能不能在超滤柱进行酶切

1. 质粒抽提原理

实验原理
提取质粒DNA的方法有很多种，从提取产量上分可分为微量提取、中量提取、大量提取，从使用仪器上分可分为一般提取和试剂盒方法提取，从具体操作方法分可以分为碱裂解法、煮沸法、牙签法等，各种不同的方法各有其优缺点，根据不同的实验目的可以采用合适的提取方法。详细内容请参考《分子克隆实验指南》。另外，复旦大学生化与分子生物学实验室一篇文章，提供了质粒提取机理的详细解说。[1]

碱裂解法

人们使用碱与SDS裂解法从E. coli（大肠杆菌）中分离制备质粒DNA已有30多年的历史。将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。

尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。只要OH-处理的强度和时间不要太过，当pH值恢复到中性时，DNA双链就会再次形成。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包盖。当用K+取代Na+时，复合物会从溶液中有效地沉淀下来，离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。

在SDS存在的条件下，碱水解是一项非常灵活的技术，它对E. coli的所有菌株都适用，并且其细菌培养物的体积可以从1-500mL以上。

煮沸法

煮沸法是将细菌悬浮于含有Triton X-100和能消化细胞壁的溶菌酶的缓冲液中，然后加热到100℃使其裂解。加热除了破坏细菌外壁，还有助于解开DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体DNA变性。但是。闭环质粒DNA链彼此不会分离，这是因为它们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构。当温度下降后，闭环DNA的碱基又各就各位，形成超螺旋分子，离心除去变性的染色体DNA和蛋白质，就可从上清中回收质粒DNA。煮沸裂解法对于小于15kb的小质粒很有效，可用于提取步至lmL（小量制备），多至250mL（大量制备）菌液的质粒，并且对大多数的大肠杆菌菌株都适用。但对于那些经变性剂、溶菌酶及加热处理后能释放大量碳水化合物的大肠杆菌菌株，则不推荐使用该法。这是因为碳水化合物很难除去，会抑制限制酶和聚合酶活性。若碳水化合物的量很大，在CsCl-溴化乙锭梯度离心中会使超螺旋质粒DNA带变得模糊不清。大肠杆菌菌株HBl01及其衍生菌株（其中包括TGl）能产生大量的碳水化合物，不适于用煮沸法裂解。

质粒小提试剂盒

用于大肠杆菌中质粒DNA的小量提取，它结合了优化的碱裂解法，以及方便快捷的硅膜离心技术，具有高效，快捷的特点，能在30min内完成全部操作。利用试剂盒能从1-5mL过夜培养的大肠杆菌菌液中纯化得到10-40μg高质量的质粒DNA（OD260/OD280=1.7-1.9），此质粒DNA可直接用于DNA序列分析，各种酶促反应，PCR以及部分细胞系的转染等。

质粒抽提
质粒抽提

原理
其中用到三种溶液以及硅酸纤维膜（超滤柱）。 溶液Ⅰ：50 mM葡萄糖 / 25 mMTris-HCl/ 10 mMEDTA，pH 8.0；溶液Ⅱ：0.2 N NaOH / 1%SDS； 溶液Ⅲ：3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸/75%酒精。

溶液Ⅰ

葡萄糖是使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，其主要目的是为了螯合二价金属离子从而达到抑制DNase的活性；可添加RNase A消化RNA。

溶液Ⅱ

此步为碱处理。其中NaOH主要是为了溶解细胞，释放DNA，因为在强碱性的情况下，细胞膜发生了从双层膜结构向微囊结构的变化。SDS与NaOH联用，其目的是为了增强NaOH的强碱性，同时SDS作为阴离子表面活性剂破坏脂双层膜。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断也会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA会断裂。

溶液Ⅲ

溶液III的作用是沉淀蛋白和中和反应。其中醋酸钾是为了使钾离子置换SDS中的钠离子而形成了PDS，因为十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾 （potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是不溶水的，同时一个SDS分子平均结合两个氨基酸，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。2 M的醋酸是为了中和NaOH。基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100 kb大小的片断，就没有办法再被 PDS共沉淀了，所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。75%酒精主要是为了清洗盐份和抑制Dnase；同时溶液III的强酸性也是为了使DNA更好地结合在硅酸纤维膜上

质粒抽提步骤
Ⅰ.使用质粒提取试剂盒提取质粒时请参考具体试剂盒的操作说明。如Omega公司的E.Z.N.A.® Plasmid Mini Kit I, Q(capless) Spin（质粒提取盒）。

Ⅱ.碱裂解手提法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下：

1：接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2mlLB培养基。

2：37℃振荡培养过夜。

3：取1.5ml菌体于Ep管(离心管)，以4000rpm离心3min，弃上清液。

4：加0.lml溶液I（1%葡萄糖，50mM/LEDTApH8.0，25mM/LTris-HClpH8.0）充分混合。

5：加入0.2ml溶液II（0.2mM/LNaOH，1%SDS），轻轻翻转混匀，置于冰浴5min.

6：加入0.15m1预冷溶液III（5mol/LKAc，pH4.8），轻轻翻转混匀，置于冰浴5min.

7：以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管

8：加入等体积的异戊醇，混匀后静置10min.

