超滤洗咪唑

1. 说明为什么咪唑能在亲和层析中用来洗脱蛋白质

因为咪唑能竞争性的结合到柱子上，使带His标签的目的蛋白丧失了结合位点，从而被洗脱下来。

2. 蛋白质纯化技术的方法有哪几种

一、电泳：
在克隆基因表达产物的检测分析过程中，电泳是常用的方法，但在纯化蛋白时，通常都不采用电泳的方法。由于某些特殊的目的，需要用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化蛋白质，常用下述方法进行：①从电泳后的凝胶上切下所需的相应条带，将凝胶压碎，用缓冲液浸泡，使其中的蛋白质扩散出来，从而获得纯化的蛋白质。此法简单但回收率低。②将电泳后的凝胶用电洗脱的方法使蛋白质从凝胶转移到溶液中，从而达到纯化的目的。此法快速，回收率高，但需要特殊的电泳装置。
二、色谱法：
色谱法（chromatography）是蛋白纯化中最常用的一种方法，这种方法既可以制备大量的纯化蛋白质，又可以保持蛋白质的生物学活性。色谱的种类很多，可分为常规色谱和高效液相色谱（high-performance liquid chromatography,HPLC）。凝胶过滤色谱、离子交换色谱、亲和色谱等均为常规色谱法。HPLC包括反相高效液相色谱（reversed-phase HPLC,RP-HPLC）、离子交换高效液相色谱（ion exchange HPLC）等。根据目标蛋白性质的不同可选用相应的色谱分离技术纯化蛋白质。
1.凝胶过滤色谱法
凝胶过滤色谱法（gel-filtration chromatography, GFC）又称排阻色谱。凝胶是一类具有三维空间结构的多孔网状颗粒物质，如琼脂糖凝胶（sepharose）、葡聚糖凝胶（sephadex），将凝胶颗粒装入色谱柱中即可用于物质的分离。当被分离物质通过凝胶柱时，大于凝胶孔径的分子不能进入凝胶内部，只能在凝胶颗粒之间的空隙中流动和分配，流经的路途短，可很快被洗脱出来，而小于凝胶孔径的分子则进入凝胶颗粒内部，在凝胶内部穿行，流经的路程长，移动的速度慢，最后被洗脱出来；分别收集不同时相的洗脱液，即可得到纯化的物质。
GFC可在存在有多种离子、去污剂、尿素、盐酸胍、高或低离子强度、常温或低温等多种条件下进行，根据所分离物质的性质不同可选择相应的色谱条件，从而获得有生物学活性的纯化的生物大分子。
2.离子交换色谱法
离子交换色谱法（ion exchange chromatography,IEC）是根据物质的酸碱度、极性和分子大小的不同进行分离的技术，通常包括吸附、吸收、扩散、穿透、静电引力等复杂的物理化学过程。自然界的包括蛋白质在内的生物大分子都带有电荷，当所需分离的物质通过离子交换色谱柱时，由于所带电荷、分子量等不同，有些被固定相靠静电引力所吸附，未被吸附的物质可被缓冲液首先洗脱出来；被吸附的物质由于所带电荷多少不同，对固定相的亲和力大小也不同，可被梯度离子缓冲液先后洗脱下来，使同一溶液中的不同物质被分离。色谱柱中填充的阴离子交换剂可用于带正电荷物质的分离，而阳离子交换剂可用于带负电荷物质的分离。
3.亲和色谱法
许多生物大分子物质具有与其结构相对应的专一分子发生可逆性结合的特征，如酶与底物及辅助因子、酶与抑制剂、抗原与抗体、激素与受体、核酸片段与其互补的核酸序列、生物素与亲合素等，分子间的这种结合能力叫作亲和力。
亲和色谱（affinity chromatography）是利用生物大分子间所具有的特异性亲和能力进行分离的方法。该方法常把可亲和的一对分子中的一方固定在不溶于水的化合物上作为色谱的支持体即载体，使之固相化，作为固定相；另一方随流动相流经固定相，双方即可发生特异性结合；用流动相经过一段时间的洗涤，可将杂质去除，而后再利用亲和吸附的可逆特性，改用特殊的流动相使所需分离的物质被解离下来，从而得到纯化的物质。亲和色谱法中的载体种类很多，最常用的是琼脂糖凝胶（sepharose），其分子上有较多的羟基，活化后可与亲和分子相耦联，另外其理化性质稳定，不会影响色谱的分离过程。
亲和色谱法可在温和条件下操作，纯化过程简单、快速、分辨率高，对分离含量极少且性质不稳定的生物活性物质极为有效。但由于不是任何生物大分子之间均有特异的亲和力，而针对于某一种亲和分子就需要制备专一的亲和色谱柱，因此亲和色谱的应用具有一定的局限性，主要由于蛋白质尤其是酶、抗原、抗体的分离与纯化。

