离子交换柱层析分离氨基酸的注意事项

❶ 氨基酸的分离鉴定--纸层析法 有什么注意事项

点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面（即展层时样品可能达到的部分）。

氨基酸的一个重要光学性质是对光有吸收作用。20种Pr——AA在可见光区域均无光吸收，在远紫外区（<220nm）均有光吸收。

在紫外区（近紫外区）（220nm～300nm）只有三种AA有光吸收能力，这三种氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸，因为它们的R基含有苯环共轭双键系统。

(1)离子交换柱层析分离氨基酸的注意事项扩展阅读：

物理性质：

氨基酸为无色晶体，熔点超过200℃，比一般有机化合物的熔点高很多。α-氨基酸有酸、甜、苦、鲜4种不同味感。谷氨酸单钠盐和甘氨酸是用量最大的鲜味调味料。氨基酸一般易溶于水、酸溶液和碱溶液中，不溶或微溶于乙醇或乙醚等有机溶剂。

氨基酸在水中的溶解度差别很大，例如酪氨酸的溶解度最小，25℃时，100g水中酪氨酸仅溶解0.045g，但在热水中酪氨酸的溶解度较大。赖氨酸和精氨酸常以盐酸盐的形式存在，因为它们极易溶于水，因潮解而难以制得结晶。

❷ 如何用阴离子交换树脂层析分离混合氨基酸

1. 离子交换树脂是一种合成的高聚物,不溶于水,能吸水膨胀.高聚物分子由能电离的回极性答基团及非极性的树脂组成.极性基团上的离子能与溶液中的离子起交换作用,而非极性的树脂本身物性不变.通常离子交换树脂按所带的基团分为强酸(＝R＝S03H)、弱(＝COOH)、强碱 (＝N+＝R：)和弱碱(＝NH2＝NHR＝NR2).
   

2. 离子交换树脂分离小分子物质如氨基酸、腺苷、腺苷酸等是比较理想的.但对生物大于物质如蛋白质是不适当的,因为它们不能扩散到树脂的链状结构中.故如分离生物大子、可选用以多糖聚合物如纤维素、葡聚糖为载体的离子交换剂.

3. 本实验用磺酸阳离子交换树脂分离酸性氨基酸(天冬氨酸)、中性氨基酸(丙氨酸)碱性氨基酸(赖氨酸)的混合液.在特定的pH条件下,它们解离程度不同,通过改变脱液的pH或离子强度可分别洗脱分离.

