离子交换层析柱拖尾

① 请问 气相色谱质谱 液相色谱质谱 还有离子色谱 几者之间的区别

色谱法,又称色层法或层析法，是一种物理化学分析方法，它利用不同溶质（样品）与固定相和流动相之间的作用力（分配、吸附、离子交换等）的差别，当两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次平衡，使各溶质达到相互分离。它的英文名称为：chromatography这个词来源于希腊字 chroma和 graphein，直译成英文时为 color和writing两个字;直译成中文为色谱法。但也有人意译为色层法或层析法。

在色谱法中，静止不动的一相（固体或液体）称为固定相（stationary phase） ；运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相（mobile phase）。

流动相是气体的称为气相色谱，流动相是液体的称为液相色谱。

离子色谱：
狭义定义：
以低交换容量的离子交换树脂为固定相对离子性物质进行分离，用电导检测器连续检测流出物电导变化的一种液相色谱方法。
广义定义：
利用被测物质的离子性进行分离和检测的液相色谱法。
所以离子色谱实际上是液相色谱的一种。

质谱分析法是通过对被测样品离子的质荷比的测定来进行分析的一种分析方法。被分析的样品首先要离子化，然后利用不同离子在电场或磁场的运动行为的不同，把离子按质荷比（m/z）分开而得到质谱，通过样品的质谱和相关信息，可以得到样品的定性定量结果。

简单来说色谱是是物质的分离方法，质谱是检测方法。

一般的色谱用电导检测器或UV检测，牛B的用质谱检测。

② HPLC原理是什么

原理：

储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相）内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别。

被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据就可以以图谱形式打印出来，以便研究人员分析。

(2)离子交换层析柱拖尾扩展阅读：

高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。

①高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。

②高速：分析速度快、载液流速快，较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。

③高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。

④高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在μL数量级。

⑤应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。

⑥柱子可反复使用：用一根柱子可分离不同化合物

⑦样品量少、容易回收：样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。

此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也有缺点，与气相色谱相比各有所长，相互补充。

高效液相色谱的缺点是有“柱外效应”。在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱。

HPLC使用的色谱柱是很细的(1~6 mm)，所用固定相的粒度也非常小（几μm到几十μm)，所以流动相在柱中流动受到的阻力很大，在常压下，流动相流速十分缓慢，柱效低且费时。

为了达到快速、高效分离，必须给流动相施加很大的压力，以加快其在柱中的流动速度。为此，须用高压泵进行高压输液。高压、高速是高效液相色谱的特点之一。HPLC使用的高压泵应满足下列条件：

a. 流量恒定，无脉动，并有较大的调节范围（一般为1~10 mL/min)；

b. 能抗溶剂腐蚀；

c. 有较高的输液压力；对一般分离，60×10^5Pa的压力就满足了，对高效分离，要求达到150~300×10^5Pa。

⑴往复式柱塞泵

当柱塞推入缸体时，泵头出口（上部）的单向阀打开，同时，流动相进入的单向阀（下部）关闭，这时就输出少量的流体。

反之，当柱塞向外拉时，流动相入口的单向阀打开，出口的单向阀同时关闭，一定量的流动相就由其储液器吸入缸体中。这种泵的特点是不受整个色谱体系中其余部分阻力稍有变化的影响，连续供给恒定体积的流动相。

⑵气动放大泵

其工作原理是：压力为 p1 的低压气体推动大面积（ SA ）活塞A ，则在小面积（ SB ）活塞 B 输出压力增大至 p2 的液体。压力增大的倍数取决于 A 和 B 两活塞的面积比，如果 A 与 B 的面积之比为 50 : 1 ，则压力为 5 × Pa 的气体就可得到压力为 250×Pa 的输出液体。这是一种恒压泵。

③ 层析是什么意思

层析是“色层分复析”的简称。制利用各组分物理性质的不同，将多组分混合物进行分离及测定的方法。有吸附层析、分配层析两种。一般用于有机化合物、金属离子、氨基酸等的分析。
层析（chromatography）利用物质在固定相与流动相之间不同的分配比例，达到分离目的的技术。层析对生物大分子如蛋白质和核酸等复杂的有机物的混合物的分离分析有极高的分辨力。
酸碱性的区别就是，在层析过程中它们吸附的离子或者说带点体的正负不一样