9：以10，000rpm离心20min，弃上清。

10：用70%乙醇0.5ml洗涤一次，抽干所有液体。

11：待沉淀干燥后，溶于50ulTE缓冲液中（或60℃温育去离子水）

抽提窍门
1：加溶液II（裂解液）后，操作一定要温和，剧烈混合会导致基因组DNA污染。

2：洗脱时60℃温育（Ellution Buffer）洗脱缓冲液或去离子水效果更好。

3：若质粒提取含量低，可增加菌液样或换用ArtMedia Plasmid Culture，其比LB培养基质粒得量高

4：菌体应彻底悬浮 ， 如果没有彻底悬浮菌体，则残留的菌体团块在溶液 II 加入后，变成难以完全裂解的团块。这个团块在溶液 III 加入后，会有一部分蛋白质继续存在于溶液中，成为蛋白质残留的最大根源。

5：加入溶液 II 后，混匀，体系最好能立即变得清澈。体系如果变得清澈了，马上加入溶液 III 中和。

6：中和的操作 ，在 1.5ml 离心管中加入溶液 III 后，先颠倒两次，使管底朝上，用指头弹击管底数次，再颠倒混匀。效果非常好。

注意事项
降低RNA残留的方法

RNA 的去除，首先是使用 RNase 消化。在溶液 I 中加入高浓度的 RNase A (100ug/ml)，或者用含 25ug RNase A/ml TE 溶解抽提好的质粒，都可以降低 RNA 残留，但都不能彻底去除。幸运的是，RNA 的残留并不影响酶切等最常用的用途。如果想彻底去除 RNA 残留，可以用试剂盒，或者使用对 4 个碱基都作用的 RNase。

降低gDNA残留的方法

gDNA 的残留问题，必须在抽提过程中解决，否则，就只能用胶回收方法处理了。gDNA 越大，越难于复性，也就越容易被去除；所以，一定要尽可能不打断 gDNA。裂解体系越粘稠，gDNA 越容易被扯断；操作手法越重，gDNA 也越容易被打断。温和操作，使用相对过剩的试剂，是降低 gDNA 残留的最好方法。

降低蛋白质残留的方法

蛋白质的去除，主要是靠不溶解的 K-SDS-蛋白质复合物的形成。虽然将中和后的体系置于 4C 一段时间，可以形成更多的该不溶复合物，从而使蛋白质残留更少，但实践证明这样做并不是必须的，除非是大量抽提。只要加入溶液 I 后的悬浮，加入溶液 II 后的裂解及加入溶液 III 后的中和是均匀彻底的，蛋白质的残留就应该在可以满足实验要求的水平；而只有溶液的用量足够，甚至过剩，才能确保裂解和中和是彻底的。当然，试剂盒及苯酚的使用，是可以更进一步降低蛋白质的残留的。

降低质粒Nick的方法

细菌收获时间，菌株的选择，抽提操作的剧烈程度是影响 Nick 的三个主要因素。细菌收获过早，质粒还在复制过程中，Nick 的比例较高；过晚，细菌开始死亡，杂质会比较多。如果使用胞内酶含量很高的宿主菌，会出现较高比例的 Nick。加入溶液 II 及加入溶液 III 的混匀操作，也可以导致一些 Nick，但影响不会比前两者大。

降低变性超螺旋的方法

理论上，用碱裂解法抽提质粒，变性超螺旋的出现是不可避免的。之所以大家没有非常在意，一是因为它的存在似乎对酶反应没有任何影响，二是因为它的含量并不一定高到被用电泳观察到。抽提使用相对过剩的溶液，在加入溶液 II 后，体系能在 1 分钟内变澄清，再快速加入溶液 III，这样基本上能将变性超螺旋的出现控制在电泳看不见的水平。 (变性超螺旋电泳时比正常超螺旋跑得快一点点。)

关于质粒多聚体

QIAGEN 提供了一个没有进一步解释的观察：从有些宿主菌中抽提质粒 (pTZ19)，电泳能发现很多条带；但使用单酶切后，仍然变成一条带，大小正好是线性单质粒的大小。根据这一观察，可以推理如下：那些大的条带(质粒多聚体)是由完整的单质粒“粘”在一起形成的，而不是我的一条链与你的一条链复性在一起；第二，这种“粘”只是部分的，否则酶切会有问题；第三，这种“粘”是脆弱的，线性后的刚性足以打破它。如果是这样，质粒多聚体的出现与质粒的结构及序列有关，可以不管它(也管不了)，因为它不影响酶切，或者说，即使质粒多聚体切不动，也不会影响太大。总之，碰到这种情况，不要简单地认为有问题，而是应该一步一步往下做，但一定要做完一步，检测一次，看一看结果与预期的吻合程度。

