无菌检查薄膜过滤方法

㈠ 混悬液的无菌如何采用薄膜过滤法

你参考一下这篇文献看看：《复方磺胺嘧啶银混悬液无菌检查方法的建立及验回证》丁答长玲田洪根成培光赵永德周肖龙薄明香来源：《中国药房》2010年第45期。 原文找不到，只有摘要。 摘要：目的：建立复方磺胺嘧啶银混悬液无菌检查法并进行验证。方法：将样品经无菌定性滤纸初过滤后，取滤液适量，采用pH7．0氯化钠一蛋白胨缓冲液作为冲洗剂，冲洗量分别为300、600、900mL，以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉作为试验菌种，按照薄膜过滤法进行无菌检查，以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌进行验证试验。结果：最佳冲洗量为细菌检查600mL、真菌检查300mL；验证试验中阳性对照菌24h内生长正常，各供试品管均未见菌生长，检验结果符合规定。结论：复方磺胺嘧啶银混悬液无菌检查时可以通过定性滤纸过滤和薄膜过滤联用的方法消除其抑菌活性。 感觉有用的话，可以求助找一下这篇文献。

㈡ 青霉素钠无菌检查的方法验证

目的 建立健全青霉素钠无菌检查方法，保证检验结果的准确性和可靠性。

方法 采用薄膜过滤法进行。

1.培养基及其制备方法

培养基应适合需气菌、厌气菌或真菌的生长，可按以下处方制备，亦可使用按该处 方生产的符合规定的脱水培养基。以下培养基制备时，均以115℃灭菌30分钟。 1.需气菌、厌气菌培养基(硫乙醇酸盐流体培养基) 酪胨（胰酶水解） 15g 氯化钠 2.5g 葡萄糖 5g 新配制的0.1%刃天青溶液 1.0ml L－胱氨酸 0.5g (或新配制的0.2%亚甲蓝溶液0.5ml) 硫乙醇酸钠 0.5g 琼脂 0.5～0.7g (或硫乙醇酸0.3ml) 水 1000ml 酵母浸出粉 5g 除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分加入水内，微温溶解后，调节pH为弱碱性， 煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.1±0.2，分装， 灭菌。 在供试品接种前, 培养基指示剂氧化层的颜色不得超过培养基深度约1/5，否则,须 经水浴煮沸加热, 只限加热一次。

2.选择性培养基

(1) 对氨基苯甲酸培养基（用于磺胺类药物的无菌检查） 照上述需气菌、厌气菌 培养基及真菌培养基的处方及制法，各加对氨基苯甲酸0.125g，溶解后，摇匀,分装,灭 菌。 (2) 聚山梨酯80培养基（用于油剂药品的无菌检查） 照上述需气菌、厌气菌培养基 及真菌培养基的处方及制法，各加10ml聚山梨酯80，摇匀，分装，灭菌。

3.操作

按该药品项下规定的方法处理后, 加入0.9%无菌氯化钠溶液或其他适宜的溶剂至少100ml中, 混合后，通过装有孔径不大于0.45μm的薄膜过滤器，然后用0.9%无菌氯化钠溶液或其他适宜的溶液冲洗滤膜至阳性对照菌正常生长。将需气菌、厌气菌培养基，真菌培养基用阳性对照管用培养基分别加至薄膜过滤器内（封闭式过滤器），或取出滤膜分成3等份,分别加入上述二种培养基中，按规定温度和时间培养。阳性对照管应根据供试品特性加入相应对照菌液1ml(抗细菌药物，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗厌氧菌药物，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌药物，以白色念珠菌为对照菌)。阳性对照管细菌应在培养24～48小时，真菌应在培养24～72小时有菌生长。结果判断当阳性对照管显浑浊并确有细菌生长，阴性对照管呈阴性时，可根据观察所得的结果判定。

结果判断 如需气菌、厌气菌及真菌培养基管均为澄清或虽显浑浊但经证明并非有菌生长,均应判为供试品合格；如需气菌、厌气菌及真菌培养基管中任何1管显浑浊并确证为有菌生长，应重新取2倍量供试品，分别依法复试，除阳性对照管外，其他各管均不得有菌生长，否则应判为供试品不合格。

讨论 目前，抗生素类药物的应用非常广泛，针对每种抗生素类药物建立严格的质量标准，提高抗生素的质量就显得尤为关键。所以对一个新品种建立无菌检查法时，对其方法进行验证就显得尤为必要。薄膜过滤法作为无菌检查中的一种方法，具有准确、方便、快捷的优点，是无菌检查时所采用的一种重要方法。试验表明上述方法操作方便快捷、结果准确。所以，该无菌检查方法验证对保证结果的可信度和准确性具有重要意义。

