westerna液过滤

❶ Western Blot试验方面的问题在哪里可以找到详细介绍，谁能告诉我一些的生物科技论坛

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❷ 溶液过滤示意图

过滤常用的仪器有玻璃棒、烧杯、铁架台、漏斗，过滤时要注意以下几点： 一贴，版即滤纸紧贴漏斗权内壁； 二低，即漏斗内滤纸边缘低于漏斗口边缘，漏斗内液面低于滤纸边缘． 三靠，即倾倒液体时，盛浑浊液的烧杯嘴紧靠玻璃棒；玻璃棒末端轻靠漏斗内三层滤纸处；漏斗下端紧靠承接滤液的烧杯内壁． 为了防止液体外流，要用玻璃棒引流，使液体沿玻璃棒缓慢倒入漏斗中；为了防止液体溅出，漏斗下端要紧靠烧杯内壁，这两项在图示可以看出． 故答案为：（1）铁架台；烧杯；漏斗； （2）①未用玻璃棒引流；②漏斗下端未紧靠烧杯内壁． 分析： 依据过滤所用的仪器有铁架台、烧杯、漏斗、玻璃棒；过滤时的注意事项（一贴、而低、三靠），再观察图示解答即可． 点评： 正确实验的同时还要了解所用的仪器，图示改错首先考虑“三靠”，因为这些操作在图中可以看出．