提高得率的方法

利用氯霉素抑制染色体的复制，而不抑制质粒的复制这一特点，在低拷贝质粒（如pUC19）的培养过程中添加氯霉素可以大大提高得率。

2. 蛋白质药物的分离纯化方法

蛋白质组 蛋白质组(Proteome)的概念最先由Marc Wilkins提出，指由一个基因组(genOME)，或一个细胞、组织表达的所有蛋白质(PROTein). 蛋白质组的概念与基因组的概念有许多差别，它随着组织、甚至环境状态的不同而改变. 在转录时，一个基因可以多种mRNA形式剪接，并且，同一蛋白可能以许多形式进行翻译后的修饰. 故一个蛋白质组不是一个基因组的直接产物，蛋白质组中蛋白质的数目有时可以超过基因组的数目. 蛋白质组学(Proteomics)处于早期“发育”状态，这个领域的专家否认它是单纯的方法学，就像基因组学一样，不是一个封闭的、概念化的稳定的知识体系，而是一个领域. 蛋白质组学集中于动态描述基因调节，对基因表达的蛋白质水平进行定量的测定，鉴定疾病、药物对生命过程的影响，以及解释基因表达调控的机制. 作为一门科学，蛋白质组研究并非从零开始，它是已有20多年历史的蛋白质(多肽)谱和基因产物图谱技术的一种延伸. 多肽图谱依靠双向电泳(Two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)和进一步的图象分析；而基因产物图谱依靠多种分离后的分析，如质谱技术、氨基酸组分分析等.
[编辑本段]蛋白质组学的研究内容
主要有两方面，一是结构蛋白质组学，二是功能蛋白质组学。其研究前沿大致分为三个方面：
① 针对有关基因组或转录组数据库的生物体或组织细胞，建立其蛋白质组或亚蛋白质组及其蛋白质组连锁群，即组成性蛋白质组学。
② 以重要生命过程或人类重大疾病为对象，进行重要生理病理体系或过程的局部蛋白质组或比较蛋白质组学。
③ 通过多种先进技术研究蛋白质之间的相互作用，绘制某个体系的蛋白，即相互作用蛋白质组学，又称为“细胞图谱”蛋白质组学。
此外，随着蛋白质组学研究的深入，又出现了一些新的研究方向，如亚细胞蛋白质组学、定量蛋白质组学等。
[编辑本段]蛋白质组学研究中的主要技术
1 双向凝胶电泳技术(2-DE)
双向凝胶电泳技术与质谱技术是目前应用最为广泛的研究蛋白质组学的方法。双向凝胶电泳技术利用蛋白质的等电点和分子量差别将各种蛋白质区分开来。虽然二维凝胶电泳难以辨别低丰度蛋白，对操作要求也较高，但其通量高、分辨率和重复性好以及可与质谱联用的特点，使其成为目前最流行、可靠的蛋白质组研究手段。双向凝胶电泳技术及质谱基础的蛋白质组学研究程序为样品制备→等电聚焦→聚丙烯酰胺凝胶电泳→凝胶染色→挖取感兴趣的蛋白质点→胶内酶切→质谱分析确定肽指纹图谱或部分氨基酸序列→利用数据库确定蛋白。蛋白质组研究要求有高分辨率的蛋白质分离及准确、灵敏的质谱鉴定技术。凝胶电泳中蛋白质的着色不仅影响蛋白质分离的分辨率，同时也影响后续的质谱鉴定。蛋白质的染色可分为有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色四类。
Unlu 等提出了一种荧光差异显示双向电泳(F-2D-DIGE)的定量蛋白质组学分析方法。差异凝胶电泳(DIGE)是对2-DE 在技术上的改进，结合了多重荧光分析的方法，在同一块胶上共同分离多个分别由不同荧光标记的样品，并第一次引入了内标的概念。两种样品中的蛋白质采用不同的荧光标记后混合，进行2-DE，用来检测蛋白质在两种样品中表达情况，极大地提高了结果的准确性、可靠性和可重复性。在DIGE技术中，每个蛋白点都有它自己的内标，并且软件可全自动根据每个蛋白点的内标对其表达量进行校准，保证所检测到的蛋白丰度变化是真实的。DIGE 技术已经在各种样品中得到应用。
2 高效液相色谱技术(HPLC)
尽管二维凝胶电泳（2-DE）是目前常用的对全蛋白组的分析方法，但其存在分离能力有限、存在歧视效应、操作程序复杂等缺陷。对于分析动态范围大、低丰度以及疏水性蛋白质的研究往往很难得到满意的结果。Chong 等使用HPLC/ 质谱比较分析恶性肿瘤前和癌症两种蛋白质差异表达。利用HPLC 分离蛋白质，并用MALDI-TOF-MS 鉴定收集的组分，从而在两种细胞中的差异表达中对蛋白质进行定量分析。多维液相色谱作为一种新型分离技术，不存在相对分子质量和等电点的限制，通过不同模式的组合，消除了二维凝胶电泳的歧视效应，具有峰容量高、便于自动化等特点。二维离子交换- 反相色谱(2D-IEC-RPLC)是蛋白质组学研究中最常用的多维液相色谱分离系统。

