空白均蒸餾完畢後，用0.01M標准鹽酸滴定，至硼酸-指示劑混合液由綠色變回淡紫色，即為滴定終點。

四、計算 樣品總氮量(mg)=(A-B)×c×14×100/20

式中：A：樣品滴定時消耗的標准鹽酸體積 B：空白滴定時消耗的鹽酸體積 C：標准鹽酸的當量濃度 14：氮的相對分子量 20：用於蒸餾的稀釋消化液體積 100：稀釋消化液的體積

樣品中粗蛋白含量(mg)=樣品總氮量(mg)×6.25

㈤ 凱氏定氮法，為什麼蒸餾時，液體變成藍綠色透明後，還要繼續加熱

一、實驗原理
蛋白質是含氮的有機化合物。蛋白質與硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質分解，分解的氨與硫酸結合生成硫酸銨。然後鹼化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收後再以硫酸或鹽酸標准溶液 滴定，根據酸的消耗量乘以換算系數，蛋白質含量。含氮量*6.25=蛋白含量
1.有機物中的胺根在強熱和CuSO4，濃H2SO4 作用下，硝化生成（NH4）2SO4

凱氏定氮法
凱氏定氮法反應式為：
2NH2+H2SO4+2H=(NH4)2SO4 （其中CuSO4做催化劑）
2.在凱氏定氮器中與鹼作用，通過蒸餾釋放出NH3 ，收集於H3BO3 溶液中反應式為:
(NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO4

2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O

3. 用已知濃度的H2SO4（或HCI）標准溶液滴定，根據HCI消耗的量計算出氮的含量，然後乘以相應的換算因子，既得蛋白質的含量

反應式為：

(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=(NH4)2SO4+4H3BO3

(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3

二、操作
1、 樣品處理：精密稱取0.2-2.0g固體樣品或2-5g半固體樣品或吸取10-20ml液體樣品（約相當氮30-40mg），移入乾燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸銅，6g硫酸鉀及20毫升硫酸，稍搖勻後於瓶口放一小漏斗，將瓶以45度角斜支於有小孔的石棉網上，小火加熱，待內容物全部炭化，泡沫完全停止後，加強火力，並保持瓶內液體微沸，至液體呈藍綠色澄清透明後，再繼續加熱0.5小時。取下放冷，小心加20ml水，放冷後，移入100ml容量瓶中，並用少量水洗定氮瓶，洗液並入容量瓶中，再加水至刻度，混勻備用。取與處理樣品相同量的硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸同一方法做試劑空白試驗。但是此法比較危險，不易在實驗室演示，現在大多數實驗室有消煮儀一次可以進行多個（一次可以消煮16個樣品）樣品處理，並有通風櫥進行通風，溫度可以自己設定，更加安全和可操作性，因此逐步成為主要的凱氏定氮法的首選處理方法。
一般消解溫度都設在240度及240度以上，如果想快速消解可以適當提高溫度甚至可以用最大溫度進行消解。
2、按圖裝好定氮裝置，於水蒸氣發生器內裝水約2/3處加甲基紅 指示劑數滴及數毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入數粒玻璃珠以防暴沸，用調壓器控制，加熱煮沸水蒸氣發生瓶內的水。
3、向接收瓶內加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示劑1滴，並使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml樣品消化液由小玻璃杯流入反應室，並以10ml水洗滌小燒杯使流入反應室內，塞緊小玻璃杯的棒狀玻璃塞。將10ml 40%氫氧化鈉溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其緩慢流入反應室，不能立即將玻璃蓋塞緊，這樣易使玻璃塞粘在進樣口，應先用蒸餾水沖洗然後再蓋，並加水於小玻璃杯以防漏氣。夾緊螺旋夾，開始蒸餾，蒸氣通入反應室使氨通過冷凝管而進入接收瓶內，蒸餾5min。移動接收瓶，使冷凝管下端離開液皿，再蒸餾1min，然後用少量水沖洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.05N硫酸或0.05N鹽酸標准溶液定至灰色或藍紫色為終點。
同時吸取10.0ml試劑空白消化液按3操作。