❸ western 的步骤

1）按厂商的使用指南用两块干净的玻璃，平板和0.75mm垫片组装电泳装置中的玻璃平板夹层，并固定在灌胶支架上。
2）按表7.1配制分离胶液体并脱气，然后加入10%的过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌混匀。
表7.1 聚丙烯酰胺分离胶的配制
试剂成分 配制不同浓度分离胶所需试剂(ml)
5% 8% 10% 12% 15%
Acry:Bis (30:0.8) 2.50 4.00 5.00 6.00 7.50
4×Tris·Cl/SDS, pH8.8 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75
H2O 8.75 7.25 6.25 5.25 3.75
10%过硫酸铵 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
TEMED 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01
按所需分离的蛋白质分子大小选择合适的丙烯酰胺百分比浓度，一般地，5%的凝胶可用于60～200kDa的SDS变性蛋白质分子的分离，10%用于16～70kDa，15%用于12～45kDa。
3）用一根巴斯德吸管立即将分离胶液体沿夹层中一条垫片的边缘加入于玻璃平板夹层中，至凝胶约5cm高为止。样品体积少于10μl不需灌制积层胶。
4）用另一根巴斯德吸管，先从一边的垫片，再从另一边垫片往夹层的液面顶部缓缓加入一层水饱和异丁醇（厚约1cm）。让凝胶在室温聚合30min。
聚合后，可见在顶层异丁醇与凝胶的界面间有一清晰的折光线，胶的聚合失败往往问题在于过硫酸按或TEMED，或两者都有。
5)倾去顶层的异丁醇，并以1×Tris-Cl/SDS, pH8.8缓冲液冲洗凝胶的顶部表面,尽量用吸水纸吸干。
6)按表7.2配制积层胶液体，用吸管将液体沿一条垫片加入到玻璃平板夹层，直至夹层的顶部。
表7.2 聚丙烯酰胺积层胶的配制
GEL%（3.9%) Total (10.05ml)
Acry:Bis(30:0.8) 1.30 ml
4×Tris·Cl/SDS, pH6.8 2.50 ml
H2O 6.10 ml
10%过硫酸铵 0.05 ml
TEMED 0.01 ml
7)将0.75mm厚的梳子插入夹层的积层胶液体中，必要时，再补加积层胶液体充盈剩余空间。让积层胶室温聚合30min。
8)在具螺口盖的微量离心管中，用2×SDS加样缓冲液按1:1(v/v)稀释待测蛋白质样品，于100℃煮沸5-10min。如样品是蛋白质沉淀物，加入50～100μl 1×SDS加样缓冲液溶解之，并同样在100℃煮沸5-10min。按供应商的使用指南用2×SDS加样缓冲液溶解蛋白质分子量标准混合物。
对于0.3cm宽的加样孔，推荐加样体积以不超过20μl 为宜。用考马斯亮蓝染色法显迹，成分很复杂的蛋白质混合物需加25～50μg，而样品中只有一种或不多的几种蛋白的话，只需1～10μg蛋白量。采用银染显迹时，样品用量可减小10～100倍（按样品的复杂程度在小于20μl的体积溶有0.01～0.5ng蛋白样品不等）。
2×SDS加样缓冲液(loading buffer)配制：
成分 体积 (ml)
0.5M Tris·Cl (pH6.8) 12.5
20%SDS 11.5
Glycerin 10
2% Blue-Bromo-phenol 2.5
β-mercaptoethanol * 5.0
加H2O至总体积50 ml，分装
*β-mercaptoethanol 在临用前加入。
9）小心拔出梳子，避免撕裂聚丙烯酰胺凝胶加样孔。取出梳子后，以1×SDS电泳电泳缓冲液冲洗加祥孔，并以此缓冲液充满之。
10）按厂商指南将凝胶板固定到电泳装置的上缓冲液室（上槽），同时往下缓冲液室（下槽）加入推荐量的1×SDS电泳缓冲液。
11）将固定于上槽的凝胶板放入下槽中，并往上槽加入部分电泳缓冲液至刚好淹没凝胶的加样孔。
12）用带平嘴针头的50μl注射器将同样浓度的蛋白质样品等体积加入到样品孔中，小心加样使样品在孔的底部成一薄层，对照孔加入蛋白质分子量标准样品，如有空置的加样孔，须加等体积的空白1×SDS样品缓冲液，以防相邻泳道样品的扩散。
13)再往上槽加入余下的1×SDS电泳缓冲液。此操作缓慢小心，以防冲起样品孔中的样品。
14）连接电源，对于0.75mm厚的垂直板电泳，先在60V下电泳至溴酚蓝染料从积层胶进入分离胶，再将电压调至120V继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部为止。
15）关闭电源并撤去连接的导线，弃去电泳缓冲液。连同上槽一起将凝胶夹层取出。
16）将凝胶定位以便识别加样的顺序，将凝胶板从上槽解离出来，放在一叠吸水纸或纸巾上。
17）小心将封边的垫片抽出一半，并以此为杠杆橇起上面的玻璃平板，使凝胶暴露出来。
18）小心从下面的玻璃平板上移出凝胶，在凝胶的一角切去一小块以便在染色及干胶后仍能认出加样次序，接着就可进行蛋白质的检测。
19)转膜
将凝胶面与负极相连，硝酸纤维素膜与正极相连。（100V，1小时）要放于4℃。
20)、清洗
将硝酸纤维素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分钟。摇床摇动。
21)、封闭
22)、一抗孵育
一抗用TBST1:1000稀释，将硝酸纤维素膜放入其中，37℃孵育1.5小时，(或4℃过夜)摇床摇动。
23)、清洗
将硝酸纤维素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分钟。
24)、二抗孵育
二抗用TBST1:8000稀释，将硝酸纤维素膜放入其中，37℃孵育1小时，摇床摇动。
25)、清洗
同22，之后，用1X TBS在清洗2次，每次5分钟，以洗去膜上的Tween 20，因为它可以阻碍底物的沉积。
26)、显色
按如下配方配制显色液：
1mL水+1滴（大约50微升）试剂A(之后混匀)+1滴试剂B+1滴试剂C
将硝酸纤维素膜放入其中孵育，一旦显色，立即放入去离子水中终止反应。