3. 蛋白质层析、超滤常用技术手段

在分离分析特别是蛋白质分离分析中，层析是相当重要、且相当常见的一种技术，其原理较为复杂，对人员的要求相对较高，这里只能做一个相对简单的介绍。
一、 吸附层析
1、 吸附柱层析
吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。
2、 薄层层析
薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。
3、 聚酰胺薄膜层析
聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达到分离目的。
二、 离子交换层析
离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。`
三、 凝胶过滤
凝胶过滤又叫分子筛层析，其原因是凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。
四、 亲和层析
亲和层析的原理与众所周知的抗原一抗体、激素一受体和酶一底物等特异性反应的机理相类似，每对反应物之间都有一定的亲和力。正如在酶与底物的反应中，特异的废物(S')才能和一定的酶(E)结合，产生复合物(E－S')一样。在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力，并产生复合物。而亲和层析与酶一底物反应不同的是，前者进行反应时，配体(类似底物)是固相存在；后者进行反应时，底物呈液相存在。实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L(对酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等)以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M(如活化琼脂糖等)上，制成亲和吸附剂M－L，或者叫做固相载体。而固化后的配体仍保持束缚特异物质的能力。因此，当把围相载体装人小层析柱(几毫升到几十毫升床体积)后，让欲分离的样品液通过该柱。这时样品中对配体有亲和力的物质S就可借助静电引力、范德瓦尔力，以及结构互补效应等作用吸附到固相载体上，而无亲和力或非特异吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出来，并形成了第一个层析峰。然后，恰当地改变起始缓冲 液的PH值、或增加离子强度、或加人抑③剂等因子，即可把物质S从固相载体上解离下来，并形成了第M个层析峰(见图6－2)。显然，通过这一操作程序就可把有效成分与杂质满意地分离开。如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲和力(其大小有差异)时，采用选择性缓冲液进行洗脱，也可以将它们分离开。用过的固相载体经再生处理后，可以重复使用。
上面介绍的亲和层析法亦称特异性配体亲和层析法。除此之外，还有一种亲和层析法叫通用性配体亲和层析法。这两种亲和层析法相比，前者的配体一般为复杂的生命大分子物质(如抗体、受体和酶的类似底物等)，它具有较强的吸附选择性和较大的结合力。而后者的配体则一般为简单的小分子物质(如金属、染料，以及氨基酸等)，它成本低廉、具有较高的吸附容量，通过改善吸附和脱附条件可提高层析的分辨率。
五、 聚焦层析
聚焦层析也是一种柱层析。因此，它和另外的层析一样，照例具有流动相，其流动相为多缓冲剂，固定相为多缓冲交换剂。
聚焦层析原理可以从PH梯度溶液的形成、蛋白质的行为和聚焦效应三方面来阐述。
1、PH梯度溶液的形成
在离子交换层析中，PH梯度溶液的形成是靠梯度混合仪实现的。例如，当使用阴离子 剂进行层析时，制备PH由高到低呈线性变化的梯度溶液的方法是，在梯度仪的混合室(这层析柱者)中装高PH溶液，而在另一室装低PH极限溶液，然后打开层析柱的下端出口，让洗脱液连续不断地流过柱体。这时从柱的上部到下部溶液的PH值是由高到低变化的。而在聚焦层析中，当洗脱液流进多缓冲交换剂时，由于交换剂带具有缓冲能力的电荷基团，故PH梯度溶液可以自动形成。例如，当柱中装阴离子交换剂PBE94(作固定相)时，先用起始缓冲液(配方见表了一2)平衡到PHg，再用含PH6的多缓冲剂物质(作流动相)的淋洗液通过柱体，这时多缓冲剂中酸性最强的组分与碱性阴离子交换对结合发生中和作用。随着淋洗液的不断加人，住内每点的PH值从高到低逐渐下降。照此处理J段时间，从层析柱顶部到底部就形成了PH6～9的梯度。聚焦层析柱中的PH梯度溶液是在淋洗过程中自动形成的，但是随着淋洗的进行，PH梯度会逐渐向下迁移，从底部流出液的PH却由9逐渐降至6，并最后恒定于此值，这时层析柱的PH梯度也就消失了。
2．蛋白质的行为
蛋白质所带电荷取决于它的等电点(PI)和层析柱中的PH值。当柱中的PH低于蛋白质的PI时，蛋白质带正电荷，且不与阴离于交换剂结合。而随着洗脱剂向前移动，固定相中的PH值是随着淋洗时间延长而变化的。当蛋白质移动至环境PH高于其PI时，蛋白质由带正电行变为带负电荷，并与阴离子交换剂结合。由于洗脱剂的通过，蛋白质周围的环境PH 再次低于PI时，它又带正电荷，并从交换剂解吸下来。随着洗脱液向柱底的迁移，上述过程将反复进行，于是各种蛋白质就在各自的等电点被洗下来，从而达到了分离的目的。
不同蛋白质具有不同的等电点，它们在被离子交换剂结合以前，移动之距离是不同的，洗脱出来的先后次序是按等电点排列的。

供静脉注射的25%人胎盘血白蛋白（即胎白）通常是用硫酸铵盐析法、透析脱盐、真空浓缩等工艺制备的，该工艺流程硫酸铵耗量大，能源消耗多，操作时间长，透析过程易产生污染。改用超滤工艺后，平均回收率可达97.18%；吸附损失为1.69%；透过损失为1.23%；截留率为98.77%。大幅度提高了白蛋白的产量和质量，每年可节省硫酸铵6.2吨，自来水16000吨。目前国外生产超滤膜和超滤装置最有名的厂家是美国的Milipore公司和德国的Sartorius公司。
随着现代生物技术的发展, 通过基因工程生产蛋白质药物在治疗人类面临的重大疾病如癌症等方面展示出巨大的潜力. 为满足生物技术产品工业化生产的需要, 开发高通量、低成本、高效的分离纯化方法已引起人们的高度关注. 超滤技术由于具有通量高, 操作条件温和, 易于放大等特点, 特别适合生物活性大分子的分离. 在生物技术领域, 超滤技术目前已广泛应用于细胞收集分离、除菌消毒、缓冲液置换、分级( fract ionatio n) 、脱盐及浓缩[ 1] . 近年来越来越多的研究表明, 通过选择适当的膜或膜表面改性,以及对分离过程进行优化, 充分利用和调控膜—蛋白质以及蛋白质—蛋白质之间的静电相互作用, 可以实现分子量相近的两种蛋白质的高选择性超滤分离[2- 7] .

为克服常规蛋白质超滤分离过程优化中存在的实验蛋白质消耗多、工作量大、费时以及费用高等缺点, 我们相继开发了脉冲进样技术( Pulsed sampleinject ion technique ) [8]和参数连续变化超滤技术( Parameter scanning ultraf ilt ration) [9]. 并以此为基础, 结合载体相超滤技术( Carrier phase ult rafil—t rat ion) [10]进一步提出了一种蛋白质超滤分离快速优化新方法[11], 实现了人血浆白蛋白—免疫球蛋白[12]、人源化单克隆抗体( A lemtuzumab) 单体— 二聚体[13]的超滤分离过程快速优化和高选择性分离,并在膜的筛选及其适用性快速评估方面展现出巨大的潜力. 该方法的主要特征是与AKTA Prime 系统联用, 采用脉动进样技术显著减少了蛋白质的用量;而利用双缓冲体系( 类似梯度洗脱) 的参数连续变化超滤技术, 在pH 或离子强度连续变化的情况下考查pH 或离子强度对蛋白质透过率或截留率的影响, 进一步缩短了实验时间, 降低了蛋白质的用量,极大地减少了实验量, 加快了过程优化进程; 另外,载体相超滤技术的应用则可保证超滤分离自始至终在设定的条件下进行, 从而最大限度地保证超滤过程的稳定性.