三、計算
X =(（V1-V2）*N*0.014)/( m*（10/100）) *F*100%
X：樣品中蛋白質的百分含量，g；
V1：樣品消耗硫酸或鹽酸標准液的體積，ml；
V2：試劑空白消耗硫酸或鹽酸標准溶液的體積，ml；
N：硫酸或鹽酸標准溶液的當量濃度；
0.014：1N硫酸或鹽酸標准溶液1ml相當於氮克數；
m：樣品的質量（體積），g（ml）；
F：氮換算為蛋白質的系數 。蛋白質中的氮含量一般為15～17.6%，按16%計算乘以6.25即為蛋白質，乳製品為6.38，麵粉為5.70，玉米、高粱為6.24，花生為5.46，米為5.95，大豆及其製品為5.71，肉與肉製品為6.25，大麥、小米、燕麥、裸麥為5.83，芝麻、向日葵為 5.30。

㈥ 凱氏法測定氮

方法提要

試樣在硫酸鉀、硫酸銅和硒的共存下，用硫酸煮解氧化，使試樣中的氮轉化為硫酸銨，再用氫氧化鈉鹼化後，加熱蒸餾逸出氨，經硼酸溶液吸收，用鹽酸標准溶液滴定並計算試樣中氮的含量。

方法適用於水系沉積物及土壤中氮量的測定。

方法檢出限(3s):0.002%。

測定范圍:0.006%～0.4%。

儀器及裝置

通用的凱氏定氮蒸餾裝置。

凱氏燒瓶50mL。

錐形瓶150mL。

試劑

硫酸。

氫氧化鈉溶液(400g/L)。

鹽酸溶液c(HCl)=1mol/L量取84mLHCl，用水稀釋至1000mL。

(1+1)王水75mLHCl和25mLHNO₃混合後，加入100mL水混勻。用時配製。

混合加速劑將硫酸鉀(K₂SO₄)和硫酸銅(CuSO₄·5H₂O)按(10+1)比例，在玻璃研缽中研磨混勻，裝入寬口玻璃瓶中。

硒溶液ρ(Se)=10.0g/L稱取5.0g優級純硒粉置於250mL燒杯中，加入10mL(1+1)王水溶解後，用水稀釋至500mL，搖勻。裝入磨口玻璃瓶中備用。

硼酸溶液稱取20g硼酸溶解在1000mL水中。

甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑稱取0.1g甲基紅和0.5g溴甲酚綠，溶解在100mL乙醇中，移入玻璃瓶中備用。變色范圍:pH4.4(紅色)～pH5.4(藍色)。

含有甲基紅、溴甲酚綠指示劑的硼酸混合溶液取100mL硼酸溶液，加入2mL甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑，用氫氧化鈉溶液及鹽酸溶液調節溶液呈紫紅色，此時該溶液的pH為4.5。

硼砂標准溶液c(1/2Na₂B₄O₇)=0.0200mol/L稱取1.9068g硼砂(Na₂B₄O₇·10H₂O)置於250mL燒杯中，加100mL水，溶解後移入500mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。

鹽酸標准溶液吸取20mL1mol/LHCl溶液置於1000mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。

標定分取20.00mL硼砂標准溶液置於150mL錐形燒杯中，加1滴甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑，用鹽酸標准溶液進行滴定，溶液由藍色變為紫紅色為終點。同時分取20.0mL水作空白試驗。按下式計算鹽酸標准溶液濃度:

岩石礦物分析第四分冊資源與環境調查分析技術

式中:c為鹽酸標准溶液的濃度，mol/L;0.0200為硼砂標准溶液的濃度數值，單位用了mol/L;V₁為硼砂標准溶液的體積，mL;V₂為滴定消耗鹽酸標准溶液的體積，mL;V₀為滴定空白試驗溶液消耗鹽酸標准溶液的體積，mL。

分析步驟

試樣的煮解。稱取0.1～1.0g(精確至0.0001g)試樣(粒徑小於0.075mm，經室溫乾燥後，裝入磨口小玻璃瓶中備用)置於50mL凱氏燒瓶中，加入2g混合加速劑及1mL硒溶液，加少許水潤濕，加入5mLH₂SO₄，瓶口放一小漏斗，於通風櫃內，在調溫電爐上先低溫加熱，待溶液中無泡沫發生(約需15min)後，再升高溫度，使瓶內硫酸蒸汽迴流的高度控制在瓶頸上部的1/3處，要經常搖動凱氏燒瓶，直至試樣和煮解液完全變為灰白帶綠色(約需15min)後，再繼續煮解1h。全部煮解時間需85～90min，切勿煮干。煮解完畢，取下凱氏燒瓶，冷卻，以待蒸餾。

