⑴ 制备固定化酶的方法有哪些竞争性抑制剂有何特征如何消除它对酶的抑制作用
1固定化酶的传统制备方法
1.1吸附法
吸附法是利用物理吸附法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。
显著特点是：
工艺简便及条件温和，包括无机、有机高分子材料，
吸附过程可同时达到纯化和固定化；
酶失活后可重新活化，
载体也可再生。
但要求载体的比表面积要求较大，有活泼的表面
1.2包埋法
包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子结构或微囊结构等多空载体中，而底物仍能渗入格子或微囊内与酶相接触。这个方法比较简便，酶分子仅仅是被包埋起来，生物活性被破坏的程度低，但此法对大分子底物不适用。
(1)网格型
将酶或包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法。
(2)微囊型
把酶包埋在由高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。由于形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。
1.3结合法
酶蛋白分子上与不溶性固相支持物表面上通过离子键结合而使酶固定的方法，叫离子键结合法。其间形成化学共价键结合的固定化方法叫共价键结合法。共价键结合法结合力牢固，使用过程中不易发生酶的脱落，稳定性能好。
该法的缺点是载体的活化或固定化操作比较复杂，反应条件也比较强烈，所以往往需要严格控制条件才能获得活力较高的固定化酶。
1.4交联法
交联法是用多功能试剂进行酶蛋白之间的交联，使酶分子和多功能试剂之间形成共价键，得到三向的交联网架结构，除了酶分子之间发生交联外，还存在着一定的分子内交联。多功能试剂制备固定化酶方法可分为：
(1)
单独与酶作用；
(
2)
酶吸附在载体表面上再经受交联；
(
3)
多功能团试剂与载体反应得到有功能团的载体，再连接酶。交联剂的种类很多，最常用的是戊二醛，其他的还有异氰酸衍生物、双偶氮二联苯胺、N，N-乙烯马来酰亚胺等。
交联法的优点是酶与载体结合牢固，稳定性较高；缺点是有的方法固定化操作较复杂，进行化学修饰时易造成酶失活
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竞争性抑制剂与被抑制的酶的底物通常有结构上的相似性，能与底物竞相争夺酶分子上的结合位点，从而产生酶活性的可逆的抑制作用。与酶的活性中心相结合。与酶的结合是可逆的。
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增大底物浓度可以减弱竞争性抑制剂的影响。
⑵ 在本实验中使用了有机溶剂纯化多糖，有其他替代的试剂或方法吗
多糖（polysacharides，PS），又称多聚糖，是由个以上的单糖通过苷键连接而成的，具有广泛生物活性的天然大分子化合物。它广泛分布于自然界高等植物、藻类、微生物（细菌和真菌）与动物体内。20世纪60年代以来，人们逐渐发现多糖具有复杂的、多方面的生物活性和功能[1]：(1)多糖可作为广谱免疫促进剂，具有免疫调节功能，能治疗风湿病、慢性病毒性肝炎、癌症等免疫系统疾病，甚至能抗AIDS病毒[2]。如甘草多糖具有明显的抗病毒和抗肿瘤作用[10]，黑木耳多糖、银杏外种皮多糖和芦荟多糖可抗肿瘤和增强人体免疫功能[3-5]。(2)多糖具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂、促进核酸与蛋白质的生物合成作用。如柴胡多糖具有抗辐射，增强免疫功能等生物学作用[6]，麦冬多糖具有降血糖及免疫增强作用[7-8]，动物黏多糖具有抗凝血、降血脂等功能[9]。(3)多糖能控制细胞分裂和分化，调节细胞的生长与衰老。如爬山虎多糖具有抗病毒和抗衰老作用[10]，银杏外种皮粗多糖具有抗衰老、抗过敏、降血脂、止咳祛痰、减肥等功能[11]。
