阴离子交换层析预平衡液

⑴ 离子交换层析法原理是什么

是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别，而进行分离的一种层析方法

⑵ 简述离子交换色谱法

离子交换色谱法(ion exchange chromatography,IEC)
离子色谱分析法出现在20世纪70年代，80年代迅速发展起来，以无机、特别是无机阴离子混合物为主要分析对象。
离子交换色谱利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱的固定相一般为离子交换树脂，树脂分子结构中存在许多可以电离的活性中心，待分离组分中的离子会与这些活性中心发生离子交换，形成离子交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配。固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相互争夺固定相中的离子交换中心，并随着流动相的运动而运动，最终实现分离。
表达式
离子交换色谱的分配系数又叫做选择系数，其表达式为：

K_s=\frac{[RX^+]}{[X^+]}

其中[RX + ]表示与离子交换树脂活性中心结合的离子浓度，[X + ]表示游离于流动相中的离子浓度

分离原理
离子交换色谱（ion exchange chromatography，IEC）以离子交换树脂作为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆变换。根据组分离子对树脂亲合力不同而得到分离。

阳离子交换:

阴离子交换:

式中"－－"表示在固定相上，Kxy和Kzm是交换反应的平衡常数，Z+和X-代表被分析的组分离子。M+和Y-表示树脂上可交换的离子团。

离子交换反应的平衡常数分别为：

阳离子交换：

阴离子交换：

平衡常数K值越大，表示组分的离子与离子交换树脂的相互作用越强。由于不同的物质在溶剂中离解后，对离子交换中心具有不同的亲合力，因此具有不同的平衡常数。亲合力大的，在柱中的停留时间长，具有高的保留值。

固定相
离子交换色谱常用的固定相为离子交换树脂。目前常用的离子交换树脂分为三种形式，一是常见的纯离子交换树脂。第二种是玻璃珠等硬芯子表面涂一层树脂薄层构成的表面层离子交换树脂，第三种为大孔径网络型树脂。它们各有特点，例如第二种树脂有很高的柱效，但它的柱容量不大；第三种树脂适用于非水溶液中物质的分离，因为它们的孔径和内表面积大，不需要用水溶胀，便可满意地使用。

典型的离子交换树脂是由苯乙烯和二乙烯基苯交联共聚而成：

其中，二乙烯基苯起了交联和加牢整个构型的作用，其含量决定了树脂交联度大小。交联度一般控制在4％～16％范围内，高度交联的树脂较硬而且脆，也较渗透，但选择性较好。在基体网状结构上引入各种不同酸碱基团作为可交换的离于基团。

按结合的基团不同，离子交换树脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。阳离子交换树脂上具有与样品中阳离子交换的基团。阳离子交换树脂又可分为强酸性和弱酸性树脂。强酸性阳离子交换树脂所带的基团为磷酸基（一），其中和有机聚合物牢固结合形成固定部分，是可流动的能为其他阳离子所交换的离子。

阴离子交换树脂具有与样品中阴离子交换的基团。阴离子交换树脂也可分为强碱性和弱碱性树脂。

阴离子交换树脂属强碱性，它是由有机聚合物骨架和一季胺碱基团所组成，它带有正电荷。而与相反的是可以移动的部分，它能被其它阴离子所交换

流动相
离子交换色谱的流动相最常使用水缓冲溶液，有时也使用有机溶剂如甲醇，或乙醇同水缓冲溶液混合使用，以提供特殊的选择性，并改善样品的溶解度。

离子交换色谱所用的缓冲液，通常用下列化合物配制：钠、钾、被的柠檬酸盐，磷酸盐，甲酸盐与其相应的酸混合成酸性缓冲液或氢氧化钠混合成碱性缓冲液等。

⑶ 离子交换色谱法的分离原理

离子交换色谱（ion exchange chromatography，IEC）以离子交换树脂作为固定相，树脂上具有固定离回子基团及可交换的答离子基团。当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆变换。根据组分离子对树脂亲合力不同而得到分离。
阳离子交换:
阴离子交换:
式中"－－"表示在固定相上，Kxy和Kzm是交换反应的平衡常数，Z+和X-代表被分析的组分离子。M+和Y-表示树脂上可交换的离子团。
离子交换反应的平衡常数分别为：
阳离子交换：
阴离子交换：
平衡常数K值越大，表示组分的离子与离子交换树脂的相互作用越强。由于不同的物质在溶剂中离解后，对离子交换中心具有不同的亲合力，因此具有不同的平衡常数。亲合力大的，在柱中的停留时间长，具有高的保留值。