㈢ 无菌检查法的抑细菌和抑真菌试验

在用直接接种法无菌检查前，可用如下方法测定供试品是否具有抑细菌和抑真菌作
用。用需气菌、厌气菌培养基4管及真菌培养基2管，分别接种金黄色葡萄球菌、生孢梭
菌、白色念珠菌均10～100个菌各两管，其中1管加供试品规定量，所有培养基管置规定
的温度，培养3～5天。如培养基各管24小时内微生物生长良好，则供试品无抑菌作用。
如加供试品的培养基管与未加供试品的培养基管对照比较，微生物生长微弱、缓慢或不
生长，均判为供试品有抑菌作用。该供试品需用稀释法（种入较大量培养基中）或中和
法、薄膜过滤法处理，消除供试品的抑菌性后，方可接种至培养基。
检查法
无菌检查法包括：直接接种法和薄膜过滤法。前者适用于非抗菌作用的供试品，后
者适用于有抗菌作用的或大容量的供试品。
操作时，应用适当的消毒液对供试品容器表面或外包装浸没或擦拭消毒后，以无菌
的方法取内容物。
凡无菌检查中，均应取相应溶剂和稀释剂同法操作，作阴性对照。
1. 直接接种法
(1) 供试品准备 供试品如为注射液、供角膜穿通伤及手术用的滴眼剂或灭菌溶
液，按表1或表2规定量取供试品，混合。
供试品如为注射用无菌粉末或无菌冻干品或供直接分装成注射用的无菌粉末原料，
按表1或表2规定量取供试品，加入无菌水或0.9%无菌氯化钠溶液,或该药品项下规定的
溶剂用量制成一定浓度的供试品溶液。
供试品如为外科敷料，取供试品4个包装,以无菌操作拆开包装，于不同部位分别剪
取约100mg或1cm×3cm的供试品11份；肠线、缝合线取最小包装5个，拆开包装，共取11
股，接种于足以浸没供试品的适量培养基中。
供试品如为灭菌医用器具，依样品大小、形状的不同，取供试品11个，接种于足以
浸没供试品的适量培养基中。或用0.9%无菌氯化钠溶液各40ml，分别冲洗内壁（输血、
输液袋）收集各冲洗液，混合，按薄膜过滤法检查。
供试品如为青霉素类药品，按表1或表3规定量取供试品，分别加入足够使青霉素灭
活的无菌青霉素酶溶液适量，摇匀，混合。亦可按薄膜过滤法检查。
供试品如为放射性药品，取供试品1瓶（支），接种于装量为7.5ml的培养基中。每
管接种量为0.2ml。
2.操作 取上述备妥的供试品,以无菌操作将该供试品分别接种于需气菌、厌气菌
培养基6管，其中1管接种金黄色葡萄球菌对照用菌液1ml，作阳性对照,另接种于真菌培
养基5管。轻轻摇动,使供试品与培养基混合。需气菌、厌气菌培养基管置30～35℃、真
菌培养基管置20～25℃培养7日。在培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。阳性对照
管在24小时内应有菌生长，如在加入供试品后，培养基出现浑浊，培养7天后,不能从外
观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中或斜面培养基上
继续培养，细菌培养2日，真菌培养3日，观察是否再出现浑浊或斜面有无菌生长，或用
接种环取培养液涂片，染色，用显微镜观察是否有菌。 2. 薄膜过滤法
如供试品有抗菌作用，按表1或表3规定量取供试品，按该药品项下规定的方法处理
后, 加入0.9%无菌氯化钠溶液或其他适宜的溶剂至少100ml中, 混合后，通过装有孔径
不大于0.45μm的薄膜过滤器，然后用0.9%无菌氯化钠溶液或其他适宜的溶液冲洗滤膜
至阳性对照菌正常生长。将需气菌、厌气菌培养基，真菌培养基用阳性对照管用培养基
分别加至薄膜过滤器内（封闭式过滤器），或取出滤膜分成3等份,分别加入上述二种培
养基中，按规定温度和时间培养。阳性对照管应根据供试品特性加入相应对照菌液1ml(
抗细菌药物，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗厌氧菌药物，以生孢梭菌为对照菌；抗真
菌药物，以白色念珠菌为对照菌)。阳性对照管细菌应在培养24～48小时，真菌应在培养
24～72小时有菌生长。
结果判断
当阳性对照管显浑浊并确有细菌生长，阴性对照管呈阴性时，可根据观察所得的结
果判定：如需气菌、厌气菌及真菌培养基管均为澄清或虽显浑浊但经证明并非有菌生长,
均应判为供试品合格；如需气菌、厌气菌及真菌培养基管中任何1管显浑浊并确证为有
菌生长，应重新取2倍量供试品，分别依法复试，除阳性对照管外，其他各管均不得有
菌生长，否则应判为供试品不合格。

㈣ 薄膜过滤法原理

薄膜过滤法

采用薄膜过滤法，滤膜孔径不大于0.45um，直径约为50mm。选择滤膜材质时候应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用后，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润洗滤膜，供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml。每片滤膜的总过滤量不宜过大，以避免滤膜上的微生物受损伤。

取相当于每张滤膜含1克或1ml供试品的供试液，加至适宜的稀释剂中，混匀过滤。若供试品每1克或1ml所含的菌数比较多时，可取适宜稀释级的供试液1ml，过滤。用PH无菌氯化钠——蛋白胨缓冲液或其它适宜的冲洗液冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法和冲洗量同“计数方法的验证”，冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。

阴性对照实验

取实验用的稀释液1ml，照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。

培养和记数：

培养条件和记数方法同平皿法，每片滤膜上的菌数不应超过100个

菌数报告规则

以相当于1克或1ml供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌生长以<1报告菌数（每张滤膜过滤1g或1ml供试品），或以<1