④ 什么是梯度洗脱

梯度性地改变洗脱液的组分(成分、离子强度等)或pH，以期将层析柱上不同的组分洗脱出来的方法。

梯度洗脱（gradient elution）又称为梯度淋洗或程序洗脱。在同一个分析周期中，按一定程度不断改变流动相的浓度配比，称为梯度洗脱。

在气相色谱中，为了改善对宽沸程样品的分离和缩短分析周期，广泛采用程序升温的方法。而在液相色谱中则采用梯度洗脱的方法。在同一个分析周期中，按一定程度不断改变流动相的浓度配比，称为梯度洗脱。从而可以使一个复杂样品中的性质差异较大的组分能按各自适宜的容量因子k达到良好的分离目的。 梯度洗脱的优点：1.缩短分析周期；2.提高分离能力；3.峰型得到改善，很少拖尾；4.增加灵敏度。但有时引起基线漂移。

分级梯度洗脱
分级梯度洗脱是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。

⑤ HPLC的常用术语解释

高效液相色谱法(HPLC)又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。它是在生化和分析化学中常用的柱层析仪。接下来我为大家整理了HPLC的常用术语解释，希望对你有帮助哦!

第一部分色谱曲线

1、色谱图(chromatogram)：色谱柱流出物通过检测器系统时所产生的响应信号对时间或流动相流出体积的曲线图，或者通过适当的 方法 观察到的纸色谱或薄层色谱斑点、谱带的分布图。

2、(色谱)峰(chromatographic peak)：色谱柱流出

3、峰底(peak base)：峰的起点与终点之间的连接的直线

4、峰高(h ，peak height)：色谱峰最大值点到峰底的距离(图1 中的BE)。

5、峰宽(W ，peak width)：在峰两侧拐点(图1 中的F ，G)处所作切线与峰底相交两点的距离

6、半高峰宽(W h/2 ，peak withd at half height)：通过峰高的中点作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点之间的距离(图1 中的HJ)。

7、峰面积(A ，peak area)：峰与峰底之间的面积

8、拖尾峰(tailing peak)：后沿较前沿平缓的不对称的峰。

9、前伸峰(leading peak)：前沿较后沿平缓的不对称的峰。(又叫伸舌峰、前延峰)

10、假峰(ghost peak)：除组分正常产生的色谱峰外，由于仪器条件的变化等原因而在谱图上出现的色谱峰，即并非由试样所产生的峰。这种色谱峰并不代表具体某一组分，容易给定性、定量带来误差。(又叫鬼峰)

11、畸峰(distrorted peak)：形状不对称的色谱峰， 前伸峰、拖尾峰都属于这类。

12、反峰(negative peak)：也称倒峰、负峰，即出峰的方向与通常的方向相反的色谱峰。

13、原点(origin)：纸或薄层板上滴加试样部位的中心点

14、斑点(spot)：平面色谱法中，组分在展开和显谱后呈现近似圆形或椭圆形的色区

15、区带(zone)：在色谱柱、纸或薄层板上被分离组分所占的区域。

16、复斑(multiple spot)：一种组分展开后形成两个或多个清晰斑点。

17、区带拖尾(zone tailing)：由于物理、化学等作用的影响，一种组分在展开后形成的彗星形状斑点。

18、基线(base line)：在正常操作条件下，仅有流动相通过检测器系统时所产生的响应信号曲线。

19、基线漂移(baseline drift)：基线随时间定向的缓慢变化。

20、基线噪声(N，baseline noise)：由于各种原因而引起的基线波动。

21、统计矩(moment)：色谱流出曲线是组分在检测器中浓度或质量依时间的统计分布曲线，响应值对应于分布密度。组分在柱内迁移时间r次幂的数学期望称为流出曲线的r阶原点矩。而组分在柱内迁移时间与平均迁移时间差的r次幂的数学期望称为流出曲线的r阶中点矩。

22、一阶原点矩(first origin moment)：组分在柱内迁移时间的数学期望。当流出曲线为对称峰时，即为组分的保留时间。

23、二阶中心矩( μ2 ，second central moment)：二阶中心矩为流出曲线的方差。定义为：μ2=E(t-Et)2 式中，E代表平均。

24、三阶中心矩(μ3 ，third central moment)：定义为：μ3=E(t-Et)3

可以表示流出曲线的不对称程度。峰形对称时μ3=0，前伸峰μ3<0，拖尾峰μ3>0.