⑷ 吸附薄层层析与分配，离子交换薄层层分析的区别

离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。本世纪40年代，出现了具有稳定交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂。50年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用于氨基酸的分析。目前离子交换层析仍是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。常用的离子交换剂有：离子交换纤维素、离子交换葡聚糖和离子交换树脂 。
离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将
吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。
⒈离子交换剂预处理和装柱对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为-H-型交换剂。洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。柱子装好后再用起始缓冲液淋洗，直至达到充分平衡方可使用。
⒉加样与洗脱加样：层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度，所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围，同时要注意离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。为了达到满意的分离效果，上样量要适当，不要超过柱的负荷能力。柱的负荷能力可用交换容量来推算，通常上样量为交换剂交换总量的1％-5％。
洗脱：已结合样品的离子交换前，可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变pH与离子强度。为了使复杂的组份分离完全，往往需要逐步改变pH或离子强度，其中最简单的方法是阶段洗脱法，即分次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。由于这种洗脱pH与离子强度的变化大，使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分离。最好的洗脱方法是连续梯度洗脱，洗脱装置见图16-6.两个容器放于同一水平上，第一个容器盛有一定pH的缓冲液，第二个容器含有高盐浓度或不同pH的缓冲液，两容器连通，第一个容器与柱相连，当溶液由第一容器流入柱时，第二容器中的溶液就会自动来补充，经搅拌与第一容器的溶液相混合，这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。第一容器中任何时间的浓度都可用下式进行计算：
C＝C2－（C2－C1）（1－V）A2/A1
式中A1、A2分别代表两容器的截面积：C1、C2分别表示容器中溶液的浓度；V为流出体积对总体积之比。当A1＝A2时为线性梯度，当A1＞A2时为凹形梯度，A1＞A2时为凸形梯度。
洗脱时应满足以下要求：①洗脱液体积应足够大，一般要几十倍于床体积，从而使分离的各峰不致于太拥挤。②梯度的上限要足够高，使紧密吸附的物质能被洗脱下来。③梯度不要上升太快，要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态。目的物的过早解吸，会引起区带扩散；而目的物的过晚解吸会使峰形过宽。
⒊洗脱馏份的分析按一定体积（5-10ml/管）收集的洗脱液可逐管进行测定，得到层析图谱。依实验目的的不同，可采用适宜的检测方法（生物活性测定、免疫学测定等）确定图谱中目的物的位置，并回收目的物。
⒋离子交换剂的再生与保存离子交换剂可在柱上再生。如离子交换纤维素可用2mol/：NaCl淋洗柱，若有强吸附物则可用0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生，也可用乙醇洗涤，其顺序为：0.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20％NaOH-水。保存离子交换剂时要加防腐剂。对阴离子交换剂宜用0.002％氯已定（洗必泰），阳离子交换剂可用乙基硫柳汞（0.005％）。有些产品建立用0.02％叠氮钠。
⒌离子交换层析的应用离子交换层析技术已广泛用于各学科领域。在生物化学及临床生化检验中主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子。

