离子交换色谱柱scx填料

1. 液相色谱C18色谱柱特点及相关参数

GP-C18 Bio-C18 Amethyst(紫晶) 色谱柱-美国赛分-sepax-北京康农兴牧
常规用途分析型液相色谱柱 >> 反相液相色谱柱（RPLC）介绍：

GP-C18色谱柱(GP-C8,GP-C4详见产品手册) •方法开发的首选柱，
•高度可控的单分子层形成和封尾技术
•高的柱间重现性
•高的选择性和分离效率
•适合分离酸性、中性和碱性化合物，以及许多药物、多肽等
•推荐使用有机溶剂或有机溶剂/水体系的流动相

可替代Symmetry C18、LunaTMC18、Symmetry Shield RP18、LunaTMDiscoveryTMC18、Zorbax Eclipse XDB C18、Inertsil ODS-2 ODS-3、SupelcosilTMLC-18-DB、Kromasil C18、lTSKgel ODS-100Z
GP-C18以全覆盖的键合硅胶为填料，具有优异的稳定性。独特的单官能团化学键合技术可避免形成复合的C18分子层。均匀的涂层确保了固定相具有高选择性和高效率的分离特点。
GP-C18填料技术参数
硅胶：球形,高纯度(<10ppm金属杂质)
孔径：120Å
粒径：1.8、2.2、3、4、5、7和10µm
孔体积：1.0mL/g
比表面积：300m²/g
固定相结构：单层全封尾
碳载量：17%
PH值范围：2-11
HP-C18色谱 柱
•可使用100%的水相做流动相
•高度可控的单分子层形成和封尾技术
•高的柱间重现性
•高的选择性和分离效率
•适合分离酸性、中性和碱性化合物，以及许多药物、多肽等
可替代AquasilC18、ArlantisTM、Zorbax SB-Aq SynergiHydro-RP、HydroBondPS C18、HydroBond AQ、UltraAqueous C18、ProntoSIL C18 AQ、YMC-Pack ODS-AQ、EliteSino ChromODSBP TSKgelODS100V HP-C18填料技术参数
硅胶：球形,高纯度(<10ppm金属杂质)
孔径：120Å / 200Å（用于大分子）
粒径：3、4、5、7、10µm / 3、5、10µm
孔体积：1.0mL/g
比表面积：300m²/g /200m²/g
固定相结构：单层全封尾
碳载量：17% / 10%
PH值范围：2.0-9.0
BR-C18色谱柱
•高度可控的单分子层形成和封尾技术
•高的柱间重现性
•高的选择性和分离效率
•宽的pH适用范围1.5-10.5
•适合分离酸性、中性和碱性化合物，以及许多多肽和蛋白等

可替代Zorbax Extend C18 Vydac218TP C18; ;Jupite300 C18 BR-C18填料技术参数
硅胶：球形，高纯度(<10ppm金属杂质)
孔径：120Å
粒径：3、5和10µm
孔体积：1.0mL/g
比表面积：350m²/g
固定相结构：单层全封尾
碳载量：19.5%
PH值范围：1.5-10.5
Bio-C18色谱柱
Bio-C18填料有200和300Å两种孔径规格，适合于肽段的指纹图谱识别，天然和人工合成多肽以及低分子量蛋白等的分离。所采用的化学键合技术可以确保ODS单分子层不会在纯水溶液中发生塌陷。
•高度可控的单分子层形成和封尾技术
•高的柱间重现性
•高的选择性和分离效率
•可使用纯水作为流动相
•适合分离多肽、蛋白以及许多药物等
可替代XterraC18;XbridgeC18 Bio-C18填料技术参数
硅胶：球形,高纯度(<10ppm金属杂质)
孔径：200Å / 300Å
粒径：3、4、5和10µm / 3和5µm
孔体积：1.0mL/g / 0.95mL/g
比表面积：200m²/g / 105m²/g
固定相结构：单层全封尾
碳载量：10% / 7%
PH值范围：2.0-9.0
Amethyst(紫晶) P分析型液相色谱柱
通用型C18，推荐中药分离选择此柱。
• 采用高度可控的单官能团键合和封尾技术
• 高的柱间重现性
• 高的选择性和分离效率
• 可在pH 1.5-9.0范围内使用
• 适合分离许多药物分子以及多肽等
• 可用100%水作为流动相