3. 可溶性表达的蛋白如何纯化纯化后如何除咪唑

1，破细胞，高速离心收上清收集上清（同时平衡好柱子）；
2，既然你是His-tag，用Ni-NTA之类的柱子，两次上柱，buffer平衡；
3，低浓度咪唑（5mM）洗5-10柱体积，以洗去杂蛋白；
4，过梯度咪唑（10-500MM），用紫外检测仪监测280nm，收下每个峰；
5，用峰液跑SDS-PAGE，看哪个峰的蛋白浓度和纯度最为理想；
6，脱咪唑以及换buffer、脱盐，有两种基本方法：A，透析（经济、简便）；B，用脱盐柱（需要有仪器及柱子，更简便更省时）。
关于您说的蛋白没有活性的问题，我建议您在脱咪唑之前，就用峰液去测活性（如果咪唑不影响活性的检测手段），一般来讲，咪唑不会对蛋白的活性有太大影响。如果脱咪唑之前就已经没有活性，那就不是脱咪唑的问题，而是要往前追溯问题。比如，有无移码、tag对蛋白性质影响如何、破细胞的方法是否影响蛋白等等。
对可溶性蛋白的表达及纯化，我有多年经验，若有疑问，欢迎继续讨论。

4. 浓度越大的咪唑蛋白洗脱越差是为什么

Ni柱中的氯化镍可以与有HIs（组蛋白）标签的蛋白结合，也可以与咪唑结合。
步骤是：过柱子前可以选择Ni柱重生，也就是往柱子里倒氯化镍，一个柱长体积就行了，然后平衡柱子，拿你自己的buffer，给蛋白提供最适的环境，我一般平衡4个柱长，然后蛋白上样，你可以让他自己挂，这样挂柱子的效果好一些，如果流速太慢，可以加个恒流泵，但是一定不能太快，太快挂柱效果差，当然你也可以选择循环挂柱，就是恒流泵的一头接你装蛋白的烧杯，从柱子中留下来的液体还用同一个烧杯接回去。挂完之后，按理想来讲，你的蛋白在Ni柱中与Ni就结合了，杂蛋白多数在烧杯里，留下来了，当然肯定有少量杂蛋白也挂上了，这时候你要梯度洗脱，拿咪唑和你的buffer配，一般从0 20mM 40mM。。。。100mM这样洗脱（当你不知道你的蛋白大概在什么时候出来的时候）我指的是咪唑的终浓度。咪唑加入之后，会和蛋白争夺与Ni的结合位点，杂蛋白、你的目的蛋白，会在不同的浓度被洗脱下来，洗完之后，你可以用400mM咪唑洗柱子，清理一切蛋白，然后平衡几次，是否选择重生你自己定咯~然后放上20%乙醇保存柱子就可以咯~
过的蛋白用不同的管子收下，然后SDS-page检测在哪个管子里。