❸ 急求：离子交换柱层析分离氨基酸的讲义

一、目的
学习用阳离子交换树脂柱分离氦基酸的操作方法和基本原理.
二、原理
各种氨基酸分子的结构不同,在同一PH时与离子交换树脂的亲和力有差异,因此可依亲和力从小到大的顺序被洗脱液洗脱下来,达到分离的效果.
三、器材
1、20cmX 1cm层析管 2、试管
3、吸管． 4、恒压洗脱瓶
5、部分收集器 6、搪磁杯
7、电炉 8、分光光度计
四、试剂和材料
1、．苯乙烯磺酸钠型树脂（强酸 lx 8,l00一200目,可用上海华东化工学院产品）
2 、2 mol／L盐酸溶液
3、2mol／L氢氧化钠溶液
4、标准氨基酸溶液 天冬氨酸、赖氨酸和组氨酸均配制成 2 mg／mL的0.1M盐酸溶液.
5、混合氢基酸溶液将上述天冬氨酸、赖氨酸和组氨酸溶液按1：2．5：10的比例混合.
6、柠檬酸－氢氧化钠一盐酸冲液（pH5.8）,钠离子浓度0 .45M）
取柠檬酸（C6O7H8.H20 ）14.25g、氢氧化钠9.30g和 浓盐酸 5．25 mL溶于少量水后,定容至 500 mL,冰箱保存.
7、显色剂 2 g水合茚三酮溶于 75mL乙二醇单甲醚中．加水至 100 mL.
8、50%乙醇水溶液
五、操作
1、层析柱的准备：将强酸型阳离子交换树脂用氢氧化钠处理成Na+型后洗至中性（处理方法见第三篇实验十二）．搅拌一小时后装成一个直径1cm．高 16～18 cm的层析柱.
2、氨基酸的洗脱：用P H5.8的柠檬酸缓冲液流洗平衡交换住（装置如图）.调节流速为 0.5 mL／min,流出液达床体积的4倍时即可上样.由柱上端仔细加人氨基酸混合液0．25—0．5 mL,同时开始收集流出液.当样品液弯月面靠近树脂顶端时,即刻加入0.5 mL拧檬酸缓冲液冲洗加样品处.待缓冲液弯月面靠近树脂顶端时.再加入0．5 mL缓冲液.如此重复两次,然后用滴管小心注入柠檬酸缓冲液（切勿搅动床面）,并将柱与洗脱瓶和部分收集器相连.开始用试管收集洗脱液,每管收集lmL．共收集60一80管.
3、氨基酸的鉴定：向各管收集液中加lmL水合茚三酮显色剂并混匀,在沸水浴中淮确加热15分钟后冷却至室温．再加15 mL的50％乙醇液.放置10分钟.以收集液第2管为空白,测定A570nm波长的光吸收值.以光吸收值为纵坐标,以柱洗脱体积为横坐标绘制洗脱曲线.以已知3种氨基酸的纯溶液为样品,按上述方法和条件分别操作,将得到的洗脱曲线与混合氨基酸的洗脱曲线对照．可确定3个峰的大致位置及各蜂为何种氨基酸.