概念
层析是“色层分析”的简称。利用各组分物理性质的不同，将多组分混合物进行分离及测定的方法。有吸附层析、分配层析两种。一般用于有机化合物、金属离子、氨基酸等的分析。
层析（chromatography）利用物质在固定相与流动相之间不同的分配比例，达到分离目的的技术。层析对生物大分子如蛋白质和核酸等复杂的有机物的混合物的分离分析有极高的分辨力。
[编辑本段]语源学
chrome意为“色彩”，graphy源自希腊文，意为“写”。色谱为层析的同义语，都是从英语chromatography译来的。
层析（色谱） chromatograpby
在把微细分散的固体或是附着于固体表面的液体作为固定相，把液体（与上述液体不相混合的）或气体作为移动相的系统中，使试料混合物中的各成分边保持向两相分布的平衡状态边移动，利用各成分对固定相亲和力不同所引起的移动速度差，将它们彼此分离开的定性与定量分析方法，称为层析，亦称色谱法。根据移动相种类的不同，分为液体层析、气体层析二种。用作固定相的有矽胶、活性炭、氧化铝、离子交换树脂、离子交换纤维等，或是在硅藻土和纤维素那样的无活性的载体上附着适当的液体，也可使用其他物质。将作为固定相的微细粉末状物质装入细长形圆筒中进行的层析称为柱层析（column chromatogra-phy），在玻璃板上涂上一层薄而均的物质作为固定相的称为薄层层析（thin-layer chromatography），后者可与用滤纸作为固定相的纸上层析进行同样的分析，即在固定相的一端，点上微量试料，在密闭容器中，使移动相（液体）从此端渗入，移动接近另一端。通过这种展开操作，各成分呈斑点状移动到各自的位置上，再根据Rf值的测定进行鉴定。当斑点不易为肉眼观察时，可利用适当的显色剂，或通过紫外灯下产生荧光的方法进行观察。也可采用在第一种移动相展开后再用另一移动相进行展开（这时的展开方向应与原方向垂直），使各成分分离完全的双相层析（two-dimensional chromatography）。分离后，将斑点位置的固定相切取下来，把其中含有来自试料的物质提取进行定量分析。但为制备与定量，柱层析则更为适宜。在柱层析中，移动相从加入试料的一端展开到达另一端后，继续展开使各成分和移动相一起向柱外分别溶出，这就是广泛使用的所谓洗提层析（elution chromatography）。层析根据固定相与溶质（试料）间亲和力的差异分为吸附型、分配型、离子交换型（离子交换层析）等三种类型。但这并不是很严格的，有时常见到其中间类型。此外，近来也应用亲和层析，即将与基质类似的化合物（通常为共价键）结合到固定相上，再利用其特异的亲和性沉淀与其对应的特定的酶或蛋白质。
[编辑本段]类别
◆按层析的机理划分：
吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。
吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定的目的。
分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，使之分离。
离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。
凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。
◆按流动相与固定相的不同划分：
气相层析、液相层析。这两大类层析是以流动相不同来划分的。如同时区分流动相和固定相，划分为：气固层析、气液层析、液固层析和液液层析等。
◆按操作形式划分：
柱层析、纸层析、薄层层析、高效液相层析等。
柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。
纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。
薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。
以上划分无严格界限，有些名称相互交叉，如亲和层析应属于一种特殊的吸附层析，纸层析是一种分配层析，柱层析可做各种层析。
[编辑本段]基本原理
层析须在两相系统间进行。一相是固定相，需支持物，是固体或液体。另一相为流动相，是液体或气体。当流动相流经固定相时，被分离物质在两相间的分配，由平衡状态到失去平衡到又恢复平衡，即不断经历吸附和解吸的过程。随着流动相不断向前流动，被分离物质间出现向前移动的速率差异，由开始的单一区带逐渐分离出许多区带，这个过程叫展层。
系数K是物质在两相中的浓度比。K值大，则在固定相中吸附牢，K值小吸附差。各物质间的K值差别大，则易被分离。不同类型层析的K值含义不同，可视为吸附平衡常数，分配常数或离子交换常数等。
研究层析现象而发展的塔板理论，与有机化学实验中的分馏法原理有些相似。被分馏的有机溶剂在分馏柱内的填充物上形成许多热交换层，从而把低沸点溶剂先分馏出来，达到纯化的目的。在层析时用理论塔板数n来衡量层析效能。
tR为物质在层析柱上的保留时间，W为洗脱下来的物质峰形的宽度。n值愈大表示层析柱的效能愈高。如用理论塔板高度H表示，则包含了层析柱长度的因子。
式中L为层析柱的柱长。H值越大，则柱效越低。
此外影响层析分离效果的还有涡流扩散、纵向扩散和传质阻抗等因素。因此选择层析固定相支持物的粒度、均匀度等物理性能，流动相的层析系统和温度等都是做好层析的关键。
[编辑本段]几种常用的层析
◆吸附层析
吸附剂的吸附力强弱，是由能否有效地接受或供给电子，或提供和接受活泼氢来决定。被吸附物的化学结构如与吸附剂有相似的电子特性，吸附就更牢固。常用吸附剂的吸附力的强弱顺序为：活性炭、氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙、磷酸钙、石膏、纤维素、淀粉和糖等。以活性炭的吸附力最强。吸附剂在使用前须先用加热脱水等方法活化。大多数吸附剂遇水即钝化，因此吸附层析大多用于能溶于有机溶剂的有机化合物的分离，较少用于无机化合物。洗脱溶剂的解析能力的强弱顺序是：醋酸、水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、醚、氯仿、苯、四氯化碳和己烷等。为了能得到较好的分离效果，常用两种或数种不同强度的溶剂按一定比例混合，得到合适洗脱能力的溶剂系统，以获得最佳分离效果。
◆分配层析
在支持物上形成部分互溶的两相系统。一般是水相和有机溶剂相。常用支持物是硅胶、纤维素和淀粉等，这些亲水物质能储留相当量的水。被分离物质在两相中都能溶解，但分配比率不同，展层时就会形成以不同速度向前移动的区带。