第二部分分离模式

1、液相色谱法(liquid chromatography ，LC)：用液体作流动相的色谱法。

2、液液色谱法(liquid liquid chromatography，LLC )：将固定液涂渍在载体上作为固定相的液相色谱法。

3、液固色谱法(liquid solid chromatography，LSC )：用固体(一般指吸附剂)作为流动相的液相色谱法。

4、正相液相色谱法(normal phase liquid chromatography ，NPLC)：固定相的极性较流动相的极性强的液相色谱法。

5、反相液相色谱法(reversed phase liquid chromatography，RPLC )：固定相的极性较流动相的极性弱的液相色谱法。

6、柱液相色谱法(liquid column chromatography )：在柱管内进行组分分离的液相色谱法。

7、高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC )：具有高分离效能的柱液相色谱法。

8、尺寸排除色谱法(size exclusion chromatography，SEC )：用化学惰性的多孔性物质作为固定相，试样组分按分子体积(严格来讲是流体力学体积)进行分离的液相色谱法。

9、凝胶过滤色谱法：(gel filtration chromatography )：水或水溶液作为流动相的体积排除色谱法。

10、凝胶渗透色谱法：(gel permeation chromatography ，GPC)：有机溶剂作为流动相的体积排除色谱法。

11、亲和色谱法(affinity chromatography )：用连接在基体上的配位体做固定相，使其与蛋白质或其他大分子发生可逆的高选择性的相互作用，利用不同亲和力进行分离的液相色谱法。

12、离子交换色谱法(ion exchange chromatography ，IEC)：以离子交换作用分离离子型化合物的液相色谱法。

13、离子色谱法(ion chromatography )：以含有某种特定离子的水溶液作为流动相，流出液通过抑制柱(或不通过抑制柱)，在降低流动相背景信号的条件下用于分离离子的液相色谱法。

14、离子抑制色谱法(ion suppression chromatography )：通过调节流动相的PH值来抑制试样组分的电离，以分离离子型化合物的液相色谱法。

15、离子对色谱法(ion pair chromatography )：用形成离子对化合物进行分离的液相色谱法。16、疏水作用色谱法(hydrophobic interation chromatography )：用适度疏水性的固定相，以含盐的水溶液作为流动相，借疏水作用分离生物大分子化合物的液相色谱法。

17、制备液相色谱法(preparative liquid chromatography)：用能处理较大量试样的色谱系统，进行分离、切割和收集组分，以提纯化合物的液相色谱法。

18、平面色谱法(planar chronatography)：在平面介质上进行组分分离的色谱法，也叫平板色谱法。

第三部分 常用术语

M：分子量

MC：二氯甲烷(methylene chloride)

MeOH：甲醇(methanol)

MS：质谱

h：峰高

HPLC：高效液相色谱

ID：内径，dC

A：吸收度(式3.1，3.2);也作面积

ACN：乙腈(acetonitrile)

B(%B)：二元流动相中的强溶剂(% v/v)

C8，C18：烷基键合相的键长度(八烷基或十八烷基)

CD：环糊精(cyclodextrin)

CV：变异系数(通常以%表示);式15.3

dC：色谱柱内径(cm)

dP：颗粒直径(μm)

DAD：二极管阵列检测器

EC：电化学(检测器)

F：流速(ml/min)

FL：荧光(检测器)

GS：梯度斜度参数(式8.2a);k*=20/GS

IEC：离子交换色谱(ion-exchange chromatography)