5. 咪唑的合成方法

1、由乙二醛经环合；中和而得。将乙二醛、甲醛、硫酸铵投入反应锅，搅拌加热至85-88℃，保温4h。冷至50-60℃，用石灰水中和至pH为10以上。加热至85-90℃，排氨1h以上，稍冷，过滤，滤饼用热水洗涤，合并洗；滤液，减压浓缩至无水蒸出时，继续减压蒸馏至低沸物全部蒸完，收集105-160℃（0.133-0.267kPa）馏分，得咪唑。收率约45%。
2、另一种制法是使邻苯二胺与甲酸环合生成苯骈咪唑，再经双氧水反应开环为4,5-二羟基咪唑，最后脱羧制得咪唑。4,5-二羟基咪唑也可由d-酒石酸经硝化、环合而得。4,5-二羧基咪唑的脱羧制取咪唑的工艺过程如下：将4,5-二羟基咪唑与氧化铜混合，加热至100-280℃，放出大量二氧化碳气体，收集馏出液即得粗品，用苯重结晶得成品，收率76%。
3、咪唑的化学合成路线有乙二醛合成法、腈类合成法、酒石酸法、邻苯二胺与甲酸环合法、溴乙醛法等。
（1）工业乙二醛合成法将乙二醛、甲醛、硫酸铵投入反应釜，搅拌加热至85～88℃，保温4h。然后冷却至50～60℃，用石灰水中和至pH值10以上，再加热至85～90℃，排氨1h以上。稍冷后，过滤，滤饼用热水洗涤，合并洗、滤液，加入到蒸馏装置中，先减压浓缩至无水蒸出，再继续减压蒸馏至低沸物全部蒸完，然后收集105～160℃/133.3～266.7Pa馏分，得咪唑。收率约45%。每吨产品消耗乙二醛4172kg，甲醛（37%）2344kg，硫酸铵（99%）3826kg，石灰2571kg。反应式如下：
该法由于收率和产品质量不尽如人意，文献报道了一些改进方法，如采用异丙醚萃取的方法、用乌洛托品代替甲醛的合成方法、用氨水代替硫酸铵的合成方法、用草酸铵代替硫酸铵的合成方法等。如用草酸铵代替硫酸铵可使收率提高到65%。
4、邻苯二胺与甲酸环合法将邻苯二胺与甲酸环合生成苯并咪唑，再经双氧水反应开环为4,5-二羧基咪唑，最后脱羧制得咪唑
5、溴乙醛法用醋酸乙烯酯与溴加成，再用乙醇处理，生成溴代乙醛，再与溴化氢、乙醇作用生成缩醛。缩醛在乙二醇及浓盐酸作用下生成环状缩醛，用过量甲酰胺与缩醛在不断通入氨气情况下反应，生成咪唑，产率为50%。
6、以乙二醛为原料，在甲醛中与硫酸铵(或氨)在85～90℃下反应，先制得咪唑的硫酸盐，然后用氢氧化钙中和，可得咪唑粗制品，过滤，用水洗涤，合并滤液和洗涤液，减压蒸发浓缩，结晶，可制得。如果直接用氨，则无硫酸盐的处理步骤，可一步制得。无论是用硫酸铵或氨，此法的收率较低，约45%。
以邻苯二胺和甲酸为原料，环合，生成苯并咪唑，再在硫酸溶液中氧化，生成二羧基咪唑，最后在氧化铜作用下，于100～150℃下脱羧，可制得粗品，再在苯溶液中重结晶，可得咪唑成品。以D-酒石酸为原料，在硫酸中，用硝酸进行硝化，制得2，3-二硝基酒石酸，再在甲醛中与氨反应，可制得二羧基咪唑，然后脱羧，可制得。
7、其制备方法是将乙二醛、甲醛、硫酸铵投入反应锅，搅拌加热至85～88℃，保温4h，冷至50～60℃，用石灰水中和至pH=10以上，加热至85～90℃，排氨1h以上，稍冷，过滤，滤饼用热水洗涤，合并洗滤液，减压浓缩至无水蒸出时，继续蒸馏至低沸物全部蒸完，收集105～160℃/133～266Pa馏分得咪唑。
也可用邻苯二胺为原料，加入到甲酸中搅拌加热，在95～98℃保温2h，降温到50～60℃，用10%NaOH调节至pH=10，降至室温，过滤水洗，干燥得苯并咪唑。在搅拌下将苯并咪唑投入浓硫酸，升温至100℃，慢慢滴入H2O2。加毕，在140～150℃搅拌反应1h，降温至40℃，加水稀释，析出结晶，过滤，水洗，干燥，得4，5-二羧基咪唑。将4，5-二羧基咪唑与氧化铜混合，加热至100～280℃，放出大量二氧化碳气体，收集馏出液，即得白色块状物粗品，用苯重结晶得精品咪唑。