Amethyst C18-P填料技术参数
硅胶：球形,高纯度(金属杂质<10ppm)
孔径：120Å
粒径：3、5和10µm
孔体积：1.0mL/g
比表面积：300m²/g
固定相结构：单官能团全封尾
碳载量：20.0%
pH值范围： 1.5-9.0
Amethyst(紫晶) H分析型液相色谱柱
Amethyst C18-H 一般用途C18 ，推荐西药如抗生素药的分离选择此柱。
• 采用高度可控的单分子层形成和封尾技术
• 高的柱间重现性
• 高的选择性和分离效率
• 最高可耐受pH值至11
• 可在pH 1.5-10..5范围内使用
• 适合分离酸性、中性和碱性化合物，以及多肽和蛋白等 Amethyst C18-H填料技术参数
硅胶：球形,高纯度(金属杂质<10ppm)
孔径：120Å
粒径：3、5和10µm
孔体积：1.0mL/g
比表面积：350m²/g
固定相结构：三官能团单分子层全封尾
碳载量：19.0%
pH值范围： 1.5-10.5
Sapphire(宝石)分析型液相色谱柱
Sapphire C18 复杂样品的分离
• 采用高度可控的单分子层形成和封尾技术
• 高的柱间重现性
• 对疏水和亲水化合物都具有高选择性和分离效率
• 与其它C18填料相比具有更大的比表面积，更长的样品保留时间，以及更高的上样量
• 特为碱性化合物如胺类等的分离而设计
• 可用纯水作为流动相
• 适合分离酸性、中性和碱性化合物，以及许多药物分子和多肽等 Sapphire C18填料技术参数
硅胶： 球形,高纯度(金属杂质<10ppm)
孔径：100Å
粒径：3、5和10µm
孔体积：1.05mL/g
比表面积：450m²/g
固定相结构：单官能团全封尾
碳载量：17.0%
pH值范围： 1.5-9.0
体积排阻柱 SRT-SEC SRT-SEC 可完全替代TSK 凝胶柱。
SRT SEC固定相是以高纯度具有良好机械稳定性的硅胶为基质，表面化学键合有一层均一、亲水、纳米厚度的中性聚合物薄膜。该固定相的合成采用赛分公司独有的表面化学键合技术，可确保柱与柱之间的高度重现性。SRT SEC固定相具有高的化学和机械稳定性，与生物分子等之间的非特异性相互作用也很小。孔径规格有100、150、300、500、1000和2000Å，可确保高分离容量分辨率
Nanofilm-SEC Nanofilm-SEC 针对柱容性蛋白，解决TSK 寿命问题的色谱柱，使用寿命更长。
Nanofilm SEC固定相是以高纯度具有良好机械稳定性的硅胶为基质，表面化学键合有一层均一、亲水、纳米厚度的中性聚合物薄膜。该固定相的一个特点是可使用低盐浓度，或含有机溶剂的缓冲液作为流动相进行生物样品的分离，并具有高的分辨率和样品回收率。该色谱填料为窄粒径分布的球形硅胶颗粒。孔径规格有150、250、450和950Å。
离子交换柱 硅胶基质 HP-SCX 推荐用于盐酸二甲双胍的分析新康泰克药物的分析
HP-SAX 推荐用于核苷类物质的分析草柑膦的分析
聚合物基质 Proteomix离子交换色谱柱
推荐用于蛋白质、低聚核苷酸和多肽的分离而设计，具有高分辨率、高效率和高回收率的特点。
Sepax 首创1μm颗粒制造技术。专利技术的表面修饰，不但消除固定相与提高了生物分子之间的非特异性互相作用同时有效的无孔填料的吸附容量，从而使色谱柱在应用中具有极高的柱效和回收率

2. 聚合物填料色谱柱适合分离什么样品

液相色谱柱的分类：(按色谱固定相基质分)