IPC：离子对色谱 (ion-paire chromatography)

k：保留因子(式2.4)

k*：梯度洗脱中，k的有效值或平均值(式8.1)

ka，kZ：色谱图中，首峰(a)和末峰(z)的k值

L：色谱柱长度(cm)

LC-MS：液相色谱-质谱

MTBE：甲基-叔-丁醚(methyl-t-butyl ether)

N：色谱柱塔板数(式2.82.8b)

N：噪音(式3.3，图3.3)

NARP：非水反相HPLC

NPC：正相色谱

P：色谱柱压力降(通常以psi表示)(式2.9)

pKa：酸或供质子碱的酸性常数

PAH：多环芳烃(polyaromatic hydrocarbon)

RS：分离度(式2.1)

RI：折光指数

RPC：反相色谱

S：信号;式3.3;图3.3;以及由式6.1定义的参数

tD：延迟或滞留时间(min，用于梯度洗脱中);等于VD/F

tG：梯度时间(min)

tR：保留时间(min)(图2.2);等于tO(1+k)

tRa，tRz：色谱图中首峰(a)与末峰(z)的保留时间，tR(min)(图8.6a)

tO：色谱柱死时间(min)(式2.5)

t1，t2：相邻谱峰1与谱峰2的保留时间(min)

TEA：三乙胺(triethylamine)

THF：四氢呋喃(tetrahydrofuran)

UV：紫外光谱

VD：延迟或滞留体积(mL);为梯度混合器与色谱柱人口之间的体积(包括混合器的体积)

Vm：色谱柱死体积(mL)(式2.6);Vm为色谱柱内部的流动相体积，不包括附于固定相上的溶剂

Vmax：最大样品体积(mL)(式13.1)

Va：样品体积(mL)

w：重量(mg);也作半峰高处的峰宽(min)

wmax：不超载色谱柱的最大进样量(mg)(式2.17)

wS：色谱柱的饱和容量(mg)(式13.4)

W：峰底宽(min)(图2.2)

Wth：大进样量对峰底宽的贡献(min)(式13.2)

WO：小进样量的峰底宽(min)

W1/2：半峰高处的峰宽(min)(图1.1)

a：分离因子，等于k2/k1，其中k2与k1分别为相邻谱峰2和谱峰1的k值

△tR：tRz-tR(min)

△%B：梯度洗脱期间，%B的变化

ε：摩尔吸收系数

εo：正相HPLC 中溶剂或溶剂混合液的强度

η：粘度(CP)

<<不常有符号>>

A，B，C：式2.11中的常数;数值A，B与C随k值而变化，但改变 其它 条件或溶质时基本不变

A，B，C：式2.10中的常数;数值A，B与C随条件和样品而变化

A，B，C：式2.10a中的常数;数值A，B与C随条件和样品而变化

C：谱峰最大值处的浓度(mol/L)

CO：注入样品中溶质的浓度(mol/L)

GI：化学电离(MS)

DGA：N，N-二甲基-1-萘酰胺;(也作二甲基苯胺dimethylaniline)

EI：电子电离(MS)

ELS：蒸发光散 射击 (Evaporative light scattering)

EtOAc：乙酸乙酯(ethyl acetate)

FAB：快速原子轰击(MS)

FD：场解吸附(MS)

h：折合板高，等于H/dP(式2.11)

HB：羟基苯甲酸(hydrxybenzoic acid)(图7.8，7.17与7.19)

HFBA：七氟丁酸(hyptafluorobutyric acid)

IPA：异丙醇(isopropanol)

kW：以水作为流动相的k值(式6.1)

LCEC：液相色谱电化学检测器

LD：激光解吸(MS)

LSIMS：液态二级离子质谱

MALDI：基质辅助激光解吸电离

MP：对羟苯甲酸甲酯

[P-]m：流动相中离子对试剂P-的浓度(mmol/L)

PAD：脉冲电流分析检测器

PBP：极性键合相

PD：等离子解吸(MS)

PP：对羟苯甲酸丙酯

PTH：乙内酰苯硫脲

R+，R-：分别为阴离子与阳离子离子交换色谱柱中的荷电功能基困(式7.4和7.5[如-N(CH3)3+和-SO3-]