6. 蛋白纯化过程中，超滤能除咪唑吗

您好！可以的，但是超滤除的不是很干净，用分子筛干净些。

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感谢您的采纳 O(∩_∩)O 。如有疑问，欢迎追问。

7. 生物样品中蛋白质的处理方法有哪些

一。蛋白质沉淀方法
1.中性盐盐析法
⑴在一定的
ph值及温度条件下，改变盐的浓度（即离子强度）达到沉淀的目的，称为“ks”分级盐析法。
（ks盐析：固定ph,
温度，改变盐浓度）
⑵在一定的离子强度下，改变溶液的ph值及温度，达到沉淀的目的，称为“β”分级盐析法。
（β盐析：固定离子强度，改变ph及温度。）
2.等电点沉淀法
蛋白质等电点沉淀法是基于不同蛋白质离子具有不同等电点这一特性，依次改变溶液ph值的办法，将杂蛋白沉淀除去，最后获得目标产物。
3.有机溶剂沉淀法
许多能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮、甲醇和乙腈，常用于低盐浓度下沉淀蛋白质。
4.非离子型聚合物沉淀法
20世纪60年代非离子型聚合物开始用于分离血纤维蛋白原和免疫球蛋白，从此高相对分子质量非离子聚合物沉淀蛋白质的方法被广泛使用，如：聚乙二醇（peg）、聚乙烯吡咯烷酮（pvp）、葡聚糖等。
5.金属沉淀法
能与羧基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强烈结合的金属离子，如：mn2+、fe2+、co2+、ni2+、cu2+、zn2+、cd2+；
能与羧酸结合而不与含氮化合物结合的金属离子，如：ca2+、ba2+、mg2+、pb2+；
与巯基化合物强烈结合的金属离子，如：hg2+、ag+、pb2+。
实际使用时，金属离子的浓度常为0.02
mol/l。
6.亲和沉淀
初始阶段：将一个目标蛋白质与键合在可溶性载体上的亲和配体络合成沉淀；
所得沉淀物用一生中适当的缓冲溶液进行洗涤，洗去可能存在的杂质；
用一种适当的试剂将目标蛋白质从配体中离解出来。
7.选择性变性沉淀法
（1）例如对于α-淀粉酶等热稳定性好的酶，可以通过加热进行热处理，使大多数杂蛋白受热变性沉淀而被除去。
（2）根据欲分离物质所含杂质的特性，通过改变ph值或加进某些金属离子等使杂蛋白变性沉淀而被除去。
8.反胶束萃取蛋白质
菌体细胞提取
固液分离是生物产品生产中的重要单元操作。培养基、发酵液、某些中间产品和半成品等都需进行固液分离。发酵液由于种类多、粘度大及成分复杂，其固液分离最为困难。
固液分离的方法很多，生物工业中常规的方法有分离筛、重力沉降、浮选分离、离心分离和过滤等，其中用于发酵液固液分离的方法主要是离心分离和过滤。
二。超滤膜滤去。

8. 蛋白纯化过程中,lysis buffer,wash buffer和Elution buffer所含的咪唑的作用

lysis buffer中加咪唑的目的是与杂蛋白竞争，使那些与填料亲和力弱的杂蛋白不能挂柱；
wash buffer中加咪唑是为了洗去大部分已挂柱的杂蛋白（也会洗去少量目的蛋白）；
elution buffer中加梯度咪唑，而且咪唑浓度渐高，是咪唑和目的蛋白竞争性结合填料，从而把目的蛋白从柱上洗脱。
这是我的理解，欢迎继续讨论，祝愉快！

9. 超滤蛋白 咪唑浓度在多少一下可以了

超滤蛋白不需要考虑咪唑的浓度
咪唑是小分子试剂，分子量68.07，正常的超滤管截留分子量一般都是3KD~10KD
咪唑这样的小分子会直接透过滤膜进入到下层滤出液中，而蛋白会被留在上层溶液中
超滤蛋白如果不添加溶液，咪唑浓度是不会改变的，只会是提高蛋白的浓度
所以超滤蛋白不需要去考虑咪唑的浓度