4. 样本前处理（三）

蛋白提取的质量控制

我们通过上一篇笔记里介绍的各种方法把蛋白质提取出来以后，这事儿还没完，因为我们需要对提取出来的蛋白进行一下质控，以确认是否成功提取出了足够的蛋白，是否有污染等。

如上图，质量控制分两个部分：

含量测定 ：检测是否有充足的蛋白被提取出。注意上图里提到的不兼容问题，如果你样品里加过SDS，就不要用Bradford法来测定蛋白浓度，而可以选用BCA方法；反之，如果你样品里加入了还原剂，就不要用BCA方法来测定蛋白，可以选用Bradford法。

SDS-PAGE ：检测蛋白的提取效率，以及是否有污染。比如我们上了50个样，能看到的条带却很少，说明定量不准确。如果想从几组样品中寻找差异蛋白，特别需要做一次SDS-PAGE检测同类样品蛋白的提取效率。

以上图为例，0号样品中间的条带不见了，可能是提取蛋白不充分引起的差异，也可能是样品本身的差异。我们可以重新提取一次，先排除是否是提取造成的差异；如果是样品本身的差异，建议用label free的方法，每个样品单独做定量，而不要用iTRAQ或TMT标记定量，否则会因为中间这个高丰度蛋白的影响，而导致定量不准。

我们再看来几种常见的问题，以及解决方法，如下图：

情况1：提取出来的结果差异很大。这种情况需要重新提取，以检测到底是提取不充分造成的差异，还是样品本身的差异；

情况2：左边是分子量marker,右边是实际样品，可以看到实际样品的条带很少，可能是提取不充分，需要重设提取参数，使用更剧烈的条件，更长的时间，重新提取；

情况3：横纹、纵纹比较多，很可能是核酸或脂蛋白的影响，这种情况需要进行脱盐处理，也就是利用脱盐柱与肽段结合，而与其它物质不结合，从而达到去除污染的目的。

情况4：两个条带很类似，但一条明显比另一条淡。可能造成这种情况的原因有哪些呢？第一种情况，由于这是同样类型的样品，比如都是小鼠肌肉组织，一个样品的蛋白质抽提充分，而另外一个样品蛋白抽提不充分，就会导致两条带不一样，这种情况下需要重新抽提。还有一种可能，考虑到是等量上样跑的SDS-PAGE，如果两个条带显示出的蛋白含量差别很大，则可能因为参考的含量测定结果不准确引起的，这时候需要重新定量。

脱盐

蛋白提取后，还需要做脱盐处理，我们来看看可以用哪些方法实现。

超滤： 可以截留10kDa及以上的蛋白分子，适用于体积较小的样品。操作步骤可以是，从100μL超滤浓缩到40μL，再加缓冲液至100μL，再超滤到40μL，反复几次。事实上，超滤是很难把污染（比如SDS）完全去掉的，最终仍然会有极少量的污染物存在，但当这些污染物的浓度降到一定程度时，则样品的纯净度我们认为是可以接受的了。

Tips :

样品中的尿素浓度需要控制在1M以下才能不对样品造成影响，我们提取蛋白时使用的是8M尿素，直接稀释8倍的话，造成样品体积太大，下一步加入酶后，则酶和蛋白的浓度会特别低，酶解效果受到很大影响。另外，体积太大处理起来也不方便。这时也可以使用超滤的方法，多步稀释，将尿素的浓度降到1M以下。

透析 ：也是可以截留10kDa及以上的蛋白分子，适用于体积比较大的样品，比如尿液，可以将盐透析至外面的透析液里。

丙醇沉淀 ：-20℃丙酮（V样品：V冷丙酮=1：3以上）沉淀2个小时以上。

C18色谱柱脱盐法 ：Waters公司生产的XBridge C18色谱柱，利用柱子上的填料与蛋白结合，而盐类物质则流穿过去，从而达到分离的目的。

还原烷基化及酶解

脱盐完成以后，接下来我们就要进行相当重要的一步：还原烷基化及酶解。整个流程，大伙儿看下面这张图：

这里面有两件事要先跟大伙儿聊聊。

首先，我们来说说为什么步骤里要把丙酮沉淀放在烷基化以后。通过之前的学习，我们知道丙酮可以溶解样品的去污剂、还原剂等，而蛋白是不会在丙酮中溶解的，而是会沉淀下来，这样就达到了去除杂质的目的。

烷基化以后，球状蛋白变成链状，再通过丙酮沉淀去掉尿素或SDS等污染物，然后复溶（即重新溶解，以备下一步酶解操作），那么链状的蛋白比球状蛋白的复溶效果会更好，可以避免因为复溶不充分而造成的损失。因此，丙酮沉淀要放在烷基化之后再做。

另外，关于酶切这一步，有些抗体如果只用胰酶进行酶切，由于酶切位点太少，导致切出来的肽段太长，不便于质谱检测。这种情况下可以结合其它酶，比如Lys-C，进行多酶酶切，使肽段变得短一些。经过测试我们发现，用Lys-C+胰酶酶切，比只用胰酶酶切，可以提高10%-20%的鉴定率。

酶解需要在buffer体系下完成，比如25mM碳酸氢铵体系（易挥发，pH 7-8）最为常用，或者也可以使用TEAB（ triethyl ammonium bicarbonate，三乙基二乙胺盐，10-100mM）。

Tips :

如果做iTRAQ（或TMT）标记，最好用TEAB，而不是碳酸氢铵体系。因为iTRAQ（或TMT）试剂是标记末端氨基，碳酸氢铵上的氨基也会被标记上，影响蛋白的标记效率。

酶的用量可以参考以下的公式：

W（酶）：W（底物）=1:20 – 1:50

此外，需要注意的是胰酶酶解的兼容性问题。胰酶只能耐受最多1M的尿素，且不能与SDS同时使用。

蛋白质及肽段的预分级

前面提过，质谱仪是一种离子饱和性仪器，高丰度蛋白的存在会对低丰度蛋白的信号产生抑制，并且质谱仪反应也需要一定的时间。例如，人的细胞内通常会表达20300种蛋白，它们酶解后，每种蛋白会产生10-20种肽段，那么就有几十万种肽段，质谱很难同时检测到这么多种肽段。所以对肽段混合物进行分级，可以降低检测的难度，得到更多的肽段/蛋白鉴定结果。