❹ 求问怎么用离子交换树脂层析分离混合氨基酸

【原理】离子交换树脂是一种合成的高聚物，不溶于水，能吸水膨胀。高聚物分子由能电离的极性基团及非极性的树脂组成。极性基团上的离子能与溶液中的离子起交换作用，而非极性的树脂本身物性不变。通常离子交换树脂按所带的基团分为强酸(＝R＝S03H)、弱(＝COOH)、强碱 (＝N+＝R：)和弱碱(＝NH2＝NHR＝NR2)。
离子交换树脂分离小分子物质如氨基酸、腺苷、腺苷酸等是比较理想的。但对生物大于物质如蛋白质是不适当的，因为它们不能扩散到树脂的链状结构中。故如分离生物大子、可选用以多糖聚合物如纤维素、葡聚糖为载体的离子交换剂。
本实验用磺酸阳离子交换树脂分离酸性氨基酸(天冬氨酸)、中性氨基酸(丙氨酸)碱性氨基酸(赖氨酸)的混合液。在特定的pH条件下，它们解离程度不同，通过改变脱液的pH或离子强度可分别洗脱分离。
【材料】1．实验器材层析柱（1.6X20cm）；恒流泵；梯度混合器；试管及试管架；紫外分光光度计、磺酸阳离子交换树脂(Dowex 50)
2．实验试剂
(1)2mol／L HCl
(2)2mol／L NaOH
(3)0.1mOl／L HCl
(4) 0.1mol／L NaOH
(5)pH4.2的柠檬酸缓冲液：0.lmol／L柠檬酸54m1加0.1mol／L柠檬酸钠46ml
(6)pH5的醋酸缓冲液：0.2mol／L NaAc 70ml加 0.2mol／L HAc 30ml
(7)0.2％中性茚三酮溶液：0.2g茚三酮加100ml丙酮
(8)氨基酸混合液：丙氨酸、天冬氨酸、赖氨酸各10m1加0.1mol／L HCl 3m【方法】
1. 树脂的处理
100ml烧杯中置约10g树脂，加25ml 12mo1／L HCl搅拌2h，倾弃酸液，用蒸馏水充洗涤树脂至中性。加25ml 12mol／L NaOH至上述树脂中搅拌2h，倾弃碱液，用蒸馏水洗涤至中性。将树脂悬浮于50ml pH4.2柠檬酸缓冲液中备用。
2. 装柱取直径0.8cm～1.2cm、长度 10cm～12cm的层析柱，底部垫玻璃棉或海绵圆垫，自顶部注入经处理的上述树脂悬浮液，关闭层柱出口，待树脂沉降后，放出过量的溶液，在加入一些树脂，至树脂沉积至8cm～10cm高度即可。于柱子顶部继续加入pH4.2柠檬酸缓冲液洗涤，使流出液pH为4.2为止，关闭柱子出口，保持液面高出树脂表面1cm左右。
3. 加样、洗脱及洗脱液收集
打开山口使缓冲液流出，待液面几乎平齐树脂表面时关闭出口(不可使树脂表面干燥)。用长滴管将15滴氨基酸混合液仔细直接加到树脂顶部，打开出口使其缓慢流入柱内。当液面刚平树脂表面时，加入0.1mol／L HCl 3ml，以10滴／min～12滴／min的流速洗脱，收集洗脱液，每管20滴，逐管收存。当HCl液面刚平树脂表面时，用1m1 pH4.2柠檬酸缓冲液冲洗柱壁一次，接着用2ml pH4.2柠檬酸缓冲液洗脱，保持流速10滴／min～12滴／min并注意勿使树脂表面干燥。
在收集洗脱液的过程中，逐管用茚三酮检验氨基酸的洗脱情况，方法是：于各管洗脱液中加10滴pH5醋酸缓冲液和10滴中性茚三酮溶液，沸水浴中煮10min，如溶液呈紫蓝色，表示已有氨基酸洗脱下来。显色的深度可代表洗脱的氨基酸浓度，可比色测。
在用pH4.2柠檬酸缓冲液把第二个氨基酸洗脱出来之后，再收集两管茚三酮反应阴性部分，关闭层析柱出口，将树脂顶部剩余的pH4.2柠檬酸缓冲液移去。
于树脂顶部加入2ml 0.1mo1／L NaOH，打开出口使其缓慢流入柱内，按上面I续用0.1mo1／L NaOH洗脱并逐管收集 (注意仍然保持流速10滴／min～12滴／min)，每管20滴。做洗脱液中氨基酸检验，在第三个氨基酸用0.1mo1／L NaOH洗脱下来以后，再继续收集两管茚三酮反应阴性部分。
最后以洗脱液管号为横坐标，洗脱液各管光密度（以水作空白，在570nm波长读取吸光度）或颜色深浅（以 -，±，+，++．．．表示）为纵坐标作图，即可画出一条洗脱曲线。
【注意事项】
1. 一直保持流速10滴/min～12滴／min，并注意勿使树脂表面干燥。
2. 在装柱时必须防止气泡、分层及柱子液面在树脂表面以下等现象发生。