另外，多糖作为药物，其毒性极小，因而多糖的研究已引起人们极大的兴趣。
由于多糖具有的生物活性与其结构紧密相关，而多糖的结构又是相当复杂的，所以在这一领域的研究相对缓慢。但人们在多糖的分离提取与纯化方面已做出了不少工作。
1. 多糖的提取[12]
1.1 热水浸提法：
1.1.1多糖提取条件的优选
根据文献报道[13]：影响热水浸提多糖的因素主要有提取时间、提取次数、溶剂体积、浸提温度、pH值、醇析浓度和植物颗粒大小等。在试验前对上述多种因素利用正交实验法做出优选，才能选出最佳提取方案。
1.1.2其步骤为：原料→粉碎→脱脂→粗提（2－3次）→吸滤或离心→沉淀→洗涤→干燥
首先除去表面脂肪。原料经粉碎后加入甲醇、乙醚、乙醇、丙酮或1：1的乙醇乙醚混合液，水浴加热搅拌或回流1－3小时，脱脂后过滤得到的残渣一般用水作溶剂（也有用氢氧化钾碱性水液、氯化钠水液、1％醋酸和1％苯酚或0.1－1M氢氧化钠作为提取溶剂）提取多糖。温度控制在90－100℃，搅拌4－6小时，反复提取2－3次。得到的多糖提取液大多较粘稠，可进行吸滤。也可用离心法将不溶性杂质除去，将滤液或上清液混合（得到的多糖若为碱性则需要中和）。然后浓缩，再加入2－5倍低级醇（甲醇或乙醇）沉淀多糖；也可加入费林氏溶液或硫酸铵或溴化十六烷基三甲基铵等，与多糖物质结合生成不溶性络合物或盐类沉淀。然后依次用乙醇、丙酮和乙醚洗涤。将洗干后疏松的多糖迅速转入装有五氧化二磷和氢氧化钠的真空干燥器中减压干燥（若沉淀的多糖为胶状或具粘着性时，可直接冷冻干燥）。干燥后可得粉末状的粗多糖。
1.2 微波辅助提取法：
其原理为利用不同极性的介质对微波能的不同吸收程度，使基体物质中的某些区域和萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使萃取物质从基体或体系中分离出来，进入到介电常数小，微波吸收能力较差的萃取剂中[14]。
由于微波能极大加速细胞壁的破裂，因而应用于中草药中有效成分的提取能极大加快提取速度，增加提取产率。而且由于其选择性好，提取后基体能保持良好的性状，提取液也较一般的提取方法澄清[15]。
聂金源等在柴胡多糖和黄酮化合物的提取[18]中对微波辅助提取法、超声辅助法和索氏提取法进行比较，发现微波辅助提取法所需时间最短（10min），多糖的提取率最高（28.46％）。
1.3 超声辅助法：
其原理是利用超声波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，另外超声波的次级效应，如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，利于提取[16]。
超声波辅助法与常规提取法相比，具有提取时间短、产率高、无需加热等优点[17]。
1.4 索氏提取法：
将植物粉末置于索氏提取器中，加入石油醚，60℃-90℃条件下提取至无色（一般为6小时）。过滤，滤渣挥发干燥完溶媒后加入80%乙醇，再提取6小时，过滤，滤渣乙醇挥发干燥后加蒸馏水。回流提取2次，趁热过滤，滤液减压浓缩，再除蛋白，醇沉，除色素。60℃干燥，称重。
1.5 醇提法：
先后将90%和50%乙醇加入植物粉末中，振荡充分再抽滤。滤液中加入足量无水乙醇，至于4℃冰箱中过夜。减压抽滤，再除去色素，得多糖粗品，在60℃通风干燥箱中干燥，再置干燥皿中恒重保存。
醇提法方法简单，易于操作，但提取率较低，乙醇使用量大，不宜大规模提取使用。
1.6 其它方法：
多糖的提取方法还有稀碱液浸提法、稀酸液浸提法、酶法等。但由于稀酸、稀碱条件下，易使多糖发生糖苷键的断裂，部分多糖发生水解而使多糖的提取率减少，因而很多试验中避免采用稀碱液浸提法和稀酸液浸提法。
2. 多糖的纯化
2.1 多糖中杂质除去方法 粗多糖中往往混杂着蛋白质、色素、低聚糖等杂质，必须分别除去。
2.1.1 除蛋白质