乘于稀释倍数的值报告菌数。

㈤ 生物制品的无菌检查法的实验原理，准备工作及操作步骤

1. 目的：建立无菌检查的标准操作规程，确保检验结果的准确性。 2. 范围：适用于本厂质监科化验室对本厂生产的注射剂进行无菌检查。3. 责任：化验员有责任按本操作规程操作，并对检验结果负责。4. 定义：无菌检查法系指检查药品是否无菌的一种方法。5.内容：5. 1无菌操作设备：无菌操作室或超净工作台，无菌衣、口罩、帽子、消毒鞋、酒精灯等。5.1.1无菌室分无菌操作室和缓冲间。在缓冲间内应有洗手盆、干手器、无菌衣放置架及挂钩、拖鞋等。无菌操作室应具有空气除菌过滤的层流装置，局部洁净度100级超净工作台。缓冲间及操作室内均设置能达到空气消毒的紫外光灯和照明灯，操作室或工作台应保持空气正压。5.1.2无菌室应每周和每次操作前用0.1％新洁尔灭或2％甲酚液擦拭操作台及可能污染的死角，开动无菌空气过滤器及紫外光灯杀菌1小时。在每次操作完毕，同样用2％甲酚或0.1％新洁尔灭溶液擦拭工作台面，用紫外光灯杀菌半小 时。5.1.3无菌室的无菌程度检查：无菌室在消毒处理后，无菌试验前及操作过程中需检查空气中菌落数。取直径90mm双碟，在接种室内点燃酒精灯，在酒精灯旁，以无菌操作，将双碟半开注入溶化的营养琼脂培养基约20ml，制成平板：在35-37℃预培养48小时，证明无菌后将3个平板以无菌方式带入无菌操作间的洁净区域左、中、右各放1个；打开碟盖扣置，平板在空气中暴露30分钟后将盖盖好，置35-37℃培养48小时，取出检查，3个平板上生长的菌落数相加总数不得超过10个。 无菌操作台面或超净工作台应定期请有关部门检测其洁净度，应达到100级（一般用尘埃粒子计数仪），检测尘埃粒径≤5μm的粒数不得超过3.5个／升；空气流量应控制在0.75-1.0m3/s；细菌菌落数平均<1个，可根据无菌状况定期置换过滤器。5.1.4无菌室内应准备好盛有消毒用5％甲酚的玻璃缸、酒精灯、火柴、镊子、75％酒精棉及拖鞋等。5.2仪器、用具：5.2.1真空泵、恒温培养箱、生物显微镜、托盘天平（精度0.1g）、抽滤瓶（500ml）、 三角瓶（100、500 ml）、移液管（1、10ml）、注射器（要求规格）、试管、双碟（9cm）、注射针、镊子、剪刀、白金耳、橡皮管、纱布、棉花（原棉）、不锈钢吸管筒、接种环、微孔滤膜（直径约5cm），孔径应在0.45±0.02μm )载玻片、洒精灯、取样勺、吸耳球、喷雾瓶。5.2.2用具的包扎：5.2.2.1移液管在移液管上端管内,松松地塞进少许原棉,然后放入不锈钢灭菌筒内。5.2.2.2试管在管口塞上纱布棉塞。5.2.2.3无菌衣、裤、帽、口罩将洗净的衣裤、帽子、口罩配套后装入布袋，扎紧袋口，再用牛皮纸包好。5.2.2.4注射器洗涤干净的注射器及注射针头装配好后，放入垫有纱布的带盖容器内（饭 第3页/共7页盒）一层层放好，上面盖上纱布，然后盖上容器的盖子，用牛皮纸包好。5.2.2.5滤器 将检验合格后微孔滤膜先有水中浸泡湿润，取出后固定在细菌过滤器的滤板上，滤板下、滤膜上均用耐高温垫圈垫好，上好滤器。在灭菌前滤器的螺勿拧太紧，滤器上口用8层纱布及牛皮纸包扎，装妥后放入容器内，再将盛滤器的容器盖好盖子，用牛皮纸包扎。5.2.3用具的灭菌：将包扎好的用具，在121±0.5℃蒸汽灭菌柜中灭菌30分钟，物品取出时切勿立即置冷处，以免急速冷却灭菌物品内蒸汽冷凝造成负压，易致染菌，应置温箱或或加温烘干。5.3培养基、试剂：5.3.1一般采用商品干燥培养基，临用时按照使用说明书进行配制，需注意培养基的pH值应符合规定，否则必须校正后，灭菌使用。使用前，按要求分装灭菌好的细菌培养基须经30-35℃培养48小时，真菌培养基须经20-25℃培养72小时，证明无菌生长后方可使用。 制备的需气菌、厌气菌培养基应半个月内用完，在供试品接种前，培养基指示剂氧化层的颜色不得超过培养基深度约1/5，否则须经水浴煮沸加热，只限加热一次。5.3.2革兰氏碘液：先用3-5ml蒸馏水溶解2.0g碘化钾，再加入1.0g碘片，搅拌溶解后，加蒸馏水稀释至300ml，摇匀。置密闭棕色瓶中备用。5.3.3结晶紫染色液：将结紫1.0g溶解于20ml95%乙醇中后，与80ml1%草酸铵溶液相混合，静置48小时使用。此液稳定，置密闭的棕色瓶中可储存数月。5.3.4沙黄染色液：将0.2g沙黄溶解于10ml95%乙醇中，待完全溶解后再加蒸馏水至100ml。5.3.5生理盐水：称取9g氯化钠，加水1000ml溶解，分装后于121±0.5℃湿热灭菌30分钟。供作稀释剂用。 第4页/共7页5.3.6 75%乙醇量取无水乙醇75ml,加水稀释至100ml，摇匀，即得。5.3.7 0.1%新洁尔灭：量取5%新洁尔灭20ml，加水稀释至约1000ml，摇匀，即得。5.4培养基灵敏度检查：5.4.1新购的干燥培养基或采用不同牌号原材料的新鲜培养基，其质量均应符合灵敏度检查要求。 (1)取藤黄微球菌[Micrococcus luteus CMCC（B） 28001］的营养琼脂斜面和白色念珠菌[Candida albicans CMCC（F）98001］的真菌培养基琼脂斜面的新鲜培养物，分别用0.9%无菌氯化钠溶液制成均匀的菌悬液；取生孢梭菌[Clostridium sporogenes CMCC（B）64941]不含琼脂的需气、厌气培养基新鲜培养物，用灭菌毛细管将其吸至灭菌离心管内，离心，弃去上清液，沉淀菌体用0.9%无菌氯化钠溶液制成均匀菌悬液。然后以10倍系列稀释后，制成1ml中含10-100个菌并计数。 (2)取藤黄微球菌、生孢梭菌的需气、厌气培养基新鲜培养物，白色念珠菌的真菌培养基琼脂斜面的新鲜培养物，取接种至霉菌培养基内，20-25℃用0.9%无菌氯化钠溶液作10倍稀释，制成1ml中含10-100个菌并计数。 将藤黄微球菌的上述(1)或(2)的稀释液各1ml，分别接种至每管装量为9ml的需气、厌气菌培养基3管，生孢梭菌的上述(1)或(2)的稀释液各1ml，分别接种至每管装量为12ml的需气、厌气菌培养基3管，白色念珠菌的上述(1)或(2)的稀释液各1ml，接种至每管装量为9ml的真菌培养基3管，以未接种的培养基作对照，按规定的温度培养5天并逐日记录结果。