❹ 荧光western blot应注意些什么

荧光western blot注意事项

1. 抗体浓度应当优化，在几种不同稀释度的抗体中孵育膜。选择信噪比最高的稀释度。

2. 从化学发光转到荧光检测时，一抗浓度应当增加

3. 许多封闭液都成功用于荧光检测。建议使用5% 酪蛋白、最多5%的脱脂奶粉，或最多3% BSA，溶于TBST中。

4. 缓冲液中的颗粒可能停留在膜上，并造成荧光假象。只使用高质量的试剂，并对所有缓冲液过滤灭菌。

5. 使用钝的镊子从边缘操作。避免划破膜或弄皱，这会在荧光检测时造成假象。

6. 使用铅笔来标记膜，因为许多墨水都会发出荧光。

7. 溴酚蓝会发出荧光。确保染料与样品已分开，切掉凝胶上包含染料的部分，或省掉样品缓冲液中的溴酚蓝。

8. 无需在暗处开展免疫检测；正常的室内灯光不会使荧光标记的抗体发生光漂白。

9. 在处理膜时，使用无粉末的手套，以避免膜上出现假象或指纹。

❺ western blotting 的过程和原理

什么理论过程？就是原理呗？
WesternBlot原理、显色分类及操作步骤
一、原理
与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。既可以定性，又可以半定量的Western是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。
western显色的方法主要有以下几种：
i.放射自显影
ii.底物化学发光ECL
iii.底物荧光ECF
iv.底物DAB呈色
现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
二、操作步骤：
(一)配胶
1、注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。
分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100,分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000,15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）即可，如室温较低可升高10%AP及TEMED浓度到《分子克隆》建议浓度。
2、封胶：
灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。封胶后切记，勿动。
待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。片刻后倒掉SDS，将玻璃板倒立放置片刻控净。
3、灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。
(10%的AP最好现配现用，如在4℃存放勿超过两周。30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉.)
(二)样品处理
1．培养的细胞（定性）：
⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
⑵对于6孔板来说每孔加200~300μl，60~80℃的1×loadingbuffer。
⑶100℃，1min。
⑷用细胞刮刮下细胞后在EP管中煮沸10min，期间vortex2~3次。
⑸用干净的针尖挑丝，如有团块则将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，则可以将EP管置于0℃后在14000~16000g离心2min，再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可通过使用1ml注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。
⑹待样品恢复到室温后上样。
2．培养的细胞（定量）：
⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
⑵加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。
⑶用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。
⑷12000g离心，4℃，2min。
⑸取少量上清进行定量。
⑹将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loadingbuffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loadingbuffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。
3．组织：
⑴匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。
⑵12000g离心，4℃，2min。
⑶取少量上清进行定量。
⑷将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loadingbuffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loadingbuffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。
(裂解液配方：Tris-Cl(pH7.4)20mM，EDTA1mM
由于蛋白酶抑制剂可影响蛋白定量，且新鲜蛋白很少降解，故可不加，如加按建议比例即可。提取磷酸化的蛋白还需加Na3VO40.1mM及NaF25mM）。
1×loadingbuffer配方：10%甘油，50mMTris•Cl(pH6.8)，2%β-巯基乙醇，0.2~0.5‰溴酚蓝，2%或5%的SDS。Buffer可配成2×~5×，注意SDS终浓度勿超过10%。
对于心脏，肌肉等碎屑较多的组织可用5%的SDS，肝肾等组织2%即可。)
(三)电泳
1．上样前将胶板下的气泡赶走。
2．所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1×loadingbuffer上样，Marker也用1×loadingbuffer调整至与样品等体积。