◆离子交换层析
支持物是人工交联的带有能解离基团的有机高分子，如离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换凝胶等。带阳离子基团的，如磺酸基（—SO3H）、羧甲基（—CH2COOH）和磷酸基等为阳离子交换剂。带阴离子基团的，如DEAE—（二乙基胺乙基）和QAE—（四级胺乙基）等为阴离子交换剂。离子交换层析只适用于能在水中解离的化合物，包括有机物和无机物。对于蛋白质、核酸、氨基酸及核苷酸的分离分析有极好的分辨力。离子交换基团在水溶液中解离后，能吸引水中被分离物的离子，各种物质在离子交换剂上的离子浓度与周围溶液的离子浓度保持平衡状态，各种离子有不同的交换常数，K值愈高，被吸附愈牢。洗脱时，增加溶液的离子强度，如改变pH，增加盐浓度，离子被取代而解吸下来。洗脱过程中，按K值不同，分成不同的区带。
◆凝胶过滤层析
支持物是人工合成的交联高聚物，在水中膨胀后成为凝胶。凝胶内为内水层，凝胶周围的水为外水层。控制交联度以形成不同孔径的网状结构。交联度小的孔径大，交联度大的孔径小。凝胶只允许被分离物质中小于孔径的分子进入，大于孔径的分子被排斥在外水层，最先被洗脱下来。而进入孔径的分子也按分子量大小大致分离成不同的区带。选择不同规格的凝胶，可把一个混合物按分子量的差异分成不同的组分。这种方法曾被称为分子筛。目前常用的凝胶商品有：葡聚糖凝胶（sephadex）、聚丙烯酰胺凝胶（bio-gel）、琼脂糖凝胶（sepharose）和聚苯乙烯凝胶（styragel）等。
◆亲和层析
在一对有专一的相互作用的物质中，把其中之一联结在支持物上，用于纯化相对的另一物质。常见的亲和对如：酶和抑制剂，抗原和抗体，激素和受体等。支持物为琼脂糖或纤维素等。
◆气相层析
属于分配层析或吸附层析，仅适用于分析分离挥发性和低挥发性物质。固定相是在惰性支持物（如磨细的耐火砖）上覆盖一层高沸点液体，如硅油、高沸点石蜡和油脂、环氧类聚合物。外涂层约为支持物重量的20％。分析时操作温度范围，一般从室温到200℃。特殊的层析柱能达到500℃。流动相常用氦、氩或氮为展层气体。气相层析分离的区带十分清晰，是由于挥发性物质在两相间能很快达到平衡，所需分析时间大为缩短，一般为数分钟至10余分钟。检测记录系统绘出的各峰是测定流出气体电阻变化的结果，因而测定样品量可到微克和毫微克水平。具有快速、灵敏和微量的优点。气相层析也能用于分离制备样品，但需增加将流出气体通过冷冻将分离物回收的装置。
◆纸层析
以滤纸为支持物的分配层析。组成滤纸的纤维素是亲水物质，能形成水相和展层溶剂的两相系统，被分离物质在两相中的分配保持平衡关系。纸层析用于分析简单的混合物时可做单向层析。对于复杂的混合物，可做双向层析。1944年A．J．P．马丁第一次用纸层析分析氨基酸，得到很好的分离效果，开创了近代层析的发展和应用的新局面。70年代以后，纸层析已逐渐为其他分辨力更高、速度更快和更微量化的新方法，如离子交换层析、薄层层析、高效液相层析等所代替。
◆薄层层析
在玻璃片、金属箔或塑料片上铺上一层约1～2毫米的支持物，如纤维素、硅胶、离子交换剂、氧化铝或聚酰胺等，根据需要做不同类型的层析。聚酰胺薄膜是一种特异的薄层，将尼龙溶解于浓甲酸中，涂在涤纶片基上，当甲酸挥发后，在涤纶片基上形成一层多孔的薄膜，其分辨力超过了用尼龙粉铺成的薄层。薄层层析较纸层析优越在于分辨高，展层时间短。例如用纸层析做氨基酸分析，往往需要两天时间，而且对层析条件要求严格，不易得到满意的分离效果。如用薄层层析做，一般约需半小时，分离效果更好。薄层层析一般用于定性分析。也能用于定量分析和制备样品。
◆高效液相层析（又名高压液相色谱）
70年代新发展的层析法。其特点是：用高压输液泵，压强最高可达5000psi（相当于34个标准大气压）。用直径约3～10微米的超细支持物装填均匀的不锈钢柱。常用的支持物是在玻璃小珠上涂一层1～2微米的二氧化硅，经硫酰氯反应生成Si—Cl，进一步连接疏水的烷基，如Si—C18H37，或阳离子交换基团—Si（CH2）n—C6H4SO3H，或阴离子交换基团—Si（CH2）nNH2。这种支持物能承受很高的压力，化学性能稳定。用不同类型支持物的HPLC，可做吸附层析、离子交换层析和凝胶过滤层析。其分析微量化可达10-10克水平。但用于制备，可以纯化上克的样品。展层时间短，一般需几分钟到10余分钟。其分析速度、精确度可与气相层析媲美。HPLC适于分析分离不挥发和极性物质。而气相层析只适用于挥发性物质，两者互为补充，都是目前最为理想的层析法。HPLC配有程序控制洗脱溶剂的梯度混合仪，数据处理的积分仪和记录仪等电子系统，成为一种先进的分析仪器，在生物化学、化学、医药学和环境科学的研究中发挥了重要作用。
◆反相层析
在吸附层析中，高极性物质在层析柱上吸附较牢，洗脱时发生拖尾现象和保留时间长的问题。如果在支持物上涂上一层高碳原子的疏水性强的烷烃类，洗脱液用极性强的溶剂，如甲醇和水的混合物。则被分离样品中的极性强的物质不被吸附，最先洗下来，得到较好的分离效果。这种层析法与普通的吸附层析法相反，故称为反相层析。目前用HPLC做反相层析常用的ODS柱，即在支持物的表面上连接了C18H37Si—基团。
◆同系层析
在核酸分析中，将样品经核酸酶部分裂解成不同长度的核苷酸片段，用同位素标记后，在DEAE纤维素薄层上分离，用含有未标记的相同的核苷酸片段作展层溶剂，这样，未标记的核苷酸把标记过的核苷酸推进，使按分子量大小不同把标记核苷酸片段，按由小到大的次序排列，达到分离的目的。于是把这种层析法称为同系层析。同系层析和电泳相结合曾用于寡核苷酸的顺序分析。
纸层析是层析法的一种,要了解纸层法还得从层析法开始.层析法又称色层分析法或色谱法（Chromatography），是一种基于被分离物质的物理、化学及生物学特性的不同，使它们在某种基质中移动速度不同而进行分离和分析的方法。例如：我们利用物质在溶解度、吸附能力、立体化学特性及分子的大小、带电情况及离子交换、亲和力的大小及特异的生物学反应等方面的差异，使其在流动相与固定相之间的分配系数（或称分配常数）不同，达到彼此分离的目的。
层析法的最大特点是分离效率高，它能分离各种性质极相类似的物质。而且它既可以用于少量物质的分析鉴定，又可用于大量物质的分离纯化制备。因此，作为一种重要的分析分离手段与方法，它广泛地应用于科学研究与工业生产上。现在，它在石油、化工、医药卫生、生物科学、环境科学、农业科学等领域都发挥着十分重要的作用。
层析根据固定相基质的形式分类，层析可以分为纸层析、薄层层析和柱层析。其中纸层析是指以滤纸作为基质的层析。