结果判定：以每株菌接种后的培养基不得少于2管呈现生长，即该培养基的灵敏度检查符合要求。5.4.2配制的培养基应在凉暗处保存，一般不得超过2周，临用前细菌和霉菌培养基分别经30-35℃和20-25℃培养不少于48小时和72小时，证明无菌生长后方可使用。5.4.3需气菌、厌气菌培养基在试管中装量高度不得少于7Cm，其指示剂氧化层不得超过培养基深度的1／5，否则须经水浴煮沸10分钟，但只限加热一次。 第5页/共7页无菌试验培养时间结束时，指示剂氧化层应不超过培养基深度的1／2。5.5对照用菌液的制备：5.5.1试验用菌种、菌种的复苏、菌种的接种与保存等均应按照“抗生素微生物检定法”标准操作规程项下操作。5.5.2金黄色葡萄球菌菌液用接种环取金黄色葡萄球菌[Staphy-lococcus aureus CMCC（B）26003]的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，接种至营养肉汤培养基内，在30-35℃培养16-18小时后，用灭菌生理盐水稀释成1:1065.5.3生孢梭菌菌液用接种环取生孢梭菌[CMCC（B）64941]的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物1白金耳，接种至相同培养基内，在30-35℃培养18-24小时后，用灭菌生理盐水稀释成1:106。5.5.4白色念珠菌菌液用接种环取白色念珠菌[CMCC（F）98001]的真菌琼脂培养基斜面新鲜培养物1白金耳，接种至真菌培养基内，在20-25℃培养24小时后，用灭菌生理盐水稀释成1:105。5.5.5上述制备的菌液，一般当日使用。5.6进入无菌室的操作要点：5.6.1根据试验程序,将用具物品搬入缓冲间,打开紫外光灯和空气过滤装置并使其工作1小时以上。5.6.2操作人员用肥皂水刷洗双手,关闭缓冲间紫外光灯,进入缓冲间内,关闭第一层门,用2%来苏尔或0.1%新洁尔灭溶液洗双手,用消毒毛巾擦干,换上无菌衣、帽、口罩及消毒鞋。5.6.3关闭无菌室内紫外光灯，进入第二层门并将用具搬至无菌室内，关闭无菌室门。5.6.4凡进入无菌室后不应再外出取物品，因此，在每次试验中所用物品必须计划好，并准备好备用物品。从进入第一层门直至无菌室内，随操作人员的进入应喷雾2%来苏尔或0.1 %新洁尔灭溶液。5.7检查法：5.7.1无菌检查法包括：直接接种法和薄膜过滤法。前者适用于非抗菌作用的供试品；后者适用于有抗菌作用的或大容量的供试品。5.7.2操作时，应先用0.1%新洁尔灭浸泡或擦拭容器表面后，以无菌的方法取 第6页/共7页内容物。5.7.3凡无菌检查中，均应取相应溶剂和稀释剂同法操作，作阴性对照。5.7.4供试品制备： 用灭菌镊取出注射器，在火焰旁将针芯插入针管并安上针头，盖为橡皮塞时，用注射器在已消毒好的橡皮塞中心位置刺入吸取药液。按规定须稀释或灭活的供试品，可直接或将瓶内供试液抽出至灭菌玻璃容器内进行灭活处理并稀释至规定的体积和浓度；抽取瓶中内容液体时，应将供试品倒置并使针头在液面下。5.7.5直接接种法：按规定量取供试品，以无菌操作将该供试品分别接种于需气菌、厌气菌培养基6管，其中1管接种金黄色葡萄球菌液1ml，作阳性对照，另接种于真菌培养基5管。轻轻摇动，使供试品与培养基混合。需气菌、厌气菌培养基管置30-35℃、真菌培养基管置20-25℃培养7日。在培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。阳性对照管在24小时内应有菌生长，如在加入供试品后，培养基出现浑浊，培养7天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中或斜面培养基上继续培养，细菌培养2日，真菌培养3日，观察是否再出现浑浊或斜面有无菌生长，或用接种环取培养液涂片，染色，用显微镜观察是否有菌。5.7.6薄膜过滤法： 将微孔滤膜过滤装置、抽滤瓶、排气管与真空泵相连，真空泵可置无菌室外。取规定量供试品，按规定的方法处理后，加入0.9%无菌氯化钠溶液100ml中，混合后，通过装有孔径不大于0.45μm 的薄膜过滤器，减压抽干后，用0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次，每次至少100ml，取出滤膜分成3等份，分别加入上述二种培养基中，按规定温度和时间培养。阳性对照管应根据供试品特性加入相应对照菌液1ml（抗细菌药物，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗厌氧菌药物，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌药物，以白色念珠菌为对照菌）。阳性对照管细菌应在培养24-48小时，真菌应在培养24-72小时有菌生长。5.8结果判断： 第7页/共7页当阳性对照管显浑浊并确有菌生长，阴性对照管呈阴性时，可根据观察所得的结果判定：如需气菌、厌气菌及真菌培养基管均为澄清或虽浑浊但经证明并非有菌生长，均应判为供试品合格；如需气菌、厌气菌及真菌培养基管中任何1管显浑浊并确证有菌生长，应重新取2倍量供试品，分别依法复试，除阳性对照管外，其他各管均不得有菌生长，否则应判为供试品不合格。6 培训6.1 培训对象：化验员。6.2 培训时间：二小时。7 记录 记录名称 保存部门 保存时间 无菌检验记录 质监科 药品有效期后一年 QF-01-007-00无 菌 检 验 记 录品 名： 批 号： 规 格： 检验日期： 年 月 日培养基名称需气、厌气菌培养基真菌培养基培养培养温度30—35℃20—25℃培养时间管 号1234512345培养天数及结果1234567结 论备 注 复核人： 检验人：