RF：响应因子

TBA+：四丁基铵离子

tBME：见MTBE

TMS：三甲基硅烷(trimethylsilyl;也为C1)

TNB：1，3，5-三硝基苯(1，3，5-trinitrobenzene)

TOF MS：时间飞行质谱

TSP：热喷雾(MS)

u：流动相通过色谱柱的速度(cm/s);等于L/to

V：峰底宽(mL)

Vc：色谱柱内峰展宽对V的贡献;也作小样品量峰底宽(mL)(式2.16)

VR：保留体积(mL)

W：峰宽(min)(式2.12)

Wc，WS，：分别为色谱柱，进样器，连续管和流通池对W的贡献(min)

Wlc，Wfc：(式2.12)

X，X1，：无特征结构的溶质(图7.8，7.17和7.19)

X2，X3

XB：流动相中的B溶剂的摩尔分数

V：折合速度，等于udp/Dm(式2.11)

б：高斯曲线的标准偏差;等于峰底的1/4

ι：检测器响应时间常数(S)

φ：流动相中B溶剂的体积分数;等于0.0

⑥ 层析的常用层析

◆吸附层析
吸附剂的吸附力强弱，是由能否有效地接受或供给电子，或提供和接受活泼氢来决定。被吸附物的化学结构如与吸附剂有相似的电子特性，吸附就更牢固。常用吸附剂的吸附力的强弱顺序为：活性炭、氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙、磷酸钙、石膏、纤维素、淀粉和糖等。以活性炭的吸附力最强。吸附剂在使用前须先用加热脱水等方法活化。大多数吸附剂遇水即钝化，因此吸附层析大多用于能溶于有机溶剂的有机化合物的分离，较少用于无机化合物。洗脱溶剂的解析能力的强弱顺序是：醋酸、水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、醚、氯仿、苯、四氯化碳和己烷等。为了能得到较好的分离效果，常用两种或数种不同强度的溶剂按一定比例混合，得到合适洗脱能力的溶剂系统，以获得最佳分离效果。
◆分配层析
在支持物上形成部分互溶的两相系统。一般是水相和有机溶剂相。常用支持物是硅胶、纤维素和淀粉等，这些亲水物质能储留相当量的水。被分离物质在两相中都能溶解，但分配比率不同，展层时就会形成以不同速度向前移动的区带。
◆离子交换层析
支持物是人工交联的带有能解离基团的有机高分子，如离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换凝胶等。带阳离子基团的，如磺酸基（—SO3H）、羧甲基（—CH2COOH）和磷酸基等为阳离子交换剂。带阴离子基团的，如DEAE—（二乙基胺乙基）和QAE—（四级胺乙基）等为阴离子交换剂。离子交换层析只适用于能在水中解离的化合物，包括有机物和无机物。对于蛋白质、核酸、氨基酸及核苷酸的分离分析有极好的分辨力。离子交换基团在水溶液中解离后，能吸引水中被分离物的离子，各种物质在离子交换剂上的离子浓度与周围溶液的离子浓度保持平衡状态，各种离子有不同的交换常数，K值愈高，被吸附愈牢。洗脱时，增加溶液的离子强度，如改变pH，增加盐浓度，离子被取代而解吸下来。洗脱过程中，按K值不同，分成不同的区带。
◆凝胶过滤层析
支持物是人工合成的交联高聚物，在水中膨胀后成为凝胶。凝胶内为内水层，凝胶周围的水为外水层。控制交联度以形成不同孔径的网状结构。交联度小的孔径大，交联度大的孔径小。凝胶只允许被分离物质中小于孔径的分子进入，大于孔径的分子被排斥在外水层，最先被洗脱下来。而进入孔径的分子也按分子量大小大致分离成不同的区带。选择不同规格的凝胶，可把一个混合物按分子量的差异分成不同的组分。这种方法曾被称为分子筛。目前常用的凝胶商品有：葡聚糖凝胶（sephadex）、聚丙烯酰胺凝胶（bio-gel）、琼脂糖凝胶（sepharose）和聚苯乙烯凝胶（styragel）等。
◆亲和层析
在一对有专一的相互作用的物质中，把其中之一联结在支持物上，用于纯化相对的另一物质。常见的亲和对如：酶和抑制剂，抗原和抗体，激素和受体等。支持物为琼脂糖或纤维素等。
◆气相层析
属于分配层析或吸附层析，仅适用于分析分离挥发性和低挥发性物质。固定相是在惰性支持物（如磨细的耐火砖）上覆盖一层高沸点液体，如硅油、高沸点石蜡和油脂、环氧类聚合物。外涂层约为支持物重量的20%。分析时操作温度范围，一般从室温到200℃。特殊的层析柱能达到500℃。流动相常用氦、氩或氮为展层气体。气相层析分离的区带十分清晰，是由于挥发性物质在两相间能很快达到平衡，所需分析时间大为缩短，一般为数分钟至10余分钟。检测记录系统绘出的各峰是测定流出气体电阻变化的结果，因而测定样品量可到微克和毫微克水平。具有快速、灵敏和微量的优点。气相层析也能用于分离制备样品，但需增加将流出气体通过冷冻将分离物回收的装置。