蒸餾。在150mL錐形瓶中加入5mL硼酸混合溶液，將其套在凱氏定氮蒸餾裝置的下端，埠置於硼酸混合溶液液面以下3～4cm處。把煮解液全部轉入蒸餾器的內室，並用水沖洗凱氏燒瓶4次，沖洗液用量不要超過40mL，打開冷卻水，經三通管加入20mLNaOH溶液，立即關閉蒸餾室，打開蒸氣夾，用蒸氣蒸餾。當錐形瓶內的餾出液達到50～55mL(約需8～10min)後，用廣泛pH試紙置冷卻管口碰觸蒸餾液，如無鹼性反應，表示氨已蒸餾完畢。若仍為鹼性反應，應繼續蒸餾直至無鹼性反應。同時進行空白試驗的蒸餾。

滴定。已蒸餾在150mL錐形瓶吸收的氨溶液，用鹽酸標准溶液滴定，滴定至溶液由藍色突躍變為紫紅色即為滴定終點，記錄鹽酸標准溶液的體積。同時進行空白試驗的蒸餾及其吸收液的滴定，記錄鹽酸標准溶液的體積。

按下式計算氮的含量:

岩石礦物分析第四分冊資源與環境調查分析技術

式中:w(N)為氮的質量分數，%;V為滴定試樣溶液消耗鹽酸標准溶液的體積，mL;V₀為滴定空白溶液消耗鹽酸標准溶液的體積，mL;c為鹽酸標准溶液的濃度，mol/L;0.014為氮原子的毫摩爾質量的數值，單位用g/mmol;m為試樣的質量，g。

注意事項

本方法測得的氮不包括硝態氮、亞硝態氮。因硝酸根離子在煮解過程中不會完全還原為銨離子，且易揮發損失。但一般土壤試樣中硝態氮含量不超過全氮量的1%，故可以忽略不計。

㈦ 有誰知道凱氏定氮的具體步驟，注意事項，！！

1、消化:精密稱取大豆樣品1.0g左右，放入乾燥的250 ml消化管中，加入0.4g CuSO4 7g K2SO4 10ml H2SO4先200'C炭化，待泡沫停止後提高溫度到450'C，加熱至液體沸騰，待瓶內液體呈藍綠色透明後，再繼續加熱0.5h。

冷卻後加入20ml水，移入100ml容量瓶中，用少量水洗滌消化管2~3次，洗液合並於容量瓶中定容。

2、蒸餾:連接凱氏定氮裝置，於水蒸氣發生瓶內裝水至2/3處，加甲基紅指示劑數滴及數ml硫酸，保持水呈酸性。加入數粒玻璃珠以防暴沸，調節火力加熱煮沸水蒸氣發生瓶內的水。

3、向吸收瓶內加入20g/L硼酸溶液20ml及混合指示劑2滴，並使冷凝管下端插入液面以下，吸取10ml樣品消化稀釋液由進樣口進入反應室，並以10ml水洗滌進樣口使其流入反應室內，將400g/L NaOH溶液10ml倒入進樣口，立即夾緊螺旋夾，並加入少量蒸餾水，密封進樣口。

當蒸汽通入反應室時，准確計時，反應產生的氨氣通過冷凝管進入吸收瓶，蒸餾5min，移動吸收瓶，使冷凝管下端離開液面，再蒸餾Imin，然後用少量水沖洗冷凝管下端外部，取下吸收瓶。

停止加熱，使反應室內的液體進入汽水分離器，打開進樣口的螺旋夾，將汽水分離器的液體放出。再向反應室內加入蒸餾水，夾緊螺旋夾，再次進行加熱至水蒸汽放出，停止加熱，使反應室內的水進入汽水分離器，進行洗滌。

4、滴定:用0.025mol/L硫酸標准溶液滴定吸收液至灰色。

5、計算:X= 2cVX 14X5.71/m

X為樣品中蛋白質的含量，%；c為硫酸標准溶液的濃度，molL；V為樣品消化液消耗硫酸標准溶液的體積，ml；m為樣品的質量，g。

注意事項

(1) 樣品應是均勻的。固體樣品應預先研細混勻，液體樣品應振搖或攪拌均勻。

(2) 樣品放入定氮瓶內時，不要沾附頸上。萬-沾附可用少量水沖下，以免被檢樣消化不完全，結果偏低。

(3) 消化時如不容易呈透明溶液，可將定氮瓶放冷後，慢慢加入30%過氧化氫(H2O2)2-3ml，促使氧化。

(4) 在整個消化過程中，不要用強火。保持和緩的沸騰，使火力集中在凱氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白質在無硫酸存在的情況下，使氮有損失。