一.硅胶基质：

1.反相色谱柱：

反相色谱填料常是以硅胶为基础，表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相。

反相色谱所使用的流动相极性较强，通常为水，缓冲液与甲醇，已腈等混合物。

样品流出色谱柱的顺序是极性较强组合最先被冲出，而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留。

常用的反相填料有C18(ODS)、C8(MOS)、C4(B)、C6H5(Phenyl)等。

2.正相色谱：

正相色谱用的固定相通常为硅胶(Silica)，以及其他具有极性官能团，如胺基团(NH2,APS)和氰基团(CN，CPS)的键合相填料。

由于硅胶表面的硅羟基(SiOH)或其他团的极性较强，因此，分离的次序是依据样品中的各组份的极性大小，即极性强弱的组份最先被冲洗出色谱柱。

正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如：正乙烷(Hexane),氯仿(Chloroform),二氯甲烷(Methylene Chloride)等。

3.离子交换色谱柱：以磺化交联强阴/阳离子键合硅胶色谱柱，常用规格：强阴离子色谱柱(SAX)，强阳离子交换色谱柱(SCX)

二 .聚合物基质：

聚合物调料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等，其主要优点是在PH值为1～14均可使用。相对与硅胶基质的C18填料，这类填料具有更强的疏水性；大孔的聚合物填料对蛋白质等样品的分离非常有效。现在的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效较低。

三.其他无机填料：

其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化。由于其特殊的性质，一般仅限于特殊的用途。如石墨化碳也用于正逐渐成为反相色谱填料。这种填料的分离不同与硅胶基质烷基键合相，石墨化碳的表面即是保留的基础，不再需其它的表面改性，该柱填料一般比烷基键合硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强，石墨化碳可用于分离某些几何导构体，又由于HPLC流动相中不会被溶解，这类柱可在任何PH与温度下使用。氧化铝也可用于HPLC，

氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可在PH高达12的流动相中使用。

但由于氧化铝与碱性化合物作用也很强，应用范围受到一定的限制，所以未能广泛应用，新型氧化锆填料也可用于HPLC，商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱，应用PH范围1～14，温度可达100℃。由于氧化锆填料几年才开始研究，加之面临的实验难度，其重要用途与优势尚在进行中。

3. 液相色谱柱的填料有哪些

液相色谱柱的填料基质：1、硅胶基质- pH 2-8：高或低pH下，硅胶会溶解。2、Al2O3·nH2O - pH1-14：化学修饰困专难。3、聚合物基质 - pH1-14：孔属结构复杂，孔径不均匀导致柱效不够高，有机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损。

北京路达恒宇科技有限公司PLRP-S液相色谱柱刚性聚合物固定相机械强度高，适合酸性/中性/碱性所有化合物，方便再生,恢复原有柱效和压力，保留稳定,重复性好,寿命长。

4. scx是什么色谱柱

SCX（强阳离子交换）是一类以单分散无孔聚合物微球为基质的高效离子交换色谱柱，它是为快速和高效的分离分析蛋白质和多肽而设计的。

5. 色谱硅胶的孔径及用途

Kromasil柱

Kromasil是瑞典AKZO NOBEL公司生产的高性能硅胶基质液相色谱柱填料品牌。
Kromasil是一种高纯度球形硅胶填料，金属杂质含量极低，减少了有些金属螯合物在硅胶基质上的络合作用。
Kromasil硅胶的表面由独特的硅羟基基团组成，硅烷的覆盖率高，在较高的或较低的PH条件下不易水解和分解，可在PH=1.5～9.5条件下稳定使用。
Kromasil 的含碳量高，表面极性小，分离效能高。通常在分析碱性样品时，与酸性硅羟基反应会产生不利的拖尾现象，而Kromasil化学纯度极高，它的表面由分布独特、相对中生的硅羟基基团组成，并使不需要的酸性硅羟基基团减少到最低，从而使之具有良好的峰对称性种较高的柱效。