10. 咪唑有毒吗

二甲基-2-咪唑啉酮
别名：DMI
作为一种有机溶剂和原材料广泛应用于医药、农药、染料、液晶材料等领域。是清洗电子部件和模具的试剂，及高聚物的聚合溶剂。在医药领域作为药物透皮吸收剂应用效果显著；在高分子领域，可促进原料和催化剂的混合，改善聚合物化学性能、热性能和机械性能；在液晶材料领域，可获得优质多孔超滤膜，是储存性能稳定的液晶定位剂；在分子间，分子内的缩合制备大分子杂环化合物，碱性条件下的亲核取代、还原、氧化、消除、卤素交换反应、Kolbe-Sschmill反应、Ullmann反应领域的应用都具有良好效果。作为一种有机溶剂和原材料广泛应用于医药、农药、染料、液晶材料等领域。是清洗电子部件和模具的试剂，及高聚物的聚合溶剂。在医药领域作为药物透皮吸收剂应用效果显著；在高分子领域，可促进原料和催化剂的混合，改善聚合物化学性能、热性能和机械性能；在液晶材料领域，可获得优质多孔超滤膜，是储存性能稳定的液晶定位剂；在分子间，分子内的缩合制备大分子杂环化合物，碱性条件下的亲核取代、还原、氧化、消除、卤素交换反应、Kolbe-Sschmill反应、Ullmann反应领域的应用都具有良好效果。
1 反应溶剂
由于DMI 的热稳定性、化学稳定性，它对无机和有机化合物的溶解能力，以及它作为非质子传递型极性溶剂的催化作用，使其成为一种特别有效的反应溶剂。通过DMI的应用，能够在较短的时间内以较高的收率得到较高纯度的反应产物。
它对于各种亲核取代反应是非常有效的，例如，在如后图解所示的苯基醚衍生物、氨基化合物以及氟苯衍生物的合成等。它的高介电常数和对阳离子的溶剂化作用能够催化阴离子亲核反应。这些合成产物在农用化学品、医药、染料以及高性能树脂的单体等的合成中用作中间体。
2 聚合物
DMI 是唯一适用于耐热的热塑塑料的生产过程的溶剂，它还能有效地用作各种聚合物合成工艺的溶剂，并且用作聚合反应及塑料成型加工时的清模剂。在聚酰胺和聚酰亚胺树脂的生产中，DMI 能加速酰胺和亚胺基团的形成，得到高分子量的聚合物。在聚苯硫醚树脂的生产中，用DMI可以获得电子材料中需要的含极少量有机杂质的产品。在聚苯醚砜树脂生产中，DMI 能有效控制副反应的发生，得到高质量的聚合物产品。在聚酰亚胺树脂和聚砜树脂成膜加工以及聚醚酮树脂薄膜的延展加工时，用DMI进行处理可以使薄膜更均匀。
3 洗涤剂
把DMI添加到表面活性剂、碱、醇和聚氧乙烯烷基醚的混合物中去，能得到一种强力洗涤剂。由于DMI很容易溶解污垢，它还能用来配制一种高效清洗液用于清洗玻璃和金属。
4 染料和颜料
用DMI为溶剂组分与染料及颜料混合制作的墨水，能喷绘出对比鲜明，图像画面清晰。
5 电子材料
由于DMI的粘度低，介电常数高，它可以用作非水电池的电解质溶液的溶剂。此外，它还可以作为光致刻蚀用的剥离剂，与通常所用的剥离剂不同，它不涉及因通常所用的剥离剂的水不溶性而导致的一系列复杂工艺过程，也不会对环境产生负面影响。
6 表面处理剂
为了提高环氧树脂粘合剂的粘接强度，一种SDN (钠、钾或锂的聚丙烯络合物)的DMI溶液被用于TEFLON® (聚四氟乙烯)的表面处理。
7 石油产品
DMI 具有高沸点和高热稳定性，并且不易与其它物质构成共沸混合物，所以，它可以在液-液萃取、逆流分布、提取蒸馏和逆流洗涤等许多工业过程中应用。
由于DMI 能够溶解芳香化合物和不饱和烃，却不能溶解链烷烃，因此它是最好的BTX（苯、甲苯和二甲苯）萃取剂