㈥ 纯化水微生物限度检查用薄膜过滤法怎么做

准备工作：
1.
用纯化水浸泡滤膜，浸泡完全后放入滤杯中，包好滤杯，连同量筒、培养回基、平皿、取膜器、三角烧瓶等答一起121℃灭菌30min。
2.
灭菌后的物品一并传入洁净室中，微生物限度过滤器上连好已经灭好的滤杯，用缓冲液先润湿滤膜，抽掉缓冲液，然后倒入供试液（10倍稀释），滤过，再用缓冲液冲洗滤膜。
3.
过滤结束后取下滤膜平贴于R2A琼脂培养基平板上，32℃倒置培养5天。
4.
菌落计数（平皿上长几个菌结果就报几个菌）

㈦ 微生物薄膜过滤法，夹膜技巧

（1）验证试验方法：试验原理同前述薄膜过滤法。验证供试品对薄膜过滤法有抑细菌和抑真菌特性时，与实际的无菌检查相同，在同一型号的每个过滤器或过滤筒内过滤规定定量的供试品（容器数及每容器的过滤体积），用淋洗液淋洗滤膜至少3次，每次淋洗液体积为100ml，在最后一次淋洗液中，接入验证用菌种（接种量为10—100CFU）；另取一过滤器或滤筒，不过滤供试品，重复以上淋洗操作，作为阳性对照。根据具体情况，可将整张滤膜或半张滤膜转移至100ml的指定验证用培养基内，或将培养基加入到装有滤膜的滤筒内。分别对表中所列菌种及相应的培养基逐一进行验证，并将容器置于适当的温度下培养，培养时间不超过14d。如果使用新的滤膜或滤过器（包括不同厂家或批号、型号），则要按上述薄膜过滤法的要求做 , 组试验，即样品试验组、蛋白胨对照组和阳性对照组重新进行验证确认。
（2）验证结果评价：如果供试品培养基容器内的培养基内明显可见微生物生长（混浊），并且与阳性对照容器内的培养结果相似，则在无菌检查试验中必须要过滤与验证试验相等量的供试品、淋洗液，淋洗相同次数及使用同量的培养基。如果与阳性对照容器内的培养结果相比，供试品容器内微生物生长现象不明显，则说明该检验量在此检验条件下有抑菌作用。应增加淋洗次数，重复以上实验。也可通过更换过滤膜并使用中和剂来消除产品的抑菌作用。USP规定，如果已淋洗了5次，并且每次淋洗液体积达到500ml，仍无法中和膜上的残余抑菌性物质，那么在无菌检查试验中就采用此淋洗次数与淋洗量作为最终淋洗方法。

㈧ 什么是无菌检查法

无菌检查法
信息来源：中国药典2000年版二部附录 更新时间：2006-12-10 0:26:46
标题 无菌检查法
附录序号 附录ⅩⅢ
内容全文 B. 无菌检查法
无菌检查法系指检查药品与敷料是否无菌的一种方法。
无菌检查的全部过程应严格遵守无菌操作，防止微生物的污染。
生物制品应按卫生部《生物制品制造及检定规程》中有关无菌检查的规定办理。
培养基及其制备方法
1.需气菌、厌气菌培养基(硫乙醇酸盐液体培养基)
酪胨（胰酶水解）
15g
氯化钠
2.5g
葡萄糖
5g
新鲜配制的0.1％刃天青溶液
1.0ml
L－胱氨酸
0.5g
(或新鲜配制的0.2％亚甲蓝溶液 0.5ml)
硫乙醇酸钠
0.5g
琼酯
0.5～0.7g
(或硫乙醇酸0.3ml)
水
1000ml
酵母浸出粉
5g
除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分加入水内，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，按量加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.1±0.2，分装，115℃灭菌30分钟。
在无菌检查接种前, 培养基指示剂氧化层的颜色不得超过培养基深度约1/5。否则,须经水浴煮沸加热, 只限加热一次。
2.霉菌培养基
胨
5g
磷酸氢二钾（K2HPO4)
1g
酵母浸出粉
2g
硫酸镁（MgSO4·7H2O）
0.5g
葡萄糖
20g
蒸馏水
1000ml
除葡萄糖外，取上述成分加入水内，微温溶解后，调节pH约6.8，煮沸,加葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，115℃灭菌20分钟。
3.选择性培养基
(1) 对氨基苯甲酸培养基(用于磺胺类药物的无菌检查)
照上述需气菌、厌气菌培养基及霉菌培养基的处方及制法，各加对氨基苯甲酸0.125g，溶解后摇匀，分装，115℃灭菌30分钟。
(2) 吐温培养基(用于油剂药品的无菌检查)
照上述需气菌、厌气菌培养基及霉菌培养基的处方及制法，各加10ml的吐温80，摇匀后，分装，115℃灭菌30分钟。
4.营养肉汤培养基
胨
10g
肉浸液
1000ml
氯化钠
5g
取胨与氯化钠，加入肉浸液内，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，115℃灭菌30分钟。
5.营养琼脂培养基
照上述营养肉汤培养基的处方及制法，加入15～20g琼脂，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，115℃灭菌30分钟。
6.0.5％葡萄糖肉汤培养基
胨
10g
葡萄糖
5g
氯化钠
5g
肉浸液
1000ml
取胨与氯化钠加入肉浸液内，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，加葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2， 分装，115℃灭菌30分钟。
7.霉菌琼脂培养基
照霉菌培养基的处方及制法，加入15～20g琼脂，调节pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，115℃灭菌20分钟，趁热斜放使凝固成斜面。
上述培养基分别按15ml与40ml分装于试管中，装量约为试管高度的2/5，在115℃灭菌30分钟。细菌培养基经30～35℃培养48小时，霉菌培养基经20～25℃培养72小时后，应无菌生长。
培养基的质量应通过灵敏度检查。
培养基灵敏度检查法
1.菌种
(1)藤黄微球菌(Micrococcus Lutea)[CMCC(B)28001]