Hypersil BDS

Hypersil BDS 类色谱填料是极好的反相柱填料，有很好的耐久性及重现性，应用范

围极其广泛。Hypersil BDS 硅胶担体键合前经过专门的碱钝化处理，将残余硅羟基降至极

限，这种改善的表面，使得键合后的硅胶具有很高的配位度，大大降低了硅羟基与分析物之

间的相互作用，改善了色谱峰形，降低了色谱峰的拖尾程度，提高了峰的对称性。

Hypersil BDS填料的特征：

l 对碱性化合物有更好的峰型。

l 更长的寿命。

l 更好的稳定性。

l 同碱性化合物一样，酸性和中性化合物也有非常优异的峰值--真正的通用柱填料。

紧管常规填料色谱柱具有优异的选择性和较长的色谱柱寿命。且对于简单的两元流动相(如

甲醇/水)，当样品为酸性、中性和弱碱性化合物时均可获得较佳的峰不对称度。但当分析药

物等样品中的强极性含氮的化合物时，样品峰型就极查，拖尾严重，并导致定量分析精度下

降，时常会出现一些小峰埋没于前一拖尾峰的尾巴中，造成该现象的原因是固定相上尚有残

余的硅羟基。尽管很多厂家对硅胶表面作了第二次反应，即所谓的“封尾”，以减小残余硅

羟基的作用，但往往都不能完全消除残余的硅羟基的影响。Hypersil公司开发的将残余的硅

羟基降至极限的Hypersil BDS(Base Deactived Silica,碱纯化硅胶)系列产品，并用现代衍生反应技术生产出特别适用于碱性化合物的真正均一反相填料。

Hypersil 300A 填料是基于5um和10um,
孔径为300A 的硅胶为基质的HPLC填料适合越来越多的生物大分子分离与分析的需要,现可提供C18 C8 C4 的填料

*Hypersil 300A C18 适合亲水性强的分子量大于5000的小肽酶的水解片断及各种天然和合成小肽的分析
*Hypersil 300A C4 适合疏水性的小肽及大分子的多肽分析
*Hypersil 300A C8 选择性介于C18和C4之间适用于亲水性及弱疏水性的小肽和蛋白质酶的水解片断及各种天然和合成小肽的分析。

Hypersil ODS填料

Hypersil 填料是基于粒度为3um 、5um和10um, 孔径为120A的硅胶为基质的HPLC填料其生产过程的质量控制标准非常严格全世界数千个实验室使用Hypersil色谱柱已长达20多年很多应用实例可以从多种文献及著名杂志上查到。大量的试验测试已经证实Hypersil ODS2填料是替代Waters Spherisorb ODS2的最佳填料无论是在酸性还是碱性样品的分析上选择性与峰型几乎与其保持一致。

LiChrosorb填料常规色谱分析柱

产品介绍： LiChrosorb是德国MERCH公司出品的一种多孔无定型硅胶基质填料品牌，在过去的25年中非常成功地应用于液相色谱分离。
产品特点：LiChrosorb RP-8和RP-18适合于碱性样品的色谱分析。

技术参数：

LiChrosorb填料参数

Spherisorb 填料
Waters公司出品的Spherisorb填料有3um、5um和10um, 孔径为80A 硅胶为基质的HPLC填料其高的分离性能已得到广大色谱用户的认可

Spherisorb填料有C18 C8 CN C6H5和NH2等固定相C18有经封尾处理的ODS-2和未经封尾处理的ODS-1 两种ODS-2 的碳含量为11.5%ODS-1的碳含量为5.75%

Spherisorb SAX强阴离子交换柱和SpherisorbSCX强阳离子交换柱分别适合于对小分子的酸性和碱性化合物的分析比
通常的正相和反相色谱柱有更佳的分离性能

BETASIL 填料
ThermoHypersil-Keystone公司非常有特点的新型通用填料装填的色谱柱-BETASIL 为了达到原装柱的水平公司采用全新结构柱管装填以满足您更高分析要求的需要