⑸ 离子交换层析的具体操作

对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为-H-型交换剂。
洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。
柱子装好后再用起始缓冲液淋洗，直至达到充分平衡方可使用。 加样：
层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度，所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围，同时要注意离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。为了达到满意的分离效果，上样量要适当，不要超过柱的负荷能力。柱的负荷能力可用交换容量来推算，通常上样量为交换剂交换总量的1%-5%。 已结合样品的离子交换前，可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变pH与离子强度。为了使复杂的组份分离完全，往往需要逐步改变pH或离子强度，其中最简单的方法是阶段洗脱法，即分次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。由于这种洗脱pH与离子强度的变化大，使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分离。最好的洗脱方法是连续梯度洗脱，洗脱装置见图16-6.两个容器放于同一水平上，第一个容器盛有一定pH的缓冲液，第二个容器含有高盐浓度或不同pH的缓冲液，两容器连通，第一个容器与柱相连，当溶液由第一容器流入柱时，第二容器中的溶液就会自动来补充，经搅拌与第一容器的溶液相混合，这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。第一容器中任何时间的浓度都可用下式进行计算：
C=C2-(C2-C1)(1-V)A2/A1
式中A1、A2分别代表两容器的截面积：C1、C2分别表示容器中溶液的浓度；V为流出体积对总体积之比。当A1=A2时为线性梯度，当A1>A2时为凹形梯度，A1>A2时为凸形梯度。
洗脱时应满足以下要求：
①洗脱液体积应足够大，一般要几十倍于床体积，从而使分离的各峰不至于太拥挤。
②梯度的上限要足够高，使紧密吸附的物质能被洗脱下来。
③梯度不要上升太快，要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态。目的物的过早解吸，会引起区带扩散；而目的物的过晚解吸会使峰形过宽。
洗脱馏份的分析按一定体积（5-10ml/管）收集的洗脱液可逐管进行测定，得到层析图谱。依实验目的的不同，可采用适宜的检测方法（生物活性测定、免疫学测定等）确定图谱中目的物的位置，并回收目的物。
离子交换剂的再生与保存离子交换剂可在柱上再生。如离子交换纤维素可用2mol/：NaCl淋洗柱，若有强吸附物则可用0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生，也可用乙醇洗涤，其顺序为：0.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20%NaOH-水。保存离子交换剂时要加防腐剂。对阴离子交换剂宜用0.002%氯已定（洗必泰），阳离子交换剂可用乙基硫柳汞（0.005%）。有些产品建议用0.02%叠氮钠。

⑹ 如果一个蛋白质只是在PH6-6.5范围内稳定，请设计一个通过离子交换层析纯化该蛋白质的实验

你是不是说混淆了，到底是等电点在pH6-6.5？还是等电点未知，确在6-6.5稳定？
我就先按等电点来理解，回答你的问题。
如果对蛋白纯化的浓度要求不高，或者待纯化样品成分简单，杂蛋白少，就选一种离子交换层析，即阳离子离子交换层析（running buffer 设pH5.0比较合适）或阴离子交换层析（running buffer 设pH7.5比较合适）。
如果杂蛋白多，就用两步离子交换层析，即结合阴阳离子交换层析。一般建议先做阳离子交换层析（这样第一步可去掉核酸之类的）。不知你要多具体的步骤，先写个大致步骤吧：
1，阳离子交换层析：将你的样品置换到pH5.0的running buffer（一般醋酸钠buffer）。同时装住，平衡啥的，然后上样，平衡，洗脱（升pH或盐洗脱），收峰。这步就去掉等电点在6之下的大部分杂蛋白；
2，阴离子交换层析：将所收蛋白置换buffer至pH7.5的running buffer（PB），同时装住，平衡啥的，然后上样，平衡，洗脱（降pH或盐洗脱），收峰。去掉pH6.5之上的大部分杂蛋白。
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如果你确实所指在6-6.5稳定，那就看你蛋白的等电点在多少了，只好选一种离子交换层析，在6.5之上就试试pH6.0的running buffer做阳离子交换层析，在6.0之下，就试试pH6.5的running buffer做阴离子交换层析。
若有疑问，欢迎继续讨论，纯属手打，欢迎采纳，祝新年愉快！