(2)生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B)64941]
(3)白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]
2.操作
取藤黄微球菌的营养琼脂斜面和白色念珠菌的霉菌琼脂斜面的新鲜培养物分别用0.9％灭菌氯化钠溶液制成均匀的菌悬液;将生孢梭菌的不含琼脂需气菌、厌气菌培养基的新鲜培养物,吸入灭菌离心管，离心，弃去上清液，菌体用0.9％灭菌氯化钠溶液制成均匀菌悬液。分别取上述菌悬液用0.9％灭菌氯化钠溶液稀释至与细菌浊度标 准管相同的浓度，然后，作10倍系列稀释并计数。

将藤黄微球菌1:10<5>～1:10<8>菌液、生孢梭菌1:10<6>～1:10<9>菌液、白色念珠菌1:10<5>～1:10<8>菌液各1ml,分别接种至9ml试验培养基中,每个稀释度至少接种3管,以未接种的培养基管作对照，细菌试验管置30～35℃培养3天,白色念珠菌试验管置20～25℃培养5天。逐日记录结果。
3.结果判定
以接种后培养基管数的2/3以上呈现生长的最高稀释度为该培养基的灵敏度（且接种菌量均应小于10个），三次试验中，以两次达到的最高灵敏度为判定标准。
需气菌、厌气菌培养基灵敏度为藤黄微球菌1:10<6>；生孢梭菌1:10<7>，霉菌培养基灵敏度为白色念珠菌1:10<6>。
[附注]
肉浸液制备法
取新鲜牛肉，除去肌腱及脂肪，切细，绞碎后,每1000g加水3000ml，充分拌匀，在2～10℃浸泡20～24小时，煮沸1小时，滤过，压干肉渣，补足液量，分装，121℃灭菌30分钟，置冷暗处备用。也可用牛肉浸出粉3g，加水1000ml,配成溶液代替。
对照用菌液
1.金黄色葡萄球菌（Staphylococcus
aureus）菌液
取金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]的营养琼脂斜面新鲜培养物1白金耳，接种至需气菌、厌气菌培养基内,在30～35℃培养16～18小时后，用0.9％灭菌氯化钠溶液稀释成1:10<6>。
2.生孢梭菌（Clostridium sporogenes）菌液
取生孢梭菌[CMCC(B)64941]的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物1白金耳,再接种至相同培养基内，在30～35℃培养18～24小时，用0.9％灭菌氯化钠溶液稀释至1:10<6>。
3.白色念珠菌（Candida albicans）菌液
取白色念珠菌[CMCC(F)98001]的霉菌琼脂培养基斜面新鲜培养物1白金耳,接种至霉菌培养基内，在20～25℃培养24小时后，用0.9％灭菌氯化钠溶液稀释至1:10<5>。
检查法
1. 直接接种法
(1) 供试品如为注射液、供角膜创伤及手术用的滴眼剂或灭菌溶液, 任取供试品2支（瓶）以上，用适当消毒液清洁供试品容器的外表面后,以无菌操作吸取规定接种量的供试品溶液，分别接种于需气菌、厌气菌培养基5管，其中1管接种对照用菌液1ml，供作阳性对照；取1支需气菌、厌气菌培养基管作阴性对照, 另接种于霉菌培养基2管，供试品溶液的每管接种量与培养基的分装量，应根据供试品的装量,按下列规定取用：
供试品装量
每管接种量
培养基分装量
2ml或2ml以下
0.5ml
15ml
2ml以上至20ml
1.0ml
15ml
20ml以上
5.0ml
40ml
接种后轻轻摇动,使匀。需气菌、厌气菌培养基在30～35℃培养5日, 霉菌培养基在20～25℃培养7日，抗生素类药品均培养7日，放射性药品培养5～7日。培养期间应逐日检查是否有菌生长（阳性对照在24小时内应有细菌生长）；如在加入供试品溶液后，培养基出现浑浊或沉淀，经培养后不能从外观上判断时,可取该培养液转种入另1支相同的培养基中或斜面培养基上，培养48～72小时后，观察是否再现浑浊或在斜面上有无菌落生长，并在转种的同时，取培养液少量，涂片制成染色标本，用显微镜观察是否有菌生长。
(2) 供试品如为注射用灭菌粉末或无菌冻干品，照该药品项下的规定或按该药品剂量项下的溶剂用量，加入灭菌水或0.9％灭菌氯化钠溶液,使内容物溶解成均匀的供试品溶液，取规定接种量的供试品溶液，接种于上述培养基中。
(3) 供试品如为供直接分装成注射用无菌粉末的原料药，按各该药品项下的规定制成溶液，依法接种于培养基中。
(4) 供试品如为外科敷料，取供试品2个包装，以无菌操作拆开包装,于不同部位剪取约1cm×3cm的样品，分别接种于40ml培养基中。
(5) 供试品如有抑菌作用或含有抑菌物质时，可选用适宜的培养基，或种入较大量的培养基中，使该供试品稀释至不具有抑菌使用的浓度；或照下述“薄膜过滤法”处理并接种于培养基中。
(6) 供试品如为抗生素药品,取该品种正文中最大规格量的供试品不少于2瓶(支)。原料药按制剂规格项下,取最大规格量2份，分别加入足够使青霉素灭活的无菌青霉素酶溶液适量，摇匀，分别等量接种于每管装量为40ml的培养基中。
(7) 供试品如为放射性药品，取供试品1瓶(支)，以每管接种量为0.2ml，接种于每管装量为7.5ml的培养基中。
2. 薄膜过滤法
(1)供试品如为抗生素药品，取该品种正文中最大规格量的供试品不少于2瓶(支)。原料药按制剂规格项下取最大规格量2份, 分别按该药品项下规定的方法处理后, 加入0.9％灭菌氯化钠溶液至少100ml或其他适宜的溶剂中, 摇匀, 以无菌操作加入装有直径约50mm、孔径不大于0.45±0.02μm微孔滤膜的薄膜过滤器内,减压抽干后,用0.9％灭菌氯化钠溶液或其他适宜的溶剂冲洗滤膜3次,每次至少100ml；取出滤膜,分成4片, 取3片分别放在3管各40ml需气菌、厌气菌培养基中, 其中1管接种对照用菌液1ml,供作阳性对照, 另1片放在霉菌培养基管中。取1支需气菌、厌气菌培养基管作阴性对照。