我们既可以从蛋白水平进行分离，也可以从肽段水平进行分离，还可以将多种分离手段结合起来。从蛋白水平的分离，大家都比较熟悉吧？通常我们用SDS-PAGE或IEF等技术，利用蛋白质的分子量、形状、等电点等理化性质的不同，将混合在一起的蛋白质分开。

第二种分离方案是在肽段水平上进行，根据肽段的不同性质，使用不同填料进行分离。

SCX（Strong Cation Exchange）：是以硅胶为基质的强阳离子交换柱，可以与阳离子结合，并通过buffer进行离子交换，将阳离子分离和洗脱出来，达到与其它不带阳离子的肽段分离的目的。

SAX（Strong Anion Exchange）：硅胶键合季铵基团的强阴离子交换柱，可以与阴离子结合，并通过buffer进行离子交换，将阴离子分离和洗脱出来，达到与其它不带阴离子的肽段分离的目的。

RPLC（Reverse Phase Liquid Chromatography）：反相液相色谱柱，与正相柱在表面键合极性官能团不同，反相柱的表面键合的是非极性的官能团，例如，键合十八烷基官能团，称为C18柱，其它常用的还有C8，C4和C2等。这里我们选用C18柱，根据肽段疏水性的不同，达到分离的目的。

HILIC（Hydrophilic interaction liquid chromatography ）：亲水色谱柱可以用来分离极性化合物。由于强极性肽段在反相色谱柱中保留情况都比较差，很难将它们分开，而亲水色谱柱却可以用来固定强极性的肽段，并结合高比例有机相与低比例水相组成的流动相，来实现分离的目的，且这样的流动相组成尤其有利于提高电喷雾离子化质谱（ESI-MS）的灵敏度。

High pH - Low pH RPLC：用pH10的液相条件，结合pH2的RPLC酸性条件，进行分离。

Tips :

通常，我们通过RPLC与质谱联用。因为RPLC体系是用水和乙腈，易挥发，不含盐，可以直接送入质谱进行检测。而像SCX/SAX这类正相柱，需要通过高盐的体系将样品洗脱下来，所以它与质谱不兼容。我们在做多级分离时，前面都会有各种盐的洗脱，最后才是RPLC，然后就可以直接连质谱了。

多维分离：例如，先从蛋白水平进行分离，再从肽段水平进行分离，或者多种肽段水平的分级分离结合起来使用。接下来我们重点聊一下各种多维分离的策略和效果。

我们先来看看上面这张图。左上角的“A图“展示的是通过High pH - Low pH RPLC将样品分成了40个馏分，然后进行叉开的合并，合并为20个馏分，这样的合并可以让样品中的肽段分布更加均匀。

右上角的”B图”展示的是通过SDS-PAGE进行分离，也分成20个馏分，然后用两种合并方案，分别合并为5个馏分和6个馏分，这样做的目的也是为了让样品的肽段分布更加均匀。

左下角的“C图”针对同一种样品，对High/Low pH RPLC和SDS-PAGE两种分离策略进行了比较，发现经过两种分离方法后，有5408个蛋白是都可以鉴定到的，另外有1951种蛋白是只在High/Low pH RPLC分离策略中鉴定到的，而用SDS-PAGE分离，则可以鉴定到其它389种蛋白。从这个图上看，两种方法有互补性。

右下角的四幅小图说明，当我们在做分级分离时，分的级别越多，能鉴定到的蛋白也就越多。不过这种增长并不是呈线性关系的，分级的级数达到一定程度时，能鉴定到的蛋白数量的增长就会饱和。所以比较省时省力又能保证效果的做法时，选择一个合适的分级数即可。

我们来看一下目前发表的文献里，利用多级分离所能鉴定到的蛋白数量。

一篇2013年发表在MCP上的文献报道，采用RP-RPLC两级分离，分成常规的24个馏分，上样量为100μg，在一天内能检测到8000多个蛋白。

一篇2013年发表在Nat Comm上的文献报道，先采用RP柱分级，再使用SAX分离，然后通过1米的长柱子反相色谱分离。样品为人的胚胎干细胞，上样量仍然为100μg，在线分离8天检测了9818个蛋白，如果分离时间延长到24天，则可以检测13075个蛋白。

一篇2014年发表在Nat Method上的文献报道，采用IEF（等电聚焦电泳，isoelectric focusing）与RPLC结合，样品是人的上皮癌细胞，上样量为800μg，分成了360个馏分，耗时超过15天，一共分析到13078个蛋白。

就像前面说到的，对蛋白及多肽分离的级数越多，能鉴定到的蛋白也就越多，但常常因为机时的限制，再加上这种变化趋势到一定程度总会饱和，所以我们通常有个权衡。比如常规的分10个馏分，基本上可以鉴定到5000-8000个蛋白。如果是血清样品，可以馏分更多一些，尤其是RPLC一维，如果分到40或60个馏分，再合并为10或20个馏分，比直接分成10个或20个馏分能鉴定到的蛋白要多30%左右！

Tips :