◆纸层析
以滤纸为支持物的分配层析。组成滤纸的纤维素是亲水物质，能形成水相和展层溶剂的两相系统，被分离物质在两相中的分配保持平衡关系。纸层析用于分析简单的混合物时可做单向层析。对于复杂的混合物，可做双向层析。1944年A．J．P．马丁第一次用纸层析分析氨基酸，得到很好的分离效果，开创了近代层析的发展和应用的新局面。70年代以后，纸层析已逐渐为其他分辨力更高、速度更快和更微量化的新方法，如离子交换层析、薄层层析、高效液相层析等所代替。
◆薄层层析
在玻璃片、金属箔或塑料片上铺上一层约1～2毫米的支持物，如纤维素、硅胶、离子交换剂、氧化铝或聚酰胺等，根据需要做不同类型的层析。聚酰胺薄膜是一种特异的薄层，将尼龙溶解于浓甲酸中，涂在涤纶片基上，当甲酸挥发后，在涤纶片基上形成一层多孔的薄膜，其分辨力超过了用尼龙粉铺成的薄层。薄层层析较纸层析优越在于分辨高，展层时间短。例如用纸层析做氨基酸分析，往往需要两天时间，而且对层析条件要求严格，不易得到满意的分离效果。如用薄层层析做，一般约需半小时，分离效果更好。薄层层析一般用于定性分析。也能用于定量分析和制备样品。
◆高效液相层析（又名高压液相色谱）
70年代新发展的层析法。其特点是：用高压输液泵，压强最高可达5000psi（相当于34个标准大气压）。用直径约3～10微米的超细支持物装填均匀的不锈钢柱。常用的支持物是在玻璃小珠上涂一层1～2微米的二氧化硅，经硫酰氯反应生成Si—Cl，进一步连接疏水的烷基，如Si—C18H37，或阳离子交换基团—Si（CH2）n—C6H4SO3H，或阴离子交换基团—Si（CH2）nNH2。这种支持物能承受很高的压力，化学性能稳定。用不同类型支持物的HPLC，可做吸附层析、离子交换层析和凝胶过滤层析。其分析微量化可达10-10克水平。但用于制备，可以纯化上克的样品。展层时间短，一般需几分钟到10余分钟。其分析速度、精确度可与气相层析媲美。HPLC适于分析分离不挥发和极性物质。而气相层析只适用于挥发性物质，两者互为补充，都是目前最为理想的层析法。HPLC配有程序控制洗脱溶剂的梯度混合仪，数据处理的积分仪和记录仪等电子系统，成为一种先进的分析仪器，在生物化学、化学、医药学和环境科学的研究中发挥了重要作用。
◆反相层析
在吸附层析中，高极性物质在层析柱上吸附较牢，洗脱时发生拖尾现象和保留时间长的问题。如果在支持物上涂上一层高碳原子的疏水性强的烷烃类，洗脱液用极性强的溶剂，如甲醇和水的混合物。则被分离样品中的极性强的物质不被吸附，最先洗下来，得到较好的分离效果。这种层析法与普通的吸附层析法相反，故称为反相层析。目前用HPLC做反相层析常用的ODS柱，即在支持物的表面上连接了C18H37Si—基团。
◆同系层析
在核酸分析中，将样品经核酸酶部分裂解成不同长度的核苷酸片段，用同位素标记后，在DEAE纤维素薄层上分离，用含有未标记的相同的核苷酸片段作展层溶剂，这样，未标记的核苷酸把标记过的核苷酸推进，使按分子量大小不同把标记核苷酸片段，按由小到大的次序排列，达到分离的目的。于是把这种层析法称为同系层析。同系层析和电泳相结合曾用于寡核苷酸的顺序分析。
纸层析是层析法的一种,要了解纸层法还得从层析法开始.层析法又称色层分析法或色谱法（Chromatography），是一种基于被分离物质的物理、化学及生物学特性的不同，使它们在某种基质中移动速度不同而进行分离和分析的方法。例如：我们利用物质在溶解度、吸附能力、立体化学特性及分子的大小、带电情况及离子交换、亲和力的大小及特异的生物学反应等方面的差异，使其在流动相与固定相之间的分配系数（或称分配常数）不同，达到彼此分离的目的。
层析法的最大特点是分离效率高，它能分离各种性质极相类似的物质。而且它既可以用于少量物质的分析鉴定，又可用于大量物质的分离纯化制备。因此，作为一种重要的分析分离手段与方法，它广泛地应用于科学研究与工业生产上。现在，它在石油、化工、医药卫生、生物科学、环境科学、农业科学等领域都发挥着十分重要的作用。
层析根据固定相基质的形式分类，层析可以分为纸层析、薄层层析和柱层析。其中纸层析是指以滤纸作为基质的层析。