(2) 供试品如为抗厌氧菌药品，取规定量的供试品，按上述方法经薄膜过滤器处理后，取出滤膜，分成4片，其中3片放在3管需气菌、厌气菌培养基管中，1管接种生孢梭菌对照用菌液1ml，供作阳性对照。另1片放在霉菌培养基管中。 取1支需气菌、厌气菌培养基管作阴性对照。
(3) 供试品如为抗真菌药品，取规定量的供试品,按上述方法经薄膜过滤器处理后,取出滤膜,分成4片，取2片分别放在2管需气菌、厌气菌培养基管中；2片分别放在2管霉菌培养基管中,其中1管接种白色念珠菌对照用菌液1ml，供作阳性对照。取1支需气菌、厌气菌培养基管作阴性对照。
结果判断
当阳性对照管显浑浊并确有细菌生长，阴性对照管阴性时,可根据观察所得的结果判定：如需气菌、厌气菌及霉菌培养管均为澄清或虽显浑浊但经证明并非有菌生长,均应判为供试品合格；如需气菌、厌气菌及霉菌培养管中任何1管显浑浊并确证为有菌生长，应重新取样，分别依法倍量复试，除阳性对照管外，其他各管均不得有菌生长，否则应判为供试品不合格。

㈨ 医用刀片如何采用薄膜过滤法过滤进行无菌检查

1、灭菌
培养基灭菌主要两种高压除菌及0.22um微孔滤膜滤除菌与滤相比高压灭菌工作强度本较低易造营养流失且加（菌谷氨酰胺溶液菌碳酸氢钠溶液等）程容易造二污染数培养基采用0.1～0.2μm孔径微孔滤膜进行滤灭菌并且已培养基除菌发展向低限度减少培养基营养损失
1.1 高压灭菌

某些培养基（MEM）进行高压灭菌例清MEM培养基MD605、MD609等类培养基般含L-谷氨酰胺碳酸氢钠般培养基高压灭菌加入L-谷氨酰胺碳酸氢钠菌液体另外高压谷氨酸盐（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）代替L-谷氨酰胺
高压灭菌培养基121℃、15psi15钟条件完全达灭菌效及营养损失需灭菌间延保证高压灭菌效灭菌设备验证关键
1.2 滤灭菌
供滤灭菌使用滤膜其材料polyethersulphone（PES）、尼龙、聚碳酸盐、醋酸纤维素、硝酸纤维素、PTFE、陶瓷等般情况采取压滤压滤较负压滤具流速高、滤快、易污染避免蛋白质产量气泡等优点般使用滤器参照各供应商产品说明书
目前数实验室制采用微孔滤膜滤器（Zeiss滤器）或立式微孔滤器（Millipore、Pall）除菌微孔滤膜滤器锈钢间夹放0.22um滤膜使用种滤器重要步骤安装滤膜及菌滤程使用Zeiss滤器先要用培养用水滤膜充润湿安装滤膜其放置层定性滤纸再固定消毒旋钮要扭太紧凡与空气接触部位都要包（用牛皮纸、纱布、纺布等）；高压灭菌菌环境立即旋钮扭紧滤除菌结束要打滤器检查滤膜否完整滤膜破裂需重新进行滤除菌程立式微孔滤器选用同微孔滤柱体积滤膜折叠膜面积显著增液体处理量且容易发堵塞现象