*高纯硅胶彻底减去活处理提供完美的峰型
*高比表面积高覆盖键合相
*真正的高效柱理论塔板数较高
*较强的保留,反相色谱应用中适宜强极性化合物的分离

6. 2. 蛋白质组学样品前处理（3）

说明：此篇笔记系2016-2017年由克里克学院与康昱盛主办的蛋白质组学网络大课堂整理而成，侵删。该课程由复旦大学生物医学研究院（IBS）的刘晓慧博士所授。

我们通过上一篇笔记里介绍的各种方法把蛋白质提取出来以后，这事儿还没完，因为我们需要对提取出来的蛋白进行一下质控，以确认是否成功提取出了足够的蛋白，是否有污染等。

如上图，质量控制分两个部分：

含量测定 ：检测是否有充足的蛋白被提取出。注意上图里提到的不兼容问题，如果你样品里加过SDS，就不要用Bradford法来测定蛋白浓度，而可以选用BCA方法；反之，如果你样品里加入了还原剂，就不要用BCA方法来测定蛋白，可以选用Bradford法。

SDS-PAGE ：检测蛋白的提取效率，以及是否有污染。比如我们上了50个样，能看到的条带却很少，说明定量不准确。如果想从几组样品中寻找差异蛋白，特别需要做一次SDS-PAGE检测同类样品蛋白的提取效率。

以上图为例，0号样品中间的条带不见了，可能是提取蛋白不充分引起的差异，也可能是样品本身的差异。我们可以重新提取一次，先排除是否是提取造成的差异；如果是样品本身的差异，建议用label free的方法，每个样品单独做定量，而不要用iTRAQ或TMT标记定量，否则会因为中间这个高丰度蛋白的影响，而导致定量不准。

我们再看来几种常见的问题，以及解决方法，如下图：

情况1：提取出来的结果差异很大。这种情况需要重新提取，以检测到底是提取不充分造成的差异，还是样品本身的差异；

情况2：左边是分子量marker,右边是实际样品，可以看到实际样品的条带很少，可能是提取不充分，需要重设提取参数，使用更剧烈的条件，更长的时间，重新提取；

情况3：横纹、纵纹比较多，很可能是核酸或脂蛋白的影响，这种情况需要进行脱盐处理，也就是利用脱盐柱与肽段结合，而与其它物质不结合，从而达到去除污染的目的。

情况4：两个条带很类似，但一条明显比另一条淡。可能造成这种情况的原因有哪些呢？第一种情况，由于这是同样类型的样品，比如都是小鼠肌肉组织，一个样品的蛋白质抽提充分，而另外一个样品蛋白抽提不充分，就会导致两条带不一样，这种情况下需要重新抽提。还有一种可能，考虑到是等量上样跑的SDS-PAGE，如果两个条带显示出的蛋白含量差别很大，则可能因为参考的含量测定结果不准确引起的，这时候需要重新定量。

蛋白提取后，还需要做脱盐处理，我们来看看可以用哪些方法实现。

超滤： 可以截留10kDa及以上的蛋白分子，适用于体积较小的样品。操作步骤可以是，从100μL超滤浓缩到40μL，再加缓冲液至100μL，再超滤到40μL，反复几次。事实上，超滤是很难把污染（比如SDS）完全去掉的，最终仍然会有极少量的污染物存在，但当这些污染物的浓度降到一定程度时，则样品的纯净度我们认为是可以接受的了。

透析 ：也是可以截留10kDa及以上的蛋白分子，适用于体积比较大的样品，比如尿液，可以将盐透析至外面的透析液里。

丙醇沉淀 ：-20℃丙酮（V _样品 ：V _冷丙酮 =1：3以上）沉淀2个小时以上。

C18色谱柱脱盐法 ：Waters公司生产的XBridge C18色谱柱，利用柱子上的填料与蛋白结合，而盐类物质则流穿过去，从而达到分离的目的。

脱盐完成以后，接下来我们就要进行相当重要的一步：还原烷基化及酶解。整个流程，大伙儿看下面这张图：

这里面有两件事要先跟大伙儿聊聊。

首先，我们来说说为什么步骤里要把丙酮沉淀放在烷基化以后。通过之前的学习，我们知道丙酮可以溶解样品的去污剂、还原剂等，而蛋白是不会在丙酮中溶解的，而是会沉淀下来，这样就达到了去除杂质的目的。

烷基化以后，球状蛋白变成链状，再通过丙酮沉淀去掉尿素或SDS等污染物，然后复溶（即重新溶解，以备下一步酶解操作），那么链状的蛋白比球状蛋白的复溶效果会更好，可以避免因为复溶不充分而造成的损失。因此，丙酮沉淀要放在烷基化之后再做。

