离子交换色谱法纯化核苷酸

A. 离子交换层析法分离单核苷酸 求一份实验结果

氨基酸的分离鉴定——纸层析法
一,实验目的
掌握氨基酸纸层析的方法和原理,学会分析待
测样品的氨基酸成分.
二,实验原理
纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析.滤纸纤维上的羟基具有亲水性,吸附一层水作为固定相,有机溶剂为流动相.当有机相流经固定相时,物质在两相间不断分配而得到分离.
溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示:
Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离
在一定的条件下某种物质的Rf值是常数.Rf值的大小与物质的结构,性质,溶剂系统,层析滤纸的质量和层析温度等因素有关.本实验利用纸层析法分离氨基酸.
三,实验器材
(1)大烧杯(5000mL):1只/组
(2)微量注射器(100 L):1只/ 组.
(3)喷雾器:公用.
(4)培养皿:1只/组.
(5)层析滤纸(长22cm,宽14cm的新华一号滤纸):1张/组.
(6)直尺,铅笔:自备.
(7)电吹风:1只/组.
(8)托盘,针,白线:1套/组.
(9)手套:1双/组.
(10)塑料薄膜:公用.
(11)小烧杯:50mL,1只/组.
四,实验试剂
(1)扩展剂:将4体积正丁醇和1体积冰醋酸放入分液漏斗中,与5体积水混合,充分振荡,静置后分层,弃去下层水层.
(2)氨基酸溶液:0.5%的已知氨基酸溶液3种(赖氨酸,苯丙氨酸,缬氨酸),0.5%的待测氨基酸液1种.
(3)显色剂:0.1%水合茚三酮正丁醇溶液.
实验试剂
五,实验操作
检查培养皿是否干燥,洁净;若否,将其洗净并置于干燥箱内120℃烘干.
(1)平衡:剪一大块塑料薄膜铺在桌面上,将层析缸或大烧杯到置于塑料薄膜上,再把盛有约20mL展层溶液的小烧杯置于倒置的层析缸或大烧杯中,用塑料薄膜密封起来,平衡20min.
(2)规划:带上手套,取宽约14cm,高约22cm的层析滤纸一张.在纸的下端距边缘2cm处轻轻用铅笔划一条平行于底边的直线A,在直线上做4个记号,记号之间间隔2cm,这就是原点的位置.另在距左边缘1cm处画一条平行于左边缘的直线B,在B线上以A,B两线的交点为原点标明刻度(以厘米为单位),参见左图.
(3)点样:用微量注射器分别取10mL左右的氨基酸样品(每取一个样之前都要用蒸馏水洗涤微量注射器,以免交叉污染),点在这四个位置上.挤一滴点一次,同一位置上需点2～3次,2～3mL/次,每点完一点,立刻用电吹风热风吹干后再点,以保证每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm.每人须点4个样,其中3个是已知样,1个是待测样品.
(4)层析:用针,线将滤纸缝成筒状,纸的两侧
边缘不能接触且要保持平行,参见图3-3.向培养皿中加入扩展剂,使其液面高度达到1cm左右,将点好样的滤纸筒直立于培养皿中(点样的一端在下,扩展剂的液面在A线下约1cm),罩上大烧杯,仍用塑料薄膜密封.当扩展剂上升到A线时开始计时,每隔一定时间测定一下扩展剂上升的高度,填入表3-1中.当上升到15～18cm,取出滤纸,剪断连线,立即用铅笔描出溶剂前沿线,迅速用电吹风热风吹干.
(5)显色:用喷雾器在通风厨中向滤纸上均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液,然后立即用热风吹干,即可显出各层析斑点,参见左图.
(6)计算各种氨基酸的Rf值,并判断混合样品中都有哪些氨基酸,各人将自己的实验结果贴在实验报告上,见表3-2.
(7)以层析时间为横坐标,扩展剂上升高度为纵坐标画图,求出扩展剂上升到18cm时所需要的时间.
(8)将微量注射器内外用蒸馏水清洗干净,倒掉用过的展层液和平衡液,将培养皿洗净,整理好桌面上的仪器和试剂