(5)如硫酸缺少， 過多的硫酸鉀會引起氨的損失，這樣會形成硫酸氫鉀，而不與氨作用。因此，當硫酸過多的被消耗或樣品中脂肪含量過高時，要增加硫酸的量。

(6)加入硫酸鉀的作用為增加溶液的沸點，硫酸銅為催化劑，硫酸銅在蒸餾時作鹼性反應的指示劑。

(7)混合指示劑在鹼性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。如果沒有溴甲酚綠，可單獨使用0.1%甲基紅乙醇溶液。

(8) 氨是否完全蒸餾出來，可用PH試紙試餾出液是否為鹼性。

(7)凱氏蒸餾裝國標擴展閱讀：

凱氏定氮法原理

凱氏定氮法首先將含氮有機物與濃硫酸共熱，經一系列的分解、碳化和氧化還原反應等復雜過程，最後有機氮轉變為無機氮硫酸銨，這一過程 稱為有機物的消化。

為了加速和完全有機物質的分解，縮短消化時間，在消化時通常加入硫酸鉀、硫酸銅、氧化汞、過氧化氫等試劑，加入硫酸鉀可以提高消化液的沸點而加快有機物分解，除硫酸鉀外，也可以加入硫酸鈉、氯化鉀等鹽類類提高沸點，但效果不如硫酸鉀。

硫酸銅起催化劑的作用。凱氏定氮法中可用的催化劑種類很多，除硫酸銅外，還有氧化汞、汞、硒粉、鉬酸鈉等，但考慮到效果、價格及環境污染等多種因素，應用最廣泛的是硫酸銅。

㈧ 凱氏定氮法的原理是什麼

不知道你要問什麼，你已經把原理寫出來了。
如果再說仔細一點，就是有機物與濃硫酸共熱，400攝氏度以上，此時的有機物中的N元素完全分解生成NH3，氨氣揮發出來，通過一系列的反應測定氨氣的量，即可計算有機物中的N元素含量。

㈨ 關於凱氏定氮法

用鹽酸滴定至灰色或藍紫色為終點。

具體可以參考GB/T5009.5-2003《食品中蛋白質的測定》

下載鏈接：http://www.foodmate.net/standard/sort/3/2683.html

㈩ 估元素國標的檢測方法

用紫外光光度測定蛋白質含量
引用：

6種測定蛋白質含量
、微量凱氏（kjeldahl）定氮
品與濃硫酸共熱含氮機物即解產氨（消化）氨與硫酸作用變硫酸氨經強鹼鹼化使解放氨借蒸汽氨蒸至酸液根據酸液程度計算品氮含量若甘氨酸例其反應式：
nh2ch2cooh+3h2so4——2co2+3so2+4h2o+nh3 (1)
2nh3+h2so4——(nh4)2so4 (2)
(nh4)2so4+2naoh——2h2o+na2so4+2nh3 (3)
反應（1）、(2)凱氏瓶內完反應（3）凱氏蒸餾裝置進行
加速消化加入cuso4作催化劑k2so4提高溶液沸點收集氨用硼酸溶液滴定則用強酸實驗計算略
計算所結品總氮量欲求 品蛋白含量應總氮量減非蛋白
氮即欲進步求品蛋白質含量即用品蛋白氮乘6．25即
二、雙縮脲（biuret）
（）實驗原理
雙縮脲（nh3conhconh3）兩脲經180℃左右加熱放氨產物強鹼性溶液雙縮脲與cuso4形紫色絡合物稱雙縮脲反應凡具兩醯胺基或兩直接連接肽鍵或能間碳原相連肽鍵類化合物都雙縮脲反應
紫色絡合物顏色深淺與蛋白質濃度比與蛋白質量及氨基酸關故用測定蛋白質含量測定范圍1-10mg蛋白質干擾測定物質主要：硫酸銨、tris緩沖液某些氨基酸等
優點較快速 同蛋白質產顏色深淺相近及干擾物質少主要缺點靈敏度差雙縮脲用於需要快速並需要十精確蛋白質測定
（二）試劑與器材
1. 試劑：
（1）標准蛋白質溶液：用標准結晶牛血清清蛋白（bsa）或標准酪蛋白配製10mg/ml標准蛋白溶液用bsa濃度1mg/mla2800.66校其純度需要標准蛋白質預先用微量凱氏定氮測定蛋白氮含量計算其純度再根據其純度稱量配製標准蛋白質溶液牛血清清蛋白用h2o 或0.9%nacl配製酪蛋白用0．05n naoh配製
（2）雙縮脲試劑：稱1.50克硫酸銅（cuso4?5h2o）6.0克酒石酸鉀鈉（knac4h4o6?4h2o）用500毫升水溶解攪拌加入300毫升10% naoh溶液用水稀釋1升貯存於塑料瓶（或內壁塗石蠟瓶）試劑期保存若貯存瓶黑色沉澱現則需要重新配製
2. 器材：
見光光光度計、試管15支、旋渦混合器等
（三）操作
1. 標准曲線測定：取12支試管兩組別加入00.20.40.60.81.0毫升標准蛋白質溶液用水補足1毫升加入4毫升雙縮脲試劑充搖勻室溫（20～25℃）放置30鍾於540nm處進行比色測定用未加蛋白質溶液第支試管作空白照液取兩組測定平均值蛋白質含量橫座標光吸收值縱座標繪制標准曲線
2、品測定：取2～3試管用述同測定未知品蛋白質濃度注意品濃度要超10mg/ml