❺ 离子交换柱层析法分离氨基酸实验装柱有哪些注意事项

氨基酸的分离鉴定——纸层析法
一,实验目的
掌握氨基酸纸层析的方法和原理,学会分析待
测样品的氨基酸成分.
二,实验原理
纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析.滤纸纤维上的羟基具有亲水性,吸附一层水作为固定相,有机溶剂为流动相.当有机相流经固定相时,物质在两相间不断分配而得到分离.
溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示:
Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离
在一定的条件下某种物质的Rf值是常数.Rf值的大小与物质的结构,性质,溶剂系统,层析滤纸的质量和层析温度等因素有关.本实验利用纸层析法分离氨基酸.
三,实验器材
(1)大烧杯(5000mL):1只/组
(2)微量注射器(100 L):1只/ 组.
(3)喷雾器:公用.
(4)培养皿:1只/组.
(5)层析滤纸(长22cm,宽14cm的新华一号滤纸):1张/组.
(6)直尺,铅笔:自备.
(7)电吹风:1只/组.
(8)托盘,针,白线:1套/组.
(9)手套:1双/组.
(10)塑料薄膜:公用.
(11)小烧杯:50mL,1只/组.
四,实验试剂
(1)扩展剂:将4体积正丁醇和1体积冰醋酸放入分液漏斗中,与5体积水混合,充分振荡,静置后分层,弃去下层水层.
(2)氨基酸溶液:0.5%的已知氨基酸溶液3种(赖氨酸,苯丙氨酸,缬氨酸),0.5%的待测氨基酸液1种.
(3)显色剂:0.1%水合茚三酮正丁醇溶液.
实验试剂
五,实验操作
检查培养皿是否干燥,洁净;若否,将其洗净并置于干燥箱内120℃烘干.
(1)平衡:剪一大块塑料薄膜铺在桌面上,将层析缸或大烧杯到置于塑料薄膜上,再把盛有约20mL展层溶液的小烧杯置于倒置的层析缸或大烧杯中,用塑料薄膜密封起来,平衡20min.
(2)规划:带上手套,取宽约14cm,高约22cm的层析滤纸一张.在纸的下端距边缘2cm处轻轻用铅笔划一条平行于底边的直线A,在直线上做4个记号,记号之间间隔2cm,这就是原点的位置.另在距左边缘1cm处画一条平行于左边缘的直线B,在B线上以A,B两线的交点为原点标明刻度(以厘米为单位),参见左图.
(3)点样:用微量注射器分别取10mL左右的氨基酸样品(每取一个样之前都要用蒸馏水洗涤微量注射器,以免交叉污染),点在这四个位置上.挤一滴点一次,同一位置上需点2～3次,2～3mL/次,每点完一点,立刻用电吹风热风吹干后再点,以保证每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm.每人须点4个样,其中3个是已知样,1个是待测样品.
(4)层析:用针,线将滤纸缝成筒状,纸的两侧
边缘不能接触且要保持平行,参见图3-3.向培养皿中加入扩展剂,使其液面高度达到1cm左右,将点好样的滤纸筒直立于培养皿中(点样的一端在下,扩展剂的液面在A线下约1cm),罩上大烧杯,仍用塑料薄膜密封.当扩展剂上升到A线时开始计时,每隔一定时间测定一下扩展剂上升的高度,填入表3-1中.当上升到15～18cm,取出滤纸,剪断连线,立即用铅笔描出溶剂前沿线,迅速用电吹风热风吹干.
(5)显色:用喷雾器在通风厨中向滤纸上均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液,然后立即用热风吹干,即可显出各层析斑点,参见左图.
(6)计算各种氨基酸的Rf值,并判断混合样品中都有哪些氨基酸,各人将自己的实验结果贴在实验报告上,见表3-2.
(7)以层析时间为横坐标,扩展剂上升高度为纵坐标画图,求出扩展剂上升到18cm时所需要的时间.
(8)将微量注射器内外用蒸馏水清洗干净,倒掉用过的展层液和平衡液,将培养皿洗净,整理好桌面上的仪器和试剂