另外，关于酶切这一步，有些抗体如果只用胰酶进行酶切，由于酶切位点太少，导致切出来的肽段太长，不便于质谱检测。这种情况下可以结合其它酶，比如Lys-C，进行多酶酶切，使肽段变得短一些。经过测试我们发现，用Lys-C+胰酶酶切，比只用胰酶酶切，可以提高10%-20%的鉴定率。

酶解需要在buffer体系下完成，比如25mM碳酸氢铵体系（易挥发，pH 7-8）最为常用，或者也可以使用TEAB（ triethyl ammonium bicarbonate，三乙基二乙胺盐，10-100mM）。

酶的用量可以参考以下的公式：

W（酶）：W（底物）=1:20 – 1:50

此外，需要注意的是胰酶酶解的兼容性问题。胰酶只能耐受最多1M的尿素，且不能与SDS同时使用。

前面提过，质谱仪是一种离子饱和性仪器，高丰度蛋白的存在会对低丰度蛋白的信号产生抑制，并且质谱仪反应也需要一定的时间。例如，人的细胞内通常会表达20300种蛋白，它们酶解后，每种蛋白会产生10-20种肽段，那么就有几十万种肽段，质谱很难同时检测到这么多种肽段。所以对肽段混合物进行分级，可以降低检测的难度，得到更多的肽段/蛋白鉴定结果。

我们既可以从蛋白水平进行分离，也可以从肽段水平进行分离，还可以将多种分离手段结合起来。从蛋白水平的分离，大家都比较熟悉吧？通常我们用SDS-PAGE或IEF等技术，利用蛋白质的分子量、形状、等电点等理化性质的不同，将混合在一起的蛋白质分开。

第二种分离方案是在肽段水平上进行，根据肽段的不同性质，使用不同填料进行分离。

SCX（Strong Cation Exchange）：是以硅胶为基质的强阳离子交换柱，可以与阳离子结合，并通过buffer进行离子交换，将阳离子分离和洗脱出来，达到与其它不带阳离子的肽段分离的目的。

SAX（Strong Anion Exchange）：硅胶键合季铵基团的强阴离子交换柱，可以与阴离子结合，并通过buffer进行离子交换，将阴离子分离和洗脱出来，达到与其它不带阴离子的肽段分离的目的。

RPLC（Reverse Phase Liquid Chromatography）：反相液相色谱柱，与正相柱在表面键合极性官能团不同，反相柱的表面键合的是非极性的官能团，例如，键合十八烷基官能团，称为C18柱，其它常用的还有C8，C4和C2等。这里我们选用C18柱，根据肽段疏水性的不同，达到分离的目的。

HILIC（Hydrophilic interaction liquid chromatography ）：亲水色谱柱可以用来分离极性化合物。由于强极性肽段在反相色谱柱中保留情况都比较差，很难将它们分开，而亲水色谱柱却可以用来固定强极性的肽段，并结合高比例有机相与低比例水相组成的流动相，来实现分离的目的，且这样的流动相组成尤其有利于提高电喷雾离子化质谱（ESI-MS）的灵敏度。

High pH - Low pH RPLC：用pH10的液相条件，结合pH2的RPLC酸性条件，进行分离。

多维分离：例如，先从蛋白水平进行分离，再从肽段水平进行分离，或者多种肽段水平的分级分离结合起来使用。接下来我们重点聊一下各种多维分离的策略和效果。

我们先来看看上面这张图。左上角的“A图“展示的是通过High pH - Low pH RPLC将样品分成了40个馏分，然后进行叉开的合并，合并为20个馏分，这样的合并可以让样品中的肽段分布更加均匀。

右上角的”B图”展示的是通过SDS-PAGE进行分离，也分成20个馏分，然后用两种合并方案，分别合并为5个馏分和6个馏分，这样做的目的也是为了让样品的肽段分布更加均匀。