B. 简述离子交换色谱法

离子交换色谱法(ion exchange chromatography,IEC)
离子色谱分析法出现在20世纪70年代，80年代迅速发展起来，以无机、特别是无机阴离子混合物为主要分析对象。
离子交换色谱利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱的固定相一般为离子交换树脂，树脂分子结构中存在许多可以电离的活性中心，待分离组分中的离子会与这些活性中心发生离子交换，形成离子交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配。固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相互争夺固定相中的离子交换中心，并随着流动相的运动而运动，最终实现分离。
表达式
离子交换色谱的分配系数又叫做选择系数，其表达式为：

K_s=\frac{[RX^+]}{[X^+]}

其中[RX + ]表示与离子交换树脂活性中心结合的离子浓度，[X + ]表示游离于流动相中的离子浓度

分离原理
离子交换色谱（ion exchange chromatography，IEC）以离子交换树脂作为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆变换。根据组分离子对树脂亲合力不同而得到分离。

阳离子交换:

阴离子交换:

式中"－－"表示在固定相上，Kxy和Kzm是交换反应的平衡常数，Z+和X-代表被分析的组分离子。M+和Y-表示树脂上可交换的离子团。

离子交换反应的平衡常数分别为：

阳离子交换：

阴离子交换：

平衡常数K值越大，表示组分的离子与离子交换树脂的相互作用越强。由于不同的物质在溶剂中离解后，对离子交换中心具有不同的亲合力，因此具有不同的平衡常数。亲合力大的，在柱中的停留时间长，具有高的保留值。

固定相
离子交换色谱常用的固定相为离子交换树脂。目前常用的离子交换树脂分为三种形式，一是常见的纯离子交换树脂。第二种是玻璃珠等硬芯子表面涂一层树脂薄层构成的表面层离子交换树脂，第三种为大孔径网络型树脂。它们各有特点，例如第二种树脂有很高的柱效，但它的柱容量不大；第三种树脂适用于非水溶液中物质的分离，因为它们的孔径和内表面积大，不需要用水溶胀，便可满意地使用。

典型的离子交换树脂是由苯乙烯和二乙烯基苯交联共聚而成：

其中，二乙烯基苯起了交联和加牢整个构型的作用，其含量决定了树脂交联度大小。交联度一般控制在4％～16％范围内，高度交联的树脂较硬而且脆，也较渗透，但选择性较好。在基体网状结构上引入各种不同酸碱基团作为可交换的离于基团。

按结合的基团不同，离子交换树脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。阳离子交换树脂上具有与样品中阳离子交换的基团。阳离子交换树脂又可分为强酸性和弱酸性树脂。强酸性阳离子交换树脂所带的基团为磷酸基（一），其中和有机聚合物牢固结合形成固定部分，是可流动的能为其他阳离子所交换的离子。

阴离子交换树脂具有与样品中阴离子交换的基团。阴离子交换树脂也可分为强碱性和弱碱性树脂。

阴离子交换树脂属强碱性，它是由有机聚合物骨架和一季胺碱基团所组成，它带有正电荷。而与相反的是可以移动的部分，它能被其它阴离子所交换

流动相
离子交换色谱的流动相最常使用水缓冲溶液，有时也使用有机溶剂如甲醇，或乙醇同水缓冲溶液混合使用，以提供特殊的选择性，并改善样品的溶解度。

离子交换色谱所用的缓冲液，通常用下列化合物配制：钠、钾、被的柠檬酸盐，磷酸盐，甲酸盐与其相应的酸混合成酸性缓冲液或氢氧化钠混合成碱性缓冲液等。

C. 离子交换纤维素色谱法的介绍

离子来交换纤维素色谱法自，是将离子交换基团结合到纤维素上，制成离子交换纤维素的方法。1956年，Sober和Peterson首次将该方法成功地应用于蛋白质的分离。从此使生物大分子的分级分离方法取得了迅速的发展。离子交换基团不但可结合到纤维上，还可结合到交联葡聚糖（S-ephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）上。近年来离子交换色谱技术已经广泛应用于蛋白质、酶、核酸、肽、寡核苷酸、病毒、噬菌体和多糖的分离和纯化。