三、folin—酚試劑（lowry）
（）實驗原理
種蛋白質測定靈敏應用廣泛種由於其試劑乙配製較困難（現已訂購）近逐漸考馬斯亮蘭所取代顯色原理與雙縮脲相同加入第二種試劑即folin—酚試劑增加顯色量提高檢測蛋白質靈敏度兩種顯色反應產深蘭色原：鹼性條件蛋白質肽鍵與銅結合復合物folin—酚試劑磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽蛋白質酪氨酸苯丙氨酸殘基原產深蘭色（鉬蘭鎢蘭混合物）定條件蘭色深度與蛋白量比
folin—酚試劑早由lowry確定蛋白質濃度測定基本步驟物化領域廣泛應用測定優點靈敏度高比雙縮脲靈敏缺點費間較要精確控制操作間標准曲線嚴格直線形式且專性較差干擾物質較雙縮脲反應發干擾離同容易干擾lowry反應且者影響要酚類、檸檬酸、硫酸銨、tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均干擾作用濃度較低尿素（0.5%）硫酸納（1%）硝酸納（1%）三氯乙酸（0.5%）乙醇（5%）乙醚（5%）丙酮（0.5%）等溶液顯色影響些物質濃度高必須作校曲線含硫酸銨溶液須加濃碳酸鈉—氫氧化鈉溶液即顯色測定若品酸度較高顯色色淺則必須提高碳酸鈉—氫氧化鈉溶液濃度1～2倍
進行測定加folin—酚試劑要特別該試劑僅酸性ph條件穩定述原反應ph=10情況發故folin酚試劑加鹼性銅—蛋白質溶液必須立即混勻便磷鉬酸—磷鎢酸試劑破壞前原反應即能發
適用於酪氨酸色氨酸定量測定
檢測低蛋白質量達5mg通測定范圍20~250mg
（二）試劑與器材
1.試劑
（1）試劑甲：
（a）10克 na2co32克 naoh0.25克酒石酸鉀鈉 （knac4h4o6?4h2o）溶解於500毫升蒸餾水
（b）0.5克硫酸銅（cuso4?5h2o）溶解於100毫升蒸餾水每使用前50份（a）與1份（b）混合即試劑甲
（2）試劑乙：2升磨口流瓶加入100克鎢酸鈉（na2wo4?2h2o）,25克鉬酸鈉（na2moo4?2h2o）及700毫升蒸餾水再加50毫升85%磷酸100毫升濃鹽酸充混合接流管火流10流結束加入150克硫 酸 鋰（li2so4）50毫升蒸餾水及數滴液體溴口繼續沸騰15鍾便驅除量溴冷卻溶液呈黃色（仍呈綠色須再重復滴加液體溴步驟）稀釋至1升濾濾液置於棕色試劑瓶保存使用用標准naoh滴定酚酞作指示劑適稀釋約加水1倍使終酸濃度1n左右
（3）標准蛋白質溶液: 精確稱取結晶牛血清清蛋白或 g—球蛋白溶於蒸餾水濃度250mg/ml左右牛血清清蛋白溶於水若混濁改用0.9%nacl溶液
2. 器材
（1）見光光光度計
（2）旋渦混合器
（3）秒錶
（4）試管16支
（三）操作
1. 標准曲線測定：取16支試管1支作空白3支留作未知品其餘試管兩組別加入00.10.20.40.60.81.0毫升標准蛋白質溶液（濃度250mg/ml）用水補足1.0毫升每支試管加入5毫升試劑甲旋渦混合器迅速混合於室溫（20～25℃）放置10鍾再逐管加入0.5毫升試劑乙（folin—酚試劑）同立即混勻步混合速度要快否則使顯色程度減弱室溫放置30鍾未加蛋白質溶液第支試管作空白照於700nm處測定各管溶液吸光度值蛋白質量橫座標吸光度值縱座標繪制標准曲線
注意：lowry反應顯色隨間斷加深各項操作必須精確控制間即第1支試管加入5毫升試劑甲始計1鍾第2支試管加入5毫升試劑甲2鍾加第3支試管余類推全部試管加完試劑甲若已超10鍾則第1支試管立即加入0.5毫升試劑乙1鍾第2支試管加入0.5毫升試劑乙2鍾加第3支試管余類推待支試管加完試劑再放置30鍾始測定光吸收每鍾測品
進行試管操作防止錯每位都必須實驗記錄本預先畫面表格表每試管要加入量（毫升）並按由左至右由至順序逐管加入面兩排計算每管蛋白質量（微克）測吸光度值
folin—酚試劑實驗表