左下角的“C图”针对同一种样品，对High/Low pH RPLC和SDS-PAGE两种分离策略进行了比较，发现经过两种分离方法后，有5408个蛋白是都可以鉴定到的，另外有1951种蛋白是只在High/Low pH RPLC分离策略中鉴定到的，而用SDS-PAGE分离，则可以鉴定到其它389种蛋白。从这个图上看，两种方法有互补性。

右下角的四幅小图说明，当我们在做分级分离时，分的级别越多，能鉴定到的蛋白也就越多。不过这种增长并不是呈线性关系的，分级的级数达到一定程度时，能鉴定到的蛋白数量的增长就会饱和。所以比较省时省力又能保证效果的做法时，选择一个合适的分级数即可。

我们来看一下目前发表的文献里，利用多级分离所能鉴定到的蛋白数量。

就像前面说到的，对蛋白及多肽分离的级数越多，能鉴定到的蛋白也就越多，但常常因为机时的限制，再加上这种变化趋势到一定程度总会饱和，所以我们通常有个权衡。比如常规的分10个馏分，基本上可以鉴定到5000-8000个蛋白。如果是血清样品，可以馏分更多一些，尤其是RPLC一维，如果分到40或60个馏分，再合并为10或20个馏分，比直接分成10个或20个馏分能鉴定到的蛋白要多30%左右！

样品前处理的各个步骤就介绍到这，下篇将继续分享样品前处理的最新方法与进展

7. 急！！！色谱柱常用填充料及原理

常见色谱柱中的填料分类

1、液相

a、反相（与离子对）方法
C18（十八烷基或ODS）----------- 普适性好；保留性强，用途广
C8（辛基） -----------与C18相似，但保留值稍小
C3，C4 -----------保留值小；大多用于肽类与蛋白质
C1【三甲基硅烷（TMS）】------保留值最小；最不稳定
苯基，苯乙基 -----------保留值适中；选择性有所不同
CN（氰基） -----------保留值适中；正相和反相均可使用
NH2（氨基） -----------保留性弱；用于烃类；欠稳定
聚苯乙烯基b -----------在1＜PH＜13的流动相中稳定；对某些分 离峰形好，柱子寿命长

b、正相方法
CN（氰基） -----------普适性好；极性适中；用途广
OH（二醇基） -----------极性大于CN
NH2（氨基） -----------极性大，欠稳定
硅胶b ------------普适性好；价廉；操作欠方便；用于制备LC

c、空间排阻方法
硅胶b -----------普适性极好；作吸附剂用
硅烷化硅胶 -----------吸附性弱，溶剂兼容性好；适用于有机溶剂
OH（二醇基） ------------欠稳定；在水SEC中使用（凝胶过滤）
聚苯乙烯基b ------------广泛用于有机SEC（凝胶渗透）；一般与水和极性大的有机溶剂不相容