2．以初始电压为45V时的电流强度进行稳流电泳，当电压达65V时改为稳压电泳。
3．在目的蛋白泳动至距胶下缘1cm以上结束。
电泳液配方：Tris-base3g,glycine14.4g,0.1%SDS（10ml10%SDS）/L
Tris-base1.5g,glycine7.2g,0.1%SDS（5ml10%SDS）/0.5L
(四)转膜
1．电泳结束前20分钟左右戴上手套开始准备：
湿转使用常规电转液：Tris3.0g，Gly14.4g，M-OH200ml，加去离子水至1,000ml。干转则取此转移液，每50ml加入10%SDS180ul。
浸泡NC膜：将NC膜平铺于去离子水面，靠毛细作用自然吸水后再完全浸入水中10min以排除气泡，随后浸泡入转移液中。PVDF膜则在M-OH中浸泡20min以上后转入转移液中。将滤纸也浸入转移液中。
2．取胶：
将胶卸下，保留30-100KD或分子量范围更广些的胶（以便以后杂其他感兴趣的蛋白），左上切角，在转移液中稍稍浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按顺序铺上膜与每侧一张（干转每侧三张）滤纸。注意用玻棒逐出气泡，剪去滤纸与膜的过多部分（尤其是干转，以防止短路）
3．转膜：
湿转：电转槽用去离子水淋洗晾干，加入1,000ml电转液。将胶平铺于海绵上，滴加少许电转液再次驱赶气泡，封紧后放入电转槽，注意膜在正极一侧。降温，将电泳槽置于冰水混合物中。恒流100mA过夜，或400mA，4h。注意不同蛋白的要求不同。
干转：用电转液淋洗石墨电极，滤纸吸干，铺上胶，再滴少许电转液，以1.5mA/cm2凝胶面积转移1-2小时。负载电压不宜超过1V/cm2胶面积。
电转液配方：Tris-base3g,glycine14.4g,200ml甲醇/1L
(五)封闭及杂交
1．封闭：
将膜从电转槽中取出，去离子水与PBST或TTBS稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时。必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带，再用去离子水和TTBS将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白marker则可省略此步。
2．结合一抗：
一抗的准备：使用反贴法时每张3×9cm2膜约需2ml一抗稀释液。
反贴法的操作：含一抗的封闭液滴加于摇床的塑料膜上，将Western膜从封闭液中取出，滤纸贴角稍吸干，正面朝下贴在一抗上，注意不要留下气泡，室温下轻摇孵育一小时或4℃静置过夜。在反应体系外面罩一湿润平皿以防止液体过多蒸发。
3．洗涤：
一抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。
4．结合二抗：
根据一抗来源选择合适的二抗，根据鉴定方法选择HRP或AP标记的抗体，按相应比例稀释（1:1000~1:10000），室温轻摇一小时。
5．洗涤：
二抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。
PBST：1×PBSTTBS：Tris-HCl20mM,pH7.4(25℃)
Tween-200.01%~0.02%NaCl150mM
Tween-200.05%
封闭液与抗体溶剂均为含5%脱脂奶粉的PBST或TTBS，临用时取200mlPBST或TTBS加入10g脱脂奶粉即为封闭液。
(六)发光鉴定
一般使用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法或碱性磷酸酶AP-NBT/BICP显色法。
1．HRP-ECL发光法：
将A、B发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min左右）后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。
2．AP-NBT/BICP显色法：
每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前将一片分装在30个EP管中，每张3×9cm的膜取一管配成1ml即可。将PBST或TTBS洗涤过的膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物体（如报纸）遮挡光线，显色20s后每10s观察一次，至条带明显或有本底出现时将膜揭起置去离子水中漂洗后放滤纸上晾干即可观察与扫描。
背景深浅与一抗的质量及二抗的量有关，当然如果暴光时间长达半小时，出现背景是正常的。
三、注意事项：
增强敏感性
若目的条带未出现，或很淡，可试用以下方法增强发光强度：
用清水漂洗膜数分钟，重加发光液进行曝光，可延长曝光时间。
将膜在PBST或TTBS中洗涤30min或更长，期间至少换2次液。
封闭40~60min
一抗杂交，室温1h。37℃1h会更强，但可能增加非特异条带。
PBST或TTBS洗膜20min，期间换2次液。
二抗杂交，37℃1h。
PBST或TTBS洗膜20min，期间换2次液。
发光鉴定。
若条带仍未出现或很淡，可以再用PBST或TTBS洗涤膜20min，期间换2次液。
10．三抗杂交，室温1h。37℃1h会更强，但可能增加非特异条带。三抗即抗二抗的二抗，比如二抗用羊抗兔，此时三抗可以选择兔抗羊或鼠抗羊等。
11．PBST或TTBS洗涤膜20min，期间换2次液。
12．发光鉴定。
一抗溶液中加入0.2%叠氮钠后可4℃存放至少2周（一个月我也用过，没问题，再长时间还没试）
(七)NC膜的多次使用
一张NC膜可使用多次，对多种蛋白进行杂交，步骤与“七．增强敏感性”相近。
如前次杂交结果条带距离本次杂交的蛋白的预计位置差别较大则只需用PBST洗涤掉发光液（10min×3次）后从一抗杂交开始，后续步骤同前。
如前次杂交结果条带距离本次杂交的蛋白的预计位置较近则需更强的洗涤，可用strip液（可用杂交袋）于室温摇动洗涤30min~60min，然后用PBST洗涤10min×3次，再从封闭开始，后续步骤同前。
对于杂交若干次的膜，如果常规洗涤方法不易去掉众多条带，可用强度更强的自配的strip液（可用杂交袋）于50℃洗涤30min，然后用PBST洗涤10min×3次，再从封闭开始，后续步骤同前。