管號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
標准蛋白質 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
（250mg/ml）
未知蛋白質 0.2 0.4 0.6
（約250mg/ml）
蒸餾水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4
試劑甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
試劑乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
每管蛋白質量（mg）
吸光度值（a700）
2. 品測定：取1毫升品溶液（其約含蛋白質20~250微克）按述進行操作取1毫升蒸餾水代替品作空白照通品測定與標准曲線測定放起同進行即標准曲線測定各試管面再增加3試管表8、9、10試管
根據所測品吸光度值標准曲線查相應蛋白質量計算品溶液蛋白質濃度
注意:由於各種蛋白質含同量酪氨酸苯丙氨酸顯色深淺往往隨同蛋白質變化本測定通適用於測定蛋白質相濃度（相於標准蛋白質）

四、改良簡易folin—酚試劑
（）試劑
1. 試劑甲：鹼性銅試劑溶液含0.5n naoh、10%na2co3、0.1%酒石酸鉀0.05%硫酸銅配製注意硫酸銅用少量蒸餾水溶解加入2. 試劑乙：與前面基本相同臨用加蒸餾水稀釋8倍
3. 標准蛋白質溶液：同基本
（二）操作步驟
測定標准曲線與品溶液操作與基本相同試劑甲改1毫升室溫放置10鍾試劑乙改4毫升55℃恆溫水浴保溫5鍾用流水冷卻660nm測定其吸光度值
改良快速簡易獲與 folin—酚試劑（即lowry基本）相接近結
五、考馬斯亮蘭（bradford）
（）實驗原理
雙縮脲（biuret）folin—酚試劑（lowry）明顯缺點許限制促使科家尋找更蛋白質溶液測定
1976由bradford建立考馬斯亮蘭（bradford）根據蛋白質與染料相結合原理設計種蛋白質測定具超其幾種突優點廣泛應用目前靈敏度高蛋白質測定
考馬斯亮蘭g-250染料酸性溶液與蛋白質結合使染料吸收峰位置（lmax）由465nm變595nm溶液顏色由棕黑色變蘭色經研究認染料主要與蛋白質鹼性氨基酸（特別精氨酸）芳香族氨基酸殘基相結合
595nm測定吸光度值a595與蛋白質濃度比
bradford突優點：
（1）靈敏度高據估計比lowry約高四倍其低蛋白質檢測量達1mg蛋白質與染料結合產顏色變化蛋白質－染料復合物更高消光系數光吸收值隨蛋白質濃度變化比lowry要
（2）測定快速、簡便需加種試劑完品測定需要5鍾左右由於染料與蛋白質結合程約要2鍾即完其顏色1內保持穩定且5鍾至20鍾間顏色穩定性完全用像lowry費嚴格控制間
（3）干擾物質少干擾lowryk+、na+、mg2+離、tris緩沖液、糖蔗糖、甘油、巰基乙醇、edta等均干擾測定
缺點：
（1）由於各種蛋白質精氨酸芳香族氨基酸含量同bradford用於同蛋白質測定較偏差製作標准曲線通選用 g—球蛋白標准蛋白質減少面偏差
（2）仍些物質干擾測定主要干擾物質：污劑、 triton x-100、十二烷基硫酸鈉（sds）0.1nnaoh（同0.1n酸干擾lowary）
（3）標准曲線輕微非線性能用beer定律進行計算能用標准曲線測定未知蛋白質濃度
（二）試劑與器材
1. 試劑：
（1）標准蛋白質溶液用 g—球蛋白或牛血清清蛋白(bsa)配製1.0mg/ml0.1mg/ml標准蛋白質溶液
（2）考馬斯亮蘭g—250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭g—250溶於50ml 95%乙醇再加入120ml 85%磷酸用水稀釋至1升
2. 器材：
（1）見光光光度計
（2）旋渦混合器
（3）試管16支
（三）操作
1. 標准