d、离子交换方法
键合相 ------------稳定性与重现性均不好
聚苯乙烯基b -------------柱效不高；稳定；重现性好

a ：除另有说明，均为硅胶基质键合相
b ：此类填料为非键合相

2、GPC

3、气相

4、spe中的填料

转自：分析测试网络网

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8. thermo离子交换sax使用方法

Thermo 离子交换色谱柱使用
首先，感谢您选择性能优越的Thermo色谱柱产品。
为了使您的色谱柱能发挥最大的性能，敬请先阅读以下说明：
1、适用类型
Thermo离子交换色谱柱包括：BioBasic AX，SCX，Hypersil SAX，Hypersil Gold AX，SAX等。
2、柱体积
色谱柱的柱体积可以通过以下公式估算：
V=0.68 πr2L
V为色谱柱柱体积（mL），r为色谱柱内径（cm），L为色谱柱长度（cm）。
3、色谱柱柱效测试与保存
离子交换色谱柱出厂时都经过柱效测试，请参考柱效报告。
在条件允许情况下，请对新色谱柱进行柱效测试。
离子交换色谱柱出厂时均保存在乙醇溶液中（如有不同，以柱效报告为准）。
4、温度
所有硅胶基质色谱柱使用温度应低于60℃。
5、样品
最好将样品溶解在流动相或极性相近的溶剂中。如果使用梯度洗脱，则需要将样品溶解在初始流动相或极性相近的溶剂中。
样品溶液不应含有任何颗粒物，最好使用0.5μm或更小粒径的滤膜过滤。同时建议在色谱系统中使用在线过滤器。
6、流动相
所用溶剂通常为水、乙腈、甲醇等，Thermo的离子交换色谱柱可以100%水为流动相，进行盐的梯度洗脱。
流动相中含有机相时，请注意降低盐的浓度，以防止溶剂混合后盐从流动相中析出。更换流动相时也要注意这一问题，可先用含较高纯水的流动相除盐过渡。
请将流动相的pH值控制在2-8。缓冲盐浓度在500 mM以下。
所有流动相，最好当日实验当日配制，并使用2μm滤膜过滤。
7、色谱柱安装
请小心操作色谱柱。
不要摔、碰色谱柱，这样会损坏色谱柱床，使色谱柱性能下降。
使用合适的连接管路和接头，确保色谱柱连接处死体积降到最低（使用不锈钢接头时需要尤其注意）。我们建议使用SLIPFREE 接头，此接头与Thermo色谱柱以及其他品牌色谱柱均完美匹配。
8、色谱柱平衡
新柱在使用前，请预先用20倍柱体积甲醇/或乙腈冲洗色谱柱，然后以初始流动相（不含盐）冲洗10倍柱体积。
在进行正式分析之前，请使用至少20倍柱体积的流动相冲洗色谱柱，以使色谱柱达到平衡。
9、色谱柱保护
对于成分复杂的“脏”样品以及组分未知的样品，请尽量使用在线滤器或保护柱，如果可能，使用SPE小柱对样品进行前处理是更好的选择。上述做法可以有效延长色谱柱使用寿命。
10、色谱柱清洗
常规清洗：
每天完成分析之后，用100% 水冲洗30倍柱体积除盐，然后用20% 甲醇/或乙腈冲洗20个柱体积，保存在20% 甲醇/或乙腈中。
清洗强保留污染物：
如果发现离子交换色谱柱柱效出现大幅下降，可通过如下方法清洗离子交换色谱柱：首先用高浓度的缓冲盐溶液清洗（浓度是流动相的5-10倍，但不得超过1M），冲洗30倍柱体积。用100% 水冲洗20倍柱体积以除盐后，再用100%甲醇/或乙腈清洗30倍柱体积。最后用20%甲醇/或乙腈水溶液（不含盐）保存。
11、色谱柱保存
用100% 水冲洗30倍柱体积除盐后，若短期不使用（<1周），用20% 甲醇/或乙腈冲洗20倍柱体积后，保存在20% 甲醇/或乙腈中；若需长期放置（>1周），用50% 甲醇/或乙腈冲洗20倍柱体积后，保存在50% 甲醇/或乙腈中。
注意：如果违反上述规程，可能使色谱柱失去保修。

9. 色谱柱的填料

常见的分配柱填料：碳十八柱 （ODS/C18)、碳八柱（MOS/C8）、碳六柱（Hexyl/C6）、
碳四柱（Butyl/C4）、碳一柱（Methyl/C1）、阴离子交换柱（SAX)、
阳离子交换柱（SCX）、苯基柱（Phenyl）、氨基柱（Amino/NH2）、
氰基柱（Cyano/CN/Nitrile）
常见的吸附柱填料：硅胶柱

10. 磺酸基阳离子交换柱的磺酸基阳离子交换柱产品

Venusil SCX HPLC Columns强阳离子交换柱
粒径5um 孔径300A 比表面积50m2/g
强阳离子交换柱：以超纯硅胶为基质，表面键合有芳内香族磺酸基团。容300A，5um；比表面积50m2/g。可用于分离碱性、水溶性化合物和生物分子。中国药典2005版中，盐酸二甲双胍的有关物质测定方法即使用磺酸基阳离子交换（SCX）色谱柱。
Venusil SCX HPLC Columns 4.6*100mm/5um
Venusil SCX HPLC Columns 4.6*150mm/5um
Venusil SCX HPLC Columns 4.6*250mm/5um
三聚氰胺VSc 958505-m Venusil scx4.6*250mm/5um
（建议配保护柱卡套使用寿命更长）