对于分馏分，通常是利用C18的色谱柱来分级分馏分，这个没有试剂盒。

5. 超滤原理的超滤

⑴原理
超滤膜筛分过程，以膜两侧的压力差为驱动力，以超滤膜为过滤介质，在一定的压力下，当原液流过膜表面时，超滤膜表面密布的许多细小的微孔只允许水及小分子物质通过而成为透过液，而原液中体积大于膜表面微孔径的物质则被截留在膜的进液侧，成为浓缩液，因而实现对原液的净化、分离和浓缩的目的。
⑵超滤膜与超滤装置
①超滤膜的种类：
常用的超滤膜有：醋酸纤维素膜，聚砜膜，聚酰胺膜
②超滤装置：主要有板框式、管式、卷式和中空纤维式等，与反渗透装置类似。
Ⅰ板框式超滤装置
优点：装置牢固，适合在广泛的压力范围内工作；流道间隙大小可调，原水流道不易被杂物堵塞；具有可拆性，清洗方便；通过增减膜及支撑板的数量可处理不同水量。
缺点：装置较笨重；单位体积内的有效膜面积较小；膜的强度要求较高，一般做在无纺布上，以增强膜的机械性能。
Ⅱ管式超滤装置
优点：原液流道截留面积较大，不易堵塞；膜面的清洗比较容易，可化学清洗或擦洗。
缺点：单位体积内膜的充填密度较低，占地面积大；膜管的弯头及连接件多，设备安装费时。
Ⅲ卷式超滤装置
优点：单位体积内的有效膜面积较大，水在膜表面流动状态比较好，结构紧凑，占地面积较小。缺点：进水预处理要求严格，对所用的膜强度要求较高，使用过程中，一旦发现膜破损须更换新的膜元件。
Ⅳ中空纤维式超滤装置：
优点：单位体积内有效膜面积最大，工作效率最高，占地面积小。中空纤维无须支撑物。
缺点：膜的清洗较困难，只能用水力冲洗或化学清洗，不能用机械清洗，另外，中空纤维膜损坏后要更换整个组件。
③超滤工艺参数
主要参数有膜通量、膜清洗和膜寿命。
在操作压力为0.11～0.6Mpa，温度小于60℃时，超滤膜的膜通量以1～500L/m2h为宜。影响膜通量的因素有：进水流速、操作压力、温度、进水浓度和原水预处理等。
膜必须定期清洗，以延长膜的寿命，正常使用的膜的寿命为12～18个月。
④超滤在废水处理中的应用
如今已应用在汽车制造行业喷漆废水、金属加工废水以及食品工业废水的处理及有用物质的回收。
超滤原理也是一种膜分离过程原理，超滤利用一种压力活性膜，在外界推动力(压力)作用下截留水中胶体、颗粒和分子量相对较高的物质,而水和小的溶质颗粒透过膜的分离过程。通过膜表面的微孔筛选可截留分子量为3x10000—1x10000的物质。当被处理水借助于外界压力的作用以一定的流速通过膜表面时，水分子和分子量小于300—500的溶质透过膜，而大于膜孔的微粒、大分子等由于筛分作用被截留，从而使水得到净化。也就是说，当水通过超滤膜后，可将水中含有的大部分胶体硅除去，同时可去除大量的有机物等。
超滤原理并不复杂。在超滤过程中，由于被截留的杂质在膜表面上不断积累，会产生浓差极化现象，当膜面溶质浓度达到某一极限时即生成凝胶层，使膜的透水量急剧下降，这使得超滤的应用受到一定程度的限制。为此，需通过试验进行研究，以确定最佳的工艺和运行条件，最大限度地减轻浓差极化的影响，使超滤成为一种可靠的反渗透预处理方法。
a． 超滤与传统的预处理工艺相比，系统简单、操作方便、占地小、投资省、且水质极优，可满足各类反渗透装置的进水要求。
b． 合理地选择运行条件和清洗工艺，可完全控制超滤的浓差极化问题，使此预处理方法更可靠。
c．超滤对水中的各类胶体均具有良好的去除特性,因而可以考虑扩大到凝结水精处理及离子交换除盐系统的预处理中。
在超滤过程中，水深液在压力推动下，流经膜表面，小于膜孔的深剂（水）及小分子溶质透水膜，成为净化液（滤清液），比膜孔大的溶质及溶质集团被截留，随水流排出，成为深缩液。超滤过程为动态过滤，分离是在流动状态下完成的。溶质仅在膜表面有限沉积，超滤速率衰减到一定程度而趋于平衡，且通过清洗可以恢复。
超滤是以压力为推动力的膜分离技术之一。以大分子与小分子分离为目的，膜孔径在20－1000A°之间。中空纤维超滤器（膜）具有单位溶器内充填密度高，占地面积小等优点。
超滤技术的优缺点
与传统分离方法相比，超滤技术具有以下特点：
1. 滤过程是在常温下进行，条件温和无成分破坏，因而特别适宜对热敏感的物质，如药物、酶、果汁等的分离、分级、浓缩与富集。
2. 滤过程不发生相变化，无需加热，能耗低，无需添加化学试剂，无污染，是一种节能环保的分离技术。
3. 超滤技术分离效率高，对稀溶液中的微量成分的回收、低浓度溶液的浓缩均非常有效。
4. 超滤过程仅采用压力作为膜分离的动力，因此分离装置简单、流程短、操作简便、易于控制和维护。
5. 超滤法也有一定的局限性，它不能直接得到干粉制剂。对于蛋白质溶液，一般只能得到10～50%的浓度。
超滤装置是在一个密闭的容器中进行，以压缩空气为动力，推动容器内的活塞前进，使样液形成内压，容器底部设有坚固的膜板。小于膜板孔径直径的小分子，受压力的作用被挤出膜板外，大分子被截留在膜板之上。超滤开始时，由于溶质分子均匀地分布在溶液中，超滤的速度比较快。但是，随着小分子的不断排出，大分子被截留堆积在膜表面，浓度越来越高， 自下而上形成浓度梯度，这日才超滤速度就会逐渐减慢，这种现象称为浓度极化现象。为了克服浓度极化现象，增加流速，设计了几种超滤装置：
1. 无搅拌式超滤
这种装置比较简单，只是在密闭的容器中施加一定压力，使小分子和溶剂分子挤压出膜外，无搅拌装置浓度极化较为严重，只适合于浓度较稀的小量超滤。
2. 搅拌式超滤
搅拌式超滤是将超滤装置位于电磁搅拌器之上，超滤容器内放人一支磁棒。在超滤时向容器内施加压力的同时开动磁力搅拌器，小分子溶质和溶剂分子被排出膜外，大分子向滤膜表面堆积时，被电磁搅拌器分散到溶液中。这种方法不容易产生浓度极化现象，提高了超滤的速度。
4. 中空纤维超滤
由于膜板式超滤装置，截留面积有限，中空纤维超滤是在一支空心柱内装有许多的，中空纤维毛细管，两端相通，管的内径一般在0．2mm左右，有效面积可以达到1平方厘米每一根纤维毛细管像一个微型透析袋，极大地增大了渗透的表面积，提高了超滤的速度。纳米膜表超滤膜也是中空超滤膜的一种。