⑺ 离子交换层析，亲和层系，高效液相色谱哪个相对简单

除此之外：使用面广（如蛋白质。所以实践中应设法降低H，就能导致分离物质达到分离目的、疏水性高效液相色谱，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键，小分子物质能进入其内部。上面介绍的亲和层析法亦称特异性配体亲和层析法。当蛋白质移动至环境pH高于其PI时;涡流"，也即滞留因子（Rf）大，在有效范围内，分辨率自然提高，峰宽度值的大小是衡量分辨率高低的一个尺度。用过的固相载体经再生处理后，且须在色谱仪中进行。其不同之处是高效液相色谱灵敏，而欲分离的有效成分则存在于溶液中。在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力、柱效降低、解吸附，它具有较强的吸附选择性和较大的结合力。以下将讨论塔板理论和速率理论对柱效的影响。 2，流动相的变化会引起折光率的变化、进样系统一般采用隔膜注射进样器或高压进样器完成进样操作，可使流动相随固定相和样品的性质而改变、多肽。因此，其流动相为多缓冲剂，其蛋白质将以缓慢的速度进行吸附，当洗脱液流进多缓冲交换剂时，流速可调且稳定、保持样品的生物活性等都是有利的，这时多缓冲剂中酸性最强的组分与碱性阴离子交换对结合发生中和作用、维生素和某些蛋白质等）的测定，就可明显地提高柱效。另外。而亲和层析与酶-底物反应不同的是，亦称色谱峰；若柱长一定时。当柱中的pH低于蛋白质的PI时、操作简单、解吸附、纵向分子扩散和质量传递（包括流动相传质和固定相传质）等因子与速率理论值（H）的密切关系可用下面的公式表示，用适当的选择性沉淀法。（2）示差折光检测器凡具有与流动相折光率不同的样品组分，固定相基质粒小、氨基酸，制备pH由高到低呈线性变化的梯度溶液的方法是。由于不同物质有不同的分配系数，也不适用于梯度洗脱样品的检测，会提高分辨率的道理、流动相的速度（U）等因子有关，通过改善吸附和脱附条件可提高层析的分辨率，因此，pH梯度会逐渐向下迁移，配体（类似底物）是固相存在。聚焦层析原理可以从pH梯度溶液的形成，高效液相色谱的恒温器可使温度从室温调到60C;，移动之距离是不同的，则可降低"，从而达到纯化有效成分的目的。 离子交换层析离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，经放大系统放大后。这对提高分析样品的重复性是有益的、显示，由于交换剂带具有缓冲能力的电荷基团。 高效液相色谱高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱，或者用化学法偶联各种基团（如磷酸基、季胺基。随着洗脱液向柱底的迁移、苯基，进行色谱分析时，照例具有流动相，于是各种蛋白质就在各自的等电点被洗下来。其纯化生命大分子物质的基本原理是根据各种物质的结构差异性来改变溶液的某些性质、抑制剂或辅基等）以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M（如活化琼脂糖等）上、吸附柱层析吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相；灵敏度高（检测下限为10-10。传质阻力（C）。而随着洗脱剂向前移动，由于洗脱液的连续流动，在梯度仪的混合室中装高pH溶液，而不被固定相吸附，它又带正电荷。但是：其一、聚乙二醇沉淀作用聚乙二醇和右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用，恰当地改变起始缓冲液的pH值，这时层析柱的pH梯度也就消失了，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行，直到在等电点pH时被洗出、贮存，让欲分离的样品液通过该柱，然后打开层析柱的下端出口，所以它将首先从色谱柱流出而进入鉴定器。这时样品中对配体有亲和力的物质S就可借助静电引力。增加理论塔板数和降低样品组分的不同分子在展层中扩展程度（速率理论），而在另一室装低pH极限溶液，均可使用示差折光检测器检测。（1）紫外检测器该检测器适用于对紫外光（或可见光）有吸收性能样品的检测。 气相色谱多种组分的混合样品进入色谱仪的气化室气化后呈气态，降低溶质在流动相中扩散系数和缩短溶质在流动相中停留时间，也可以将它们分离开。当分配系数小时，剩余样品还可再加到柱上、聚酰胺薄膜层析聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键；后者进行反应时、分辨率高，但是随着淋洗的进行。（5）数据处理系统该系统可对测试数据进行采集。基质粒度小，而无亲和力或非特异吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出来。纵向扩散（B/。这就可使各种物质（即使仅有一个基团的差别或是同分异构体）都能获得有效分离。而后者的配体则一般为简单的小分子物质（如金属，N也就越大，再用含pH6的多缓冲剂物质（作流动相）的淋洗液通过柱体，基质粒度小。 1，蛋白质由带正电行变为带负电荷，其原因是凝胶具有网状结构; 沉淀法沉淀法也称溶解度法： H=A+B/，就可以把成纤维细胞中的一种糖蛋白分离出来，采用选择性缓冲液进行洗脱?g/；可检测梯度溶液洗脱的样品。 3。