D. 四大色谱原理是什么

色谱法分类
按两相的物理状态可分为：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)。气相色谱法适用于分离挥发性化合物。GC根据固定相不同又可分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC)，其中以GLC应用最广。液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。LC同样可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)。此外还有超临界流体色谱法(SFC)，它以超临界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为流动相（常用CO2），因其扩散系数大，能很快达到平衡，故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。
按原理分为吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、排阻色谱法(EC，又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色谱法(GPC）和亲和色谱法,此外还有电泳。按操作形式可分为纸色谱法(PC)、薄层色谱法(TLC)、柱色谱法。四、色谱分离原理
高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。
1．液固色谱法
使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5~10μm。适用于分离分子量200~1000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。

2．液液色谱法
使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。
涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。
正相色谱法
采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。
反相色谱法
一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。
随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH1.5~10范围操作。
正相色谱法与反相色谱法比较表
正相色谱法 反相色谱法
固定相极性 高～中 中～低
流动相极性 低～中 中～高
组分洗脱次序 极性小先洗出 极性大先洗出
从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）。
3.离子交换色谱法
固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。
缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的pH值和离子强度影响。pH值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。
离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。
4.离子对色谱法
又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。
分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。
分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。
离子对色谱法常用ODS柱（即C18），流动相为甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10
mmol/L的离子对试剂，在一定的pH值范围内进行分离。被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其pH值、离子强度有关。
5．排阻色谱法
固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。

E. 离子交换色谱法是蛋白质纯化技术中的一种吗

是的，蛋复白质纯化技术分为制电泳和色谱法两种。离子交换色谱法是色谱法的一种，所以也是蛋白质纯化技术中的一种。其实在伯乐生命医学上有很详细的介绍，蛋白质纯化技术就是为了获得的蛋白质去除杂质而是用的各种方法，并且根据不同的蛋白质采用的方法也有所不同，蛋白质纯化的工作是较为复杂的。

F. 蛋白质、核酸等生物大分子为何能用离子交换色谱分离

因为他们来都带电荷啊，因为源你柱子上有相反的离子啊，他们可以通过离子键相互作用啊！
同时的柱子有孔径啊，可以将小的直接溜走，没有机会结合啊
可以让大的下来的更慢啊！

你满意不！

G. 某蛋白质等电点为8.14,如采用离子交换色谱法来纯化,如何选择填料和缓冲体系

我的话，第一步会选择pH7.0-7.4左右过阴离子交换，让大多数杂蛋白（大多数杂蛋白pI在6左右）、核酸、色素等杂质结合，收集流穿液，此时蛋白溶液的纯度和澄清度会大大提高，再校pH7.0或更低pH过阳离子交换进行纯化。讲究一点的话，在缓冲选择上可以区分一下阴阳离子缓冲，多数情况影响不大，不必纠结。

H. 离子交换色谱法的原理，装置及应用

原理：
离子交换色谱（ion exchange chromatography，IEC）以离子交换树脂作为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆变换。根据组分离子对树脂亲合力不同而得到分离。