❻ 以离子交换色谱法为例，简述湿法装柱的操作过程和注意事项

1.样品处理：对被分离样品有时要经过水解等化学处理，样品溶液一般要兼顾到浓度与粘度两方面。
+ B4 ^: J i3 _) \- T: R/ |" v2.离子交换柱的安装：层析柱内径必须粗细均匀，柱管大小可据实际需要选择。柱下端胶塞中插入一放液管，胶塞上盖以园形尼龙绸或发泡塑料片以防止交换树脂流出。
+ H/ ?0 X, d' E2 P8 h& S- U3.装柱：⑴装柱质量是确保柱层析分离效果的技术关键之一，越是高技术层析(如使用毛细管层析柱的高级层析设备)装柱的技术要求和难度越高，以至手工操作很难达到。⑵装柱的质量要求，无论是手工、机械、自动化装柱都是一样的，要求装入柱中的分离载体材料松紧适度，分布均匀，无气泡、无断层、无结节，能保持正常的溶胀形态和结构；⑶装入柱中树脂的高度与直径之比因分离对象和分离目的不同而相差很大，本教材推荐的肝素钠洗脱柱装柱高度是柱径的4～6倍。⑷操作次序，以手工装入溶胀的D254树脂（湿法装柱）为例，其操作程序可概括为：①查连接(柱与塞之间、上下塞与进出液管之间、梯度混合器与进液管之间、出液管与收集器之间等等的连接是否正确、紧密)，②试止漏（塞子、接头、活塞开关处在长时间满负荷下不泄漏），③加隔离缓冲垫（紧贴于柱子下端塞子的内平面），④加少许平衡液于空柱内，⑤赶气泡（缓冲垫内和出水管中的气泡），⑥开通放水开关，⑦与放水量保持相当的流速，向柱内匀速加完载体材料浆，⑧关闭放水开关，令树脂自然下沉，⑨用洗涤液和清水洗涤树脂，⑩最后用缓冲液过柱和平衡柱，使树脂结构平衡稳定，⑾在树脂表面盖上一片尼龙或泡膜塑料，并与柱子内壁保持严密接触，以防加样时树脂泛起。
( ?6 Y, g6 D5 S2 e- z% v b* m4.加样：缓缓打开柱子下端的放液开关,使柱内液面刚好降至树脂面时便立即将样品溶液小心地加到尼龙或泡膜塑料片上，待样品液面刚好进入树脂层内便立即加入少许平衡缓冲液,以清洗粘附在覆盖层中的样品，并随之进入树脂层。当柱内液位接近树脂表面时便立即添加洗涤液进行洗涤操作。$ o+ c9 M: n3 `% Q
5.洗涤：选用合适的洗涤液、恰当的总用量及洗涤流速，小心洗涤柱内树脂，以除去不被离交树脂吸附的杂质。: K0 s* j/ p; W4 d) o7 W6 _
6.洗脱：由洗脱曲线找出洗脱液的最佳浓度和适当的总量、操作压及流速进行洗脱。
5 m- U F# X! m' M. O# g! |7.监测：用敏感快速的方法（参见下文“测定”）监测分离成分是否洗脱出来以及洗脱峰的轴向分布
9 v2 C$ h- _- \: S8.收集：一旦发现待分离成分洗脱出来便可进行一步或分步收集，并可根据各成分洗脱峰的轴向分布和浓度监测，决定产品收集浓度区段，弃去的洗脱液可循环用于相同成分的洗脱。
1 v7 I2 v8 H, m8 y3 ] M; J8 m9.沉淀/离心：用沉淀剂可将分离组分沉淀或离心下来脱水干燥，沉淀剂回收再用。
" a3 @7 z0 a' t10.脱水干燥：加入适当脱水剂为如无水乙醇、丙酮或乙醚脱水后进一步干燥。5 _" H" J" X0 e% v" V
11.测定：对层析所得产品可称重或测定活性计算其得量和收率。. ^7 ]4 x, e- `1 p# y- z. d7 g9 m5 `
【注意事项】4 G; U! }* `$ X7 C" b: b0 f
1.应根据被分离物质的理化性质、分子大小、分子形状和分离的目的要求，选择分离效果好、交换容量大而机械强度较高的分离载体材料。市售的分离载体有明确的规格型号、理化性质、功能作用、活化再生和保养存放等技术参数资料可供用户选择。
* K7 Q, U. T% x8 y5 R2.应根据分离纯化的对象、规模选择层析柱的长短、粗细、柱高与内径之比，使达到最佳分离效果；此外，柱子材料的化学性质要稳定、透明，内径要均一、光滑，死腔要愈小愈好，要有利于紧固、连接、装柱与维护。
4 E& F! k7 Q. W3 [& s/ k( ?- P3.柱子安放要垂直、稳固，与之相连的各种线路、管道、设备、设施的布局和连接要紧奏，要方便操作、观察与维护。4 F5 w( v8 w+ c4 C
4.要求装入柱中的分离载体材料松紧适度，分布均匀，无气泡、无断层、无结节，能保持正常的溶胀形态和结构。5 F n1 O% }8 d z+ T0 L# t2 |3 C
5.保持柱内树脂层面平整、层序结构始终如一是确保柱层析分离效果的又一技术关键。为此，从装柱到洗脱结束的过程中，尤其是加样、洗涤、洗脱过程中要始终保持柱内液位不低于柱内树脂的顶部平面，尤其要始终保持柱内树脂的层序结构始终如一，不被打乱，特别要防止更换浓度不同的洗涤洗脱液时发生“翻缸”而搅乱树脂层结构，“压缸”而造成柱层断裂和梗塞断流。
7 z/ W" C+ E8 q: i& t g6.注意保持一定的操作压，这对确保层析柱流速和分离效果十分重要。因为流速不仅与洗脱液加在柱上的压力（因液面差造成）有关，也与装柱材料的粒度、交联度、机械强度有关。应针对具体情况建立一个操作压、流速和分离效果的最佳平衡点。
; N( j K7 n0 T" {9 [$ S6.显著标明各种洗涤、洗脱液的技术参数，严禁乱用和混用。) M) k" o* {2 g( F
7.制作洗脱曲线，确定洗脱液收集方案，设置洗脱监控点。2 N; I* F% \6 e9 I5 J% X1 V
8.注意剔除破损树脂，及时补足流失、破损的循环树脂量。
# S5 F F8 K3 V2 ]9 A1 E6 U+ o9.严格掌握新、旧树脂的活化、再生条件，及时再生旧树脂。$ h4 U9 m: L5 L7 g
树脂的再生：每次洗脱结束，用清水将树脂洗出柱体再用、再生，或用高浓度的NaCl溶液浸泡贮存。树脂经过一段使用后树脂上的活性基团因被交换而使交换容量大为降低，此时树脂需要再生处理。( z# |! T+ @) z" O
大处理（酸—碱—酸）：加入树脂2倍量的2mol HCL溶液搅拌3小时，自来水冲洗至中性；又用2mol NaOH溶液照酸处理方式处理；再用2mol HCL处理。
5 F% O1 U$ W2 r小处理（碱—酸）：浓度、方法同上。) o4 @' Y" x8 ]8 s2 {8 P6 i
连续用数次的树脂进行小处理，用十次后的树脂要进行大处理。
4 {, T2 J( F& L& C: a- C% E& g$ X9 v10．注意脱水干燥条件。$ M) H0 {1 @& q' Y9 j" t7 n1 x