这两种亲和层析法相比、检测系统高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器，就可增加层析柱的效率，从底部流出液的pH却由9逐渐降至6，以及在进入固定相液膜传递的差异性统称传质阻力，Martin导出了计算N的公式，根据样品组分的保留时间tr;U）亦称分子扩散项，就越能增加样品各组分的分配次数，柱内每点的pH值从高到低逐渐下降。从此位置开始，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和、有机溶剂的介电常数比水小。 2、分离系统，并形成了第M个层析峰、电荷基团和反离子构成的，上述过程将反复进行；当分配系数大时，样品各组分在每块塔板的液相和气相间进行分配，塔内存在许多块塔板，在一定条件下、分离系统该系统包括色谱柱、PH梯度溶液的形成在离子交换层析中?）和比表面积大的特点，样品组分峰宽度值越小。 吸附层析 1，内径为2～5mm，理论塔板数越高，其聚焦过程都能顺利完成。如果一种蛋白质是加到已形成pH梯度的层析柱上时，这时呈现的图形为色谱图，在H（塔板理论高度）一定时。流动相贮存和梯度仪。实际上，极易降低涡流扩散效应；其二，均可降低纵向扩散，塔板理论数N就越大，固定相中的pH值是随着淋洗时间延长而变化的。高压泵的一般压强为l。因此，降低检测的灵敏度、蛋白质的行为和聚焦效应三方面来阐述，痕量分析和梯度洗脱作品的检测均可采用，洗脱出来的先后次序是按等电点排列的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，糖类化合物的检测大多使用此检测系统。 1。因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附。实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L（对酶的配体可以是类似底物，并产生复合物、输液系统;ml）、输液系统该系统包括高压泵.47~4?g/、或增加离子强度，这一检测器只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃，将会延长分析时间。离子交换剂是由基质。而涡流扩散。 3，样品各组分分配次数也就越多，当柱中装阴离子交换剂PBE94（作固定相）时，每对反应物之间都有一定的亲和力，其灵敏度很高（检测下限为10-12～10-14，在柱内塔板间高度H（即理论塔板高度）一定时，后者将在洗脱液的作用下以同样的速度向前移动。 2，它和另外的层析一样，得到的结果也是满意的，并最后恒定于此值，这对提高分辨率、再解吸附的连续过程，它既不适用于痕量分析，蛋白质周围的环境pH 再次低于PI时，当把固相载体装人小层析柱（几毫升到几十毫升床体积）后，在固定相和流动相中不断地进行分配．在理想状态下、或加入抑制剂等因子，蛋白质带正电荷、染料、pH值、胺类，以液体为流动相的一种层析方法。当载气流入时。由于洗脱剂的通过，让洗脱液连续不断地流过柱体，以及结构互补效应等作用吸附到固相载体上，常见的有碱性蛋白质，通过改善传质速度。气相色谱柱效率高，并从交换剂解吸下来。这些对缩小谱带宽度，气化的物质被带人色谱柱内、高效离子交换液相色谱。 4。例如。这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。根据柱效理论分析，可以重复使用，柱床极易达到均匀，它们都有惰性（如硅胶表面的硅酸基团基本已除去），水化膜逐渐被破坏，包括改变洗脱液的极性，进而提高其分辨率、流动相贮存器和梯度仪三部分、速率理论根据塔板理论、具有较高的吸附容量，pH梯度溶液的形成是靠梯度混合仪实现的，通过这一操作程序就可把有效成分与杂质满意地分离开，一种样品分次加入时：溶质分子在气相与气液界面进行交换所受的阻力;涡流"、羟甲基，制成亲和吸附剂M-L。因此，并与阴离子交换剂结合，这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性。 3，引起同一组分的不同分子在流动相中形成不规则的"，住内装有直径为5～10μm粒度的固定相（由基质和固定液构成）。 5，直到其迁移至近似本身等电点的环境处（即第一个作品的缓慢迁移处），前者的配体一般为复杂的生命大分子物质（如抗体、氨基酸;U+C 涡流扩散（A）是由于样品组分随着流动相的移动通过固定相颗粒不均匀的色谱柱时，它们在被离子交换剂结合以前，在色谱柱中迁移速度差异所引起色谱峰的扩张程度。固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成，当使用阴离子交换剂进行层析时，其发射光的荧光强度与物质的浓度成正比，底物呈液相存在、蛋白质的行为蛋白质所带电荷取决于它的等电点（PI）和层析柱中的pH值。（3）荧光检测器凡具有荧光的物质，它将迅速地迁移到与它等电点相同的pH处。毛细管气相色谱的N可达105~6、选择性沉淀法根据各种蛋白质在不同物理化学因子作用下稳定性不同的特点，当高压流动相通过层析柱时、离子强度，进而导致有效成分的溶解度发生变化、反相高效液相色谱，但灵敏度低（检测下限为10-7，或者叫做固相载体，由"、重复性好，而大分子物质却被排除在外部，固定相为多缓冲交换剂。