㈩ 中国药典无菌检查法的供试品处理及接种培养基

除另有规定外，按下列方法进行。 薄膜过滤法应优先采用封闭式薄膜过滤器，也可使用一般薄膜过滤器。无菌检查用的滤膜孔径应不大于0.45μm。直径约为50mm。根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。抗生素供试品应选择低吸附的滤器及滤膜。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。
水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量一般为100ml，总冲洗量不得超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。
水溶液供试品取规定量，直接过滤，或混合至含适量稀释液的无菌容器内，混匀，立即过滤。如供试品具有抑菌作用或含防腐剂，须用冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数一般不少于3次，所用的冲洗量、冲洗方法同方法验证试验。冲洗后，如用封闭式薄膜过滤器，分别将100ml硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基加入相应的滤筒内。如采用一般薄膜过滤器，取出滤膜，将其分成3等份，分别置于含50ml硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基容器中，其中一份做阳性对照用。
（注：《中国药典》2010版三部附录ⅩⅡA无菌检查法为“取规定量，每支（瓶）供试品装量为5ml及以下者，全部转移至含适宜稀释液100ml的无菌容器内，混匀，立即过滤。如供试品具有抑菌作用或含防腐剂，须用冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数一般不少于3次，所用的冲洗量、冲洗方法同方法验证试验。冲洗后，2个滤器中加入硫乙醇酸盐流体培养基各100ml，另一滤器中加入改良马丁培养基100ml。”）
可溶于水的固体制剂供试品取规定量，加适宜的稀释液溶解或按标签说明复溶，然后照水溶液供试品项下的方法操作。
（注：《中国药典》2010版三部附录ⅩⅡA无菌检查法为“水溶性固体供试品”）
β-内酰胺类抗生素供试品取规定量，按水溶液或固体制剂供试品的处理方法处理，立即过滤，用适宜的冲洗液冲洗滤膜。再用含适量β-内酰胺酶的冲洗液清除残留在滤筒、滤膜上的抗生素后接种培养基，必要时培养基中可加少量的β-内酰胺酶；或将滤膜直接接种至含适量β-内酰胺酶的培养基中。接种培养基照水溶液供试品项下的方法操作。
（注：此类供试品处理方法为《中国药典》2010版二部附录ⅩⅠH无菌检查法添加项目）
非水溶性制剂供试品取规定量，直接过滤；或混合溶于含聚山梨酯80或其他适宜乳化剂的稀释液中，充分混合，立即过滤。用含0.1～1%聚山梨酯80的冲洗液冲洗滤膜至少3次。滤膜于含或不含聚山梨酯80的培养基中培养。接种培养基照水溶液供试品项下的方法操作。
（注：《中国药典》2010版三部附录ⅩⅡA无菌检查法为“用含0.1～1%聚山梨酯80的冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数一般不少于3次。”）
可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和粘性油剂供试品取规定量，混合至适量的无菌十四烷酸异丙酯①中，剧烈振摇，使供试品充分溶解，如果需要可适当加热，但温度不得超过44℃，趁热迅速过滤。对仍然无法过滤的供试品，于含有适量的无菌十四烷酸异丙酯中的供试液中加入不少于100ml的稀释液，充分振摇萃取，静置，取下层水相作为供试液过滤。过滤后滤膜冲洗及接种培养基照非水溶性制剂供试品项下的方法操作。
注①：无菌十四烷酸异丙酯的制备 采用薄膜过滤法过滤除菌。选用孔径为0.22μm的脂溶性滤膜，在140℃干热灭菌2小时。
无菌气（喷）雾剂供试品取规定量，将各容器置至少－20℃的冰室冷冻约1小时。以无菌操作迅速在容器上端钻一小孔，释放抛射剂后再无菌开启容器，并将供试液转移至无菌容器中，然后照水溶液或非水溶性制剂供试品项下的方法操作。
装有药物的注射器供试品取规定量，排出注射器中的内容物置无菌容器中，若需要可吸入稀释液或标签所示的溶剂溶解，然后照水溶液或非水溶性制剂供试品项下的方法操作。同时应采用直接接种法进行包装中所配带的无菌针头的无菌检查。
（注：《中国药典》2010版三部附录ⅩⅡA无菌检查法为“取规定量，将注射器中的内容物（若需要可吸入稀释液或标签所示的溶剂溶解），直接过滤，或混合至含适量稀释液的无菌容器内，混匀，立即过滤。然后按水溶性供试品项下方法操作。”）
具有导管的医疗器具(输血、输液袋等)供试品取规定量，每个最小包装用50～100ml冲洗液分别冲洗内壁，收集冲洗液于无菌容器中，然后照水溶液供试品项下方法操作。同时应采用直接接种法进行包装中所配带的针头的无菌检查。
（注：此类供试品处理方法为《中国药典》2010版二部附录ⅩⅠH无菌检查法添加项目） 直接接种法即取规定量供试品分别接种至各含硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基的容器中。除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%，同时，硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml，改良马丁培养基每管装量不少于10ml。若供试品具有抑菌作用，可加入适量的无菌中和剂或灭火剂，或加大每个容器的培养基用量。供试品检查时培养基的用量和高度同方法验证试验。
（注：《中国药典》2010版三部附录ⅩⅡA无菌检查法为“直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品。取规定量供试品，等量分别接种至硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基中（2种培养基的接种支数或瓶数之比为2:1）。除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%，同时，硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml，改良马丁培养基每管装量不少于10ml。供试品检查时，培养基的用量和高度同方法验证试验。”）
混悬液等非澄清水溶液供试品取规定量，接种至各管培养基中。
固体制剂供试品取规定量直接接种至各管培养基中。或加入适宜的溶剂溶解，或按标签说明复溶后，取规定量接种至各管培养基中。
非水溶性制剂供试品取规定量，混合，加入适量的聚山梨酯80或其它适宜的乳化剂及稀释剂使其乳化，接种至各管培养基中。或直接接种至含聚山梨酯80或其它适宜乳化剂的各管培养基中。
敷料供试品取规定数量，以无菌操作拆开每个包装，于不同部位剪取约100mg或1cm×3cm的供试品，接种于各管足以浸没供试品的适量培养基中。
（注：此类供试品处理方法为《中国药典》2010版二部附录ⅩⅠH无菌检查法添加项目）
肠线、缝合线等供试品肠线、缝合线及其它一次性使用的医用材料按规定量取最小包装，无菌拆开包装，接种于各管足以浸没供试品的适量培养基中。
（注：此类供试品处理方法为《中国药典》2010版二部附录ⅩⅠH无菌检查法添加项目）
灭菌医用器具供试品取规定量，必要时应将其拆散或切成小碎段，接种于足以浸没供试品的适量培养基中。
（注：此类供试品处理方法为《中国药典》2010版二部附录ⅩⅠH无菌检查法添加项目）
放射性药品取供试品1瓶(支)，接种于装量为7.5ml的硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基中。每管接种量为0.2ml。
（注：此类供试品处理方法为《中国药典》2010版二部附录ⅩⅠH无菌检查法添加项目） 上述含培养基的容器按规定的温度培养14天。培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中，细菌培养2天，真菌培养3天，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。
（注：《中国药典》2010版三部附录ⅩⅡA无菌检查法为“将上述接种后的硫乙醇酸盐流体培养基平均分成两份，一份置30℃～35℃培养14天，另一份与接种后的改良马丁培养基置20℃～25℃培养14天，培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中及营养琼脂斜面和改良马丁琼脂斜面培养基上，细菌培养2天，真菌培养3天，观察接种的同种新鲜培养基及营养琼脂斜面和改良马丁琼脂斜面培养基上是否有菌生长；或取培养液（物）涂片，染色，镜检，判断是否有菌，必要时做菌种鉴定。） 阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。否则，试验无效。
若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定；若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。当符合下列至少一个条件时方可判试验结果无效：
⑴无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。
⑵回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。
⑶供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。
试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。