❼ 怎样利用离子交换柱层析法分离不同的蛋白质

离子交换内的介质一般是树脂，阳离子交换型的，使用前树脂先用碱处理成钠型，将氨基酸混合液（pH=2-3)上柱，pH=2-3时，氨基酸主要以阳离子形式存在，与树脂上的钠离子发生交换而被“挂”在树脂上，再用洗脱剂洗脱。不同的氨基酸（带的电荷不同）与树脂的亲和力不同，要将其分离洗脱下来，需要降低它们之间的亲和力，方法是逐步提高洗脱剂的pH和盐浓度，这样各种氨基酸将以不同的速度被洗脱下来。

❽ 离子交换层析分离氨基酸时，（苯乙烯磺酸钠）为什么组氨酸后洗脱出来而赖氨酸先洗脱出来

你们是不是这样分析的：组氨酸的PI是7.59，赖氨酸是9.74，这证明赖氨酸碱性更强，酸性更弱，而用H+洗脱时，先洗脱是应该是酸性弱的物质所以赖氨酸应该先洗脱下来？
或许可以这样解释：碱性氨基酸和阳离子交换树脂的结合是以氢离子为媒介，借助氢键的极性连接起来的。如果我没记错的话，伯氨基形成的氢键要比仲氨基形成的氢键强一些。
不管用是钠型的还是氢型的阳离子交换树脂，组氨酸和赖氨酸要与其吸附都必需通过氢离子。钠型的阳离子交换树脂并是不所有的磺酸基都与钠离子结合的。你用平衡常数算一下。而且，你用来溶解氨基酸的溶液是强碱性的吗？你的树脂是再生的吗？
满意请采纳。