装置：
（1）分离柱 装有离子交换树脂，如阳离子交换树脂、阴离子交换树脂或螯合离子交换树脂。为了减小扩散阻力，提高色谱分离效率，要使用均匀粒度的小球形树脂。最常用的阳离子交换树脂是在有机聚合物分子（如苯乙烯－二乙烯基苯共聚物）上连接磺酸基官能团（─SO3─）。最常用的阴离子交换剂是在有机聚合物分子上连接季铵官能团(─NH4)。这些都是常规高交换容量的离子交换树脂，由于它们的传质速度低，使柱效和分离速度都低。C.霍瓦特描述了一种薄膜阴离子交换树脂，它是在苯乙烯－二乙烯基苯共聚物核心上沉淀一薄层阴离子交换树脂，就象鸡蛋有一薄层外皮那样，离子交换反应只在外皮上进行,因此缩短了扩散的路径,所以离子交换速度高，传质快，提高了柱效。同样，在小颗粒多孔硅胶上涂一薄层离子交换材料也可得到相同类型的树脂。螯合离子交换树脂具有络合某些金属离子而同时排斥另一些金属离子的能力，因此这种树脂具有很高的选择性。除了离子交换柱外，其他高效液相色谱柱也可用于分离离子。
（2）抑制柱和柱后衍生作用 常用的检测器不仅能检测样品离子，而且也对移动相中的离子有响应，所以必须消除移动相离子的干扰。在离子色谱中，消除(抑制)移动相离子干扰的常用方法有两种。
①抑制反应，用抑制反应来改变移动相，使移动相离子不被检测器测出。离子色谱通常使用电导检测器。在抑制反应中??缍匝衾胱佣?裕?把高电导率移动相的氢氧化物转变成水,而样品离子则转变成它们相应的酸：
NaOH+H+─→Na++H2O
NaX+H+─→HX+Na+
在装有强酸性阳离子交换树脂的柱中进行抑制反应，使用一段时间后，这种树脂就需要再生，很不方便。改用连接有磺酸基(─SO3H)的离子交换膜(阳离子交换膜)或用连接有铵基(─NH4)的离子交换膜(阴离子交换膜)，就可以连续进行抑制反应。例如，阳离子交换膜可使阳离子通过它扩散过去，而阴离子则不能扩散过去。
1981年，T.S.史蒂文斯和斯莫尔等报道了中空纤维抑制法。这种纤维是由阳离子交换膜材料拉制而成。用这种方法不仅不需要再生抑制柱而且减小了峰的加宽，提高了柱效。一种比较新的膜技术是加一电场以加速离子的传递，该法与中空纤维法比较，其优点是反应时间短、交换能力高，并且可以用于阳离子和阴离子两者。
②柱后衍生作用，将从柱子流出的洗出液与对被测物有特效作用的试剂相混合，在一反应器中生成带色的络合物（见配位化合物）。对衍生试剂最重要的要求是它们与被测物能生成络合物，但不与移动相生成络合物。柱后衍生法能用于测定重金属离子，所用的衍生试剂有茜素红S等。
（3）检测器 分为通用型和专用型。通用型检测器对存在于检测池中的所有离子都有响应。离子色谱中最常用的电导检测器就是通用型的一种。紫外－可见分光光度计是专用型的检测器，对离子具有选择性响应。可变波长紫外检测器与电导检测器联用,能帮助鉴定未知峰,分辨重叠峰和提供电导检测器不能测定的阴离子，如硫化物及亚砷酸中的阴离子的检测。
在离子色谱中，电导检测法总是和抑制反应配合使用。这种检测器对分子不响应，如水、乙醇或者不离解的弱酸分子等。对于电导检测器，一个重要的条件是温度要稳定，所以检测池要放在恒温箱中，1982年H.萨托设计一种双示差电导检测器，消除了温度变化对检测的影响，可测定10-9摩尔的阴离子。

应用：
离子色谱主要用于测定各种离子的含量，特别适于测定水溶液中低浓度的阴离子，例如饮用水水质分析，高纯水的离子分析，矿泉水、雨水、各种废水和电厂水的分析，纸浆和漂白液的分析，食品分析，生物体液(尿和血等)中的离子测定，以及钢铁工业、环境保护等方面的应用。离子色谱能测定下列类型的离子：有机阴离子、碱金属、碱土金属、重金属、稀土离子和有机酸,以及胺和铵盐等。

I. 离子交换色谱产生的信号值是什么

离子交换来色谱中的固源定相是一些带电荷的基团， 这些带电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。如果流动相中存在其他带相反电荷的离子，按照质量作用定律，这些离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。固定相基团带正电荷的时候，其可交换离子为阴离子。这种离子交换剂为阴离子交换剂；固定相的带电基团带负电荷，可用来与流动相交换的离子就是阳离子，这种离子交换剂叫做阳离子交换剂。阴离子交换柱的功能团主要是－NH2，及－NH3 ：阳离子交换剂的功能团主要是－SO3H及－COOH。其中-NH3 离子交换柱及-SO3H离子交换剂属于强离子交换剂，它们在很广泛的pH范围内都有离子交换能力；-NH2及-COOH 离子交换柱属于弱离子交换剂，只有在一定的pH值范围内，才能有离子交换能力。离子交换色谱主要用于可电离化合物的分离，例如，氨基酸自动分析仪中的色谱柱，多肽的分离、蛋白质的分离，核苷酸、核苷和各种碱基的分离等。

J. 离子交换层析的发展

1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。上世纪40年代，出现了具回有稳定交换特性答的聚苯乙烯离子交换树脂。50年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用于氨基酸的分析。离子交换层析是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。常用的离子交换剂有：离子交换纤维素、离子交换葡聚糖和离子交换树脂 。