（1）取16支試管1支作空白3支留作未知品其餘試管兩組按表順序別加入品、水試劑即用1.0mg/ml標准蛋白質溶液給各試管別加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml用離水補充0.1ml各試管別加入5.0ml考馬斯亮蘭g—250試劑每加完管立即旋渦混合器混合（注意要太劇烈免產量氣泡難於消除）未知品加量見表第8、9、10管
（2）加完試劑2-5鍾即始用比色皿光光度計測定各品595nm處光吸收值a595空白照第1號試管即0.1mlh2o加5.0mlg—250試劑
注意：使用石英比色皿（易洗染色）用塑料或玻璃比色皿使用立即用少量95%乙醇盪洗洗染色塑料比色皿決用乙醇或丙酮間浸泡

考馬斯亮蘭實驗表
管 號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
標准蛋白質 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
(1.0mg/ml)
未知蛋白質 0.02 0.04 0.06
(約1.0mg/ml)
蒸餾水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04
考馬斯亮藍
g－250試劑 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
每管蛋
白質量（mg）
光吸收值
（a595）
（3）用標准蛋白質量（mg）橫座標用吸光度值a595縱座標作圖即條標准曲線由標准曲線根據測未知品a595值即查未知品蛋白質含量
0.5mg牛血清蛋白/ml溶液a595約0.50
2. 微量
品蛋白質濃度較稀（10－100mg/ml）,取量（包括補加水）加0.5ml或1.0ml, 空白照則別0.5ml或1.0ml h2o, 考馬斯亮藍g－250試劑仍加5.0ml, 同作相應標准曲線測定595nm光吸收值
0.05mg牛血清蛋白/ml溶液a595約0.29
六、紫外吸收
蛋白質酪氨酸、苯丙氨酸色氨酸殘基苯環含共軛雙鍵使蛋白質具吸收紫外光性質吸收高峰280nm處其吸光度（即光密度值）與蛋白質含量比外蛋白質溶液238nm光吸收值與肽鍵含量比利用定波蛋白質溶液光吸收值與蛋白質濃度比關系進行蛋白質含量測定
紫外吸收簡便、靈敏、快速消耗品測定仍能收使用低濃度鹽例化制備用（nh4）2so4等數緩沖液干擾測定特別適用於柱層析洗脫液快速連續檢測需測定蛋白質濃度變化需知道其絕值
特點測定蛋白質含量准確度較差干擾物質用標准曲線測定蛋白質含量些與標准蛋白質酪氨酸色氨酸含量差異蛋白質定誤差故該適於用測定與標准蛋白質氨基酸組相似蛋白質若品含嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光物質現較干擾核酸干擾通查校表再進行計算加適校同蛋白質核酸紫外吸收相同雖經校測定結存定誤差
外進行紫外吸收測定由於蛋白質吸收高峰ph改變變化要注意溶液ph值測定品ph要與測定標准曲線ph相致
面介紹四種紫外吸收：
1. 280nm光吸收
蛋白質酪氨酸、苯丙氨酸色氨酸280nm處具吸收且各種蛋白質三種氨基酸含量差別測定蛋白質溶液280nm處吸光度值用紫外吸收
測定待測蛋白質溶液倒入石英比色皿用配製蛋白質溶液溶劑（水或緩沖液）作空白照紫外光度計直接讀取280nm吸光度值a280蛋白質濃度控制0.1～1.0mg/ml左右通用1cm光徑標准石英比色皿盛濃度1mg/ml蛋白質溶液a280約1.0左右由立即計算蛋白質致濃度
許蛋白質定濃度定波光吸收值（a1％1cm）文獻數據查根據光吸收值較准確計算蛋白質濃度式列蛋白質濃度與（a1％1cm）值（即蛋白質溶液濃度1%光徑1cm光吸收值）關系文獻值a1％1cm,?稱百吸收系數或比吸收系數
蛋白質濃度 = (a280′10 )/ a1％1cm,280nm (mg/ml)
(q 1%濃度?10mg/ml)
例：牛血清清蛋白 ： a1％1cm=6.3 (280nm)
溶菌酶 ： a1％1cm=22.8 (280nm)