❾ 氨基酸的分离鉴定--纸层析法 有什么注意事项

样品中可能含有这3种氨基酸氨基酸是指样品主要是这三种氨基酸还是微量杂质是这三种氨基酸，这是不一样的。

如果样品就是这三种氨基酸的一种或几种组成，那直接氘水溶了打个核磁就好了，比例也有了。

如果是复杂样品含有这三种氨基酸，那基本只能用hplc了，接不接ms看样品，hplc分离这些还是很简单的，典型的就酸性磷酸盐缓冲液/乙腈，柱子可以选比如Waters的BEH-Amide柱或者CORTECS HILIC柱走HILIC条件，这3种氨基酸除了天冬氨酸外都是偏中性烷基侧链的，用Waters的CSH C18柱或者CORTECS C18+柱这类表面带电颗粒的柱子走反相应该也是可以的。
先说加入15%三氯醋酸的必要性：作为一种蛋白质沉淀剂，它能将混有的蛋白质沉淀而除去，避免进行纸层析时混有的蛋白质和茚三酮溶液反应干扰实验。
其次，题主先搞明白纸层析的原理。由于产物中的丙氨酸比谷氨酸极性弱，由相似相容原理，丙氨酸会更易溶于流动相即酚溶液（非极性）中得以分离。而加入的三氯醋酸会使得丙氨酸带上正电荷，和谷氨酸极性的差别变小，不易通过纸层析分离。

❿ 离子交换层析的具体操作

对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为-H-型交换剂。
洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。
柱子装好后再用起始缓冲液淋洗，直至达到充分平衡方可使用。 加样：
层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度，所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围，同时要注意离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。为了达到满意的分离效果，上样量要适当，不要超过柱的负荷能力。柱的负荷能力可用交换容量来推算，通常上样量为交换剂交换总量的1%-5%。 已结合样品的离子交换前，可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变pH与离子强度。为了使复杂的组份分离完全，往往需要逐步改变pH或离子强度，其中最简单的方法是阶段洗脱法，即分次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。由于这种洗脱pH与离子强度的变化大，使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分离。最好的洗脱方法是连续梯度洗脱，洗脱装置见图16-6.两个容器放于同一水平上，第一个容器盛有一定pH的缓冲液，第二个容器含有高盐浓度或不同pH的缓冲液，两容器连通，第一个容器与柱相连，当溶液由第一容器流入柱时，第二容器中的溶液就会自动来补充，经搅拌与第一容器的溶液相混合，这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。第一容器中任何时间的浓度都可用下式进行计算：
C=C2-(C2-C1)(1-V)A2/A1
式中A1、A2分别代表两容器的截面积：C1、C2分别表示容器中溶液的浓度；V为流出体积对总体积之比。当A1=A2时为线性梯度，当A1>A2时为凹形梯度，A1>A2时为凸形梯度。
洗脱时应满足以下要求：
①洗脱液体积应足够大，一般要几十倍于床体积，从而使分离的各峰不至于太拥挤。
②梯度的上限要足够高，使紧密吸附的物质能被洗脱下来。
③梯度不要上升太快，要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态。目的物的过早解吸，会引起区带扩散；而目的物的过晚解吸会使峰形过宽。
洗脱馏份的分析按一定体积（5-10ml/管）收集的洗脱液可逐管进行测定，得到层析图谱。依实验目的的不同，可采用适宜的检测方法（生物活性测定、免疫学测定等）确定图谱中目的物的位置，并回收目的物。
离子交换剂的再生与保存离子交换剂可在柱上再生。如离子交换纤维素可用2mol/：NaCl淋洗柱，若有强吸附物则可用0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生，也可用乙醇洗涤，其顺序为：0.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20%NaOH-水。保存离子交换剂时要加防腐剂。对阴离子交换剂宜用0.002%氯已定（洗必泰），阳离子交换剂可用乙基硫柳汞（0.005%）。有些产品建议用0.02%叠氮钠。