❻ 有人有western blot的Tris-乙酸胶的配方吗还有相关电泳液的配方急！急！急！非常感谢！

一、SDS-PAGE电泳所用溶液：

1）30 %聚丙烯酰胺溶液 (100 mL)

丙烯酰胺 (Arc) 29 g

N,N’-亚甲双丙烯酰胺 (Bis) 1 g

用双蒸水定容至100mL，过滤备用，4℃存放

丙稀酰胺29.2g，N-N-甲叉双丙稀酰胺0.8g，加入去离子水定容至100mL，pH值不能超过7.0，过滤于棕色玻璃瓶中4℃贮存。

2）5×Tris-甘氨酸缓冲液 (1 L)

Tris碱 15.1 g

甘氨酸(电泳级) 94 g

10 %SDS 50 mL

使用时稀释5倍使用

3）2×SDS凝胶加样缓冲液(10mL)

0.5 mol/L Tris-Cl (pH 6.8) 2 mL

10％(W/V)SDS 4 mL

甘油 2 mL

β-巯基乙醇 1.0 mL

(DTT（二硫苏糖醇） 0.31g)

溴酚兰 0.02g

双蒸水 0.5 mL

室温存放备用

4）考马斯亮蓝染色液

考马斯亮蓝R-250 （G-250） 1.0 g

甲醇 450 mL

冰醋酸 100 mL

ddH₂O 450 mL

0.2g考马斯亮蓝R250+84mL 95％乙醇+20mL冰醋酸，定容至200mL，过滤备用

5）考马斯亮蓝脱色液（甲醇脱色液效果好，但有毒性）

甲醇 100 mL

冰醋酸 100 mL

ddH₂O 800 mL

医用酒精：冰醋酸：水=4.5：0.5：5(V：V：V)

二、SDS-PAGE所需溶液:

A液——30％丙稀酰胺（W/V）：丙稀酰胺29.2g，N-N-甲叉双丙稀酰胺0.8g，加入去离子水定容至100mL，pH值不能超过7.0，过滤于棕色玻璃瓶中4℃贮存。B液——1.5mol/L Tris·HCl，pH8.8：18.17g（9.09g）Tirs碱，溶于80mL（40mL）去离子水中，加入约3mL(1.5mL)以上的浓盐酸调节pH值至8.8，定容至100mL（50mL）。C液——1.5mol/L Tris·HCl，pH6.8：12.1g（6.05g）Tirs碱，溶于80mL（40mL）去离子水中，加入约7mL(3.5mL)以上的浓盐酸调节pH值至6.8，定容至100mL（50mL）。D液——10％SDS：10g (2g)SDS溶于去离子水中，定容至100mL(20mL)，加热至68℃助溶。E液——10％过硫酸铵：5g(0.5g)过硫酸铵，溶于50mL(5mL)去离子水中；现配现用或分装至0.5mL离心管中冷冻备用。

F液——TEMED(N-N-N`-N`－四甲基乙二胺)原液，室温保存。

三、配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液

与westerna液过滤相关的资料