若查待測蛋白質a1％1cm值則選用種與待測蛋白質酪氨酸色氨酸含量相近蛋白質作標准蛋白質用標准曲線進行測定標准蛋白質溶液配製濃度1.0mg/ml用標准蛋白質牛血清清蛋白（bsa）
標准曲線測定：取6支試管按表編號並加入試劑：
管號 1 2 3 4 5 6
bsa（1.0mg/ml） 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0
h2o 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0
a280
用第1管空白照各管溶液混勻紫外光光度計測定吸光度a280a280縱座標各管蛋白質濃度或蛋白質量（mg）橫座標作圖標准曲線應直線利用標准曲線根據測未知品a280值即查未知品蛋白質含量用2至6管a280值與相應試管蛋白質濃度計算該蛋白質a1％1cm,280nm
2. 280nm260nm吸收差
核酸紫外光強吸收280nm處吸收比蛋白質強10倍（每克）核酸260nm處吸收更強其吸收高峰260nm附近核酸260nm處消光系數280nm處2倍蛋白質則相反280nm紫外吸收值於260nm吸收值通：

純蛋白質光吸收比值：a280/a260 ? 1.8
純核酸光吸收比值： a280/a260 ? 0.5
含核酸蛋白質溶液別測定其a280a260由吸收差值用面經驗公式即算蛋白質濃度
蛋白質濃度(mg/ml)=1.45×a280－0.74×a260
經驗公式通系列已知同濃度比例蛋白質（酵母烯醇化酶）核酸（酵母核酸）混合液所測定數據建立
3. 215nm與225nm吸收差
蛋白質稀溶液由於含量低能使用280nm光吸收測定用215nm與225nm吸收值差通標准曲線測定蛋白質稀溶液濃度
用已知濃度標准蛋白質配製20～100 mg/ml系列5.0ml蛋白質溶液別測定215nm225nm吸光度值並計算吸收差：
吸收差d= a215 －a225
吸收差d縱座標蛋白質濃度橫座標繪標准曲線再測未知品吸收差即由標准曲線查未知品蛋白質濃度
本蛋白質濃度20~100mg/ml范圍內蛋白質濃度與吸光度比nacl、（nh4）2so4及0.1m磷酸、硼酸tris等緩沖液都顯著干擾作用0.1n naoh, 0.1m乙酸、琥珀酸、鄰苯二甲酸、巴比妥等緩沖液215nm光吸收值較必須其濃度降0.005m才顯著影響
4. 肽鍵測定
蛋白質溶液238nm處光吸收強弱與肽鍵少比用標准蛋白質溶液配製系列50～500mg/ml已知濃度5.0ml蛋白質溶液測定238nm光吸收值a238a238縱座標, 蛋白質含量橫座標繪制標准曲線未知品濃度即由標准曲線求
進行蛋白質溶液柱層析離洗脫液用238nm檢測蛋白質峰位
本比280nm吸收靈敏種機物醇、酮、醛、醚、機酸、醯胺類氧化物等都干擾作用所用機鹽機鹼水溶液進行測定若含機溶劑先品蒸干或用其除干擾物質用水、稀酸稀鹼溶解再作測定
感覺這樣的提問沒有什麼意義
不要多想，想多了累