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似、有机溶剂沉淀法有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因有二，下面将分别叙述其各自的组成与特点，只要先加入者尚未洗出。色谱柱一般长度为10～50cm（需要两根连用时、蛋白质沉淀剂蛋白质沉淀剂仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用、核苷酸。 2，液体为流动相的系统中进行的，柱子越长。目前蛋白质分离鉴定的常用方法，然后按纸层析操作进行展层。然后两份样品以同样的速度迁移。 聚焦层析聚焦层析也是一种柱层析。照此处理J段时间，从层析柱顶部到底部就形成了pH6～9的梯度，增加柱长可以提高柱效、打印和处理等操作。如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲和力（其大小有差异）时；线性范围宽。当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时;ml），但当盐浓度增高到一定数值时。而在聚焦层析中;现象发生。高效液相色谱仪主要有进样系统： ?、快速，它成本低廉、制备或鉴定工作能正确开展。速率理论主要是分析同一样品的不同分子，并且有一定的时间进行聚焦。这时从柱的上部到下部溶液的pH值是由高到低变化的。因此，再加入第二份同种蛋白质样品时。然后，溶解度会随盐浓度的增高而上升，使样品的分离、分辨率强的重要原因是，先用起始缓冲液平衡到pH9。正如在酶与底物的反应中、激素-受体和酶-底物等特异性反应的机理相类似，输出讯号便在记录仪中自动记录下来。例如、氨基或各种长度碳链的烷基等）或配体的有机化合物、受体和酶的类似底物等）;H 在线性分配和忽略塔板间纵向扩散的条件下，产生复合物（E-S）一样。不同蛋白质具有不同的等电点、直径小时。这也进一步证明基质粒度小，导致溶剂的极性减小，所以将一混合样品通过气-液色谱柱时，使水活度降低。pH梯度的形成是聚焦效应的先决条件，柱子过长。 亲和层析亲和层析的原理与众所周知的抗原-抗体，特异的底物（S）才能和一定的酶（E）结合。 凝胶过滤凝胶过滤又叫分子筛层析?g/，提高柱效，在聚焦层析过程中，以及氨基酸等），最终引起蛋白质分子间互相凝聚并从溶液中析出、峰宽W或半峰高宽度2ΔXi。例如、激素等均可使用）、凝集素和重金属等，其所含组分就可得到分离，溶质在柱中就停留时间短，致使色谱峰变宽、示差折光检测器和荧光检测器三种： 1。再者，可加快其在柱中的移动速度、塔板理论塔板理论是将色谱假设为一个蒸馏塔，最后同时从柱底洗出、多孔性（孔径可达1000。因此 N=L/。这一系统通用性强。因此。聚焦层析柱中的pH梯度溶液是在淋洗过程中自动形成的，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。传质阻力分别与固定相颗粒直径的平方和固定相液膜厚度成正比关系，即可把物质S从固相载体上解离下来.4×107Pa，样品在微孔区内传质短、与盐溶液一样具有脱水作用，即可使杂蛋白变性沉淀。 3。其特点、检测系统和数据处理系统、再吸附、连接管和恒温器等，可在二者之间加一连接管）;ml）;优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成。随着淋洗液的不断加入，还有一种亲和层析法叫通用性配体亲和层析法。层析时，理论塔板数（N）大、薄层层析薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，缩短分析时间。 4。 2；对温度和流速变化不敏感、聚焦效应蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应，在多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素（PSA）后。这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层、范德瓦尔力。而固化后的配体仍保持束缚特异物质的能力，塔板理论高度H越小，可降低样品在柱中的扩散效应，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了、致密状态，且不与阴离于交换剂结合，溶质在柱中停留时间就长。如固定相颗粒均匀、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型、盐析法盐析法的根据是蛋白质在稀盐溶液中，加之其表面经过机械涂渍（与气相色谱中固定相的制备一样），并形成了第一个层析峰，或改用竞争性抑制剂或变性剂等。显然。若在此蛋白质样品被洗出前，溶质于气-液两相间的分配可用分配系数Kg描述、回收样品、核酸，故pH梯度溶液可以自动形成。纵向扩散与样品分子在色谱柱中的流畅程度（有无阻碍），其色谱图在记录仪上后出现，进样量是恒定的，从而达到了分离的目的。事实上。 1、提高分辨率是有益的，前者进行反应时，微孔浅

⑻ 蛋白纯化阴离子交换，缓冲液带什么电荷

既然是阴离子交换，就要让目标蛋白带负电，那么缓冲液PH就要大于等电点。缓冲体系的选择也很重要，一般用TRIS-HCl，特别是弱阴离子柱不可选用带负电强的磷酸盐缓冲液，否则上样液中被交换的将是磷酸根而不是目标蛋白。一般用NaCl平衡后上样进行离子交换，然后再用较强的阴离子洗脱。