6. 如何对PCR扩增的产物进行酶切

1. 首先确认PCR产物，取一小部分PCR产物跑胶。
2. 如果产物良好，一个特异性很强的条带，则用过柱的方法提纯（就是你平时用的从溶液中纯化DNA的试剂盒就可以）。楼上说的跑胶后再提，早就过时了。效率很低。
3，提纯加入限制性内切酶缓冲液，酶。按照平时的方法反应就可以了。
4. 酶切后再过柱提纯就可以了。

7. sumo融合蛋白的纯化时挂在Ni亲和柱上时是不是就还可以加sumo蛋白酶酶切，还是必须洗下来以后才能酶切

不是绝对的，两种方法其实都差不多。
但是柱切和洗脱后酶切还是有不同的。
柱切内比较方便，酶切容之后直接收流穿的部分就是目的蛋白。缺点是在洗脱之前不知道蛋白产量，可能努力了半天什么都没有，而且有些蛋白不稳定，可能在柱切过程中沉淀在柱子上了。

洗脱后再切，比较直观的检测初步富集的蛋白量，再决定加多少酶，而且能直观的检测酶切效率，确定是酶切之后要多一个去标签的过程。

8. 提取酶的方法有哪些

酶是蛋白质，可以根据其特点选择适当的蛋白质提取纯化方法！

选择材料及预处理

以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、碱、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。

微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。

蛋白质的分离纯化

一，蛋白质（包括酶）的提取

大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。

（一）水溶液提取法

稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。
1、pH值
蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。
2、盐浓度
稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。

（二）有机溶剂提取法

一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。

二、蛋白质的分离纯化

蛋白质的分离纯化方法很多，主要有：

（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法

1、蛋白质的盐析
中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。
影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。
蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。 其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。
蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。

2、等电点沉淀法
蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。

3、低温有机溶剂沉淀法
用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。

（二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法

1、透析与超滤
透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。
超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。

2、凝胶过滤法
也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex ged）和琼脂糖凝胶（agarose gel）。

（三）根据蛋白质带电性质进行分离

蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。

1、电泳法
各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。

2、离子交换层析法
离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAE?FONT FACE="宋体" LANG="ZH-CN">纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。（详见层析技术章）

（四）根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法

亲和层析法（aflinity chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合。其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离（Separation），提纯（Purification）
和鉴定（Characterization）是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。

细胞的破碎

1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。

2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。

3、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。

4、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。

无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。

浓缩、干燥及保存

一、样品的浓缩

生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。常用的浓缩方法的：
1、减压加温蒸发浓缩
通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。
2、空气流动蒸发浓缩 空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外的溶剂不沁蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。
3、冰冻法 生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中，操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢地融解，利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时，不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质和酶的浓缩液。
4、吸收法 通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等，使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里，外加聚乙二醇复盖置于4度下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。
5、超滤法 超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，不液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻保留，这是近年来发展起来的新方法，最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活性，回收率高等优点。应用超滤法关键在于膜的选择，不同类型和规格的膜，水的流速，分子量截止值（即大体上能被膜保留分子最小分子量值）等参数均不同，必须根据工作需要来选用。另外，超滤装置形式，溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响。Diaflo 超滤膜的分子量截留值：

膜名称
分子量截留值
孔的大的平均直径

XM－300
300，000
140

XM－200
100，000
55

XM－50
50，000
30

PM－30
30，000
22

UM－20
20，000
18

PM－10
10，000
15

UM－2
1，000
12

UM05
500
10

用上面的超滤膜制成空心的纤维管，将很多根这样的管拢成一束，管的两端与低离子强度的缓冲液相连，使缓冲液不断地在管中流动。然后将纤维管浸入待透析的蛋白质溶液中。当缓冲液流过纤维管时，则小分子很易透过膜而扩散，大分子则不能。这就是纤维过滤秀析法，由于透析面积增大，因而使透析时间缩短10倍。

二、干燥

生物大分子制备得到产品，为防止变质，易于保存，常需要干燥处理，最常用的方法是冷冻干燥和真空干燥。真空干燥适用于不耐高温，易于氧化物质的干燥和保存，整个装置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外，同时增加了温度因素。在相同压力下，水蒸汽压随温度下降而下降，故在低温低压下，冰很易升华为气体。操作时一般先将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体，然后在低温低压下将溶剂变成气体而除去。此法干后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点，适用于各类生物大分子的干燥保存。

三、贮存

生物大分子的稳定性与保存方法的很大关系。干燥的制品一般比较稳定，在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化，贮藏要求简单，只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，保持0－4度冰箱即可，液态贮藏时应注意以下几点。
1、样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏，样品太稀易使生物大分子变性。
2、一般需加入防腐剂和稳定剂，常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白质和酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和辅酶以提高其稳定性。此外，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中。
3、贮藏温度要求低，大多数在0度左右冰箱保存，有的则要求更低，应视不同物质而定。