⑦ 层析法的主要操作

HPLC培训教程
我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表：
方法 项目 数量
1985年版 1990年版 1995年版 2000年版
HPLC法 鉴别 9 34 150
检查 12 40 160
含量测定 7 60 117 387
鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多，因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。

I．概论
一、液相色谱理论发展简况
色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。
二、HPLC的特点和优点
HPLC有以下特点：
高压—压力可达150~300Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。
高速—流速为0.1~10.0 ml/min。
高效—可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。
高灵敏度—紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。
HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：
速度快—通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。
分辨率高—可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。
灵敏度高—紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。
柱子可反复使用—用一根色谱柱可分离不同的化合物。
样品量少，容易回收—样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。
三、色谱法分类
按两相的物理状态可分为：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)。气相色谱法适用于分离挥发性化合物。GC根据固定相不同又可分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC)，其中以GLC应用最广。液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。LC同样可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)。此外还有超临界流体色谱法(SFC)，它以超临界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为流动相（常用CO2），因其扩散系数大，能很快达到平衡，故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。
按原理分为吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、排阻色谱法(EC，又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色谱法(GPC）和亲和色谱法。(此外还有电泳。)
按操作形式可分为纸色谱法(PC)、薄层色谱法(TLC)、柱色谱法。
四、色谱分离原理
高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。
1．液固色谱法 使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5~10μm。适用于分离分子量200~1000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。
2．液液色谱法 使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。
涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。
正相色谱法 采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。
反相色谱法 一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。
随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH 1.5~10范围操作。
正相色谱法与反相色谱法比较表
正相色谱法 反相色谱法
固定相极性 高～中 中～低
流动相极性 低～中 中～高
组分洗脱次序 极性小先洗出 极性大先洗出

从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）。
3．离子交换色谱法 固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。
缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的pH值和离子强度影响。pH值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。
离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。
4．离子对色谱法 又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。
分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。
分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。
离子对色谱法常用ODS柱（即C18），流动相为甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10 mmol/L的离子对试剂，在一定的pH值范围内进行分离。被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其pH值、离子强度有关。
5．排阻色谱法 固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。

被分离组分在柱中的洗脱原理