采用醇沉或其它溶剂沉淀所获得的多糖，常混有较多的蛋白质，脱去蛋白质的方法有多种：如选择能使蛋白质沉淀而不使多糖沉淀的酚、三氯甲烷、鞣质等试剂来处理，但用酸性试剂宜短，温度宜低，以免多糖降解。常用的方法有[19]：
2.1.1.1 沙维积法（Sevag法）[20]：根据蛋白质在氯仿等有机溶剂变性而不溶与水的特点，将多糖水溶液、氯仿、戊醇（或正丁醇）之比调为25:5:1或25:4:1，混合物剧烈振摇20到30分钟，蛋白质与氯仿－戊醇（或正丁醇）生成凝胶物而分离，然后离心，分去水层和溶剂层交界处的变性蛋白质。此种方法较温和，在避免降解上有较好效果，但效率不高，如五味子多糖的提取实验中要重复处理达三十几次。并且每次除去蛋白质变性胶状物时，不可避免的溶有少量多糖，另外少量多糖与蛋白质结合的蛋白聚糖和糖蛋白，在处理时会沉淀下来，造成多糖的损失。如能配合加入一些蛋白质水解酶，再用Sevage法效果更佳。
2.1.1.2 三氟三氯乙烷法[21]：多糖溶液与三氟三氯乙烷等体积混合，低温下搅拌10min左右，离心得上面水层，水层继续用上述方法处理几次，即得无蛋白质的多糖溶液，此法效率高，但溶剂沸点较低，易挥发，不宜大量应用。
2.1.1.3 三氯醋酸法：在多糖水溶液中滴加5％－30％三氯醋酸，直至溶液不再继续混浊为止，在5－10℃放置过夜，离心除去沉淀即得无蛋白质的多糖溶液。此法会引起某些多糖的降解。
Sevag法、三氟三氯乙烷法和三氯醋酸法三种方法均不适合糖肽，因糖肽也会像蛋白质那样沉淀出来。对于对碱稳定的糖蛋白，在硼氢化钾存在下，用稀碱温和处理，可以把这种结合蛋白质分开[1]。
2.1.1.4 酶解法[22]：在样品溶液中加入蛋白质水解酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶等，使样品中的蛋白质降解。通常将其与Sevag法综合使用除蛋白质效果较好。
2.1.1.5 盐酸法[23]：取样品浓缩液，用2mol/L盐酸调节其PH至3，放置过夜，在3000r/min条件下离心，弃去沉淀，即脱去蛋白质。
另有李知敏[23]和叶将瑜[25]等人分别在植物多糖实验中证明：盐酸法、三氯乙酸法及Sevag法脱蛋白率分别为72.5％、46.1％和42.3％，多糖的损失率分别为15.1%、6.1％和14.3％。盐酸法脱蛋白率高，但多糖的损失率也较高;三氯乙酸法较温和，但除蛋白效率不高；Sevag法的脱蛋白效果不及前两种。
2.1.1.6 其它方法：可以加入5%ZnSO4溶液和饱和Ba（OH）2溶液，振荡后离心去蛋白。此法除蛋白不够彻底，可结合Sevag法使用。还可在提取液中加入50%的TCA溶液至沉淀完全，在4000r/min的条件下离心10min，收集上清液，即为除蛋白液。还有人使用4:1的氯仿-乙醇溶液除蛋白，将混合液清摇，再静置，取上清液。此过程需重复多次方可除尽蛋白。
除去蛋白质的样品用紫外分光光度计检验，观察在280mm处是否有吸收，如果无吸收则表明蛋白质已经除尽[24]。
2.1.2 除色素
2.1.2.1活性炭（activated carbon）除色素[12]：活性炭属于非极性吸附剂，有着较强的吸附能力，特别适合于水溶性物质的分离。它的来源充足，价格便宜，上柱量大，适用于大量制备性分离。目前用于色谱分离的活性炭主要分为粉末状活性炭、颗粒状活性炭、锦纶活性炭三种。一般情况下，尽量避免用活性炭处理，因为活性炭会吸附多糖，造成多糖的损失。
2.1.2.2对于植物来源的多糖，可能含有酚型化合物而颜色较深，这类色素大多呈负性离子，不能用活性炭吸收剂脱色，可用弱碱性树脂DEAE纤维素或DuoliteA－7来吸附色素。
2.1.2.3若糖和色素时结合的，易被DEAE纤维素吸附，不能被水洗脱，这类色素可进行氧化脱色：以浓氨水或NaOH液调至PH8.0左右，50℃以下滴加H2O2至浅黄色，保温2小时。
2.1.2.4 依次用丙酮、无水乙醚和无水乙醇洗涤多糖，即可得到较为纯净的多糖。此法较为简单，便于操作，多糖损失也较小。
2.1.2.5 用4:1的氯仿-正丁醇除色素。操作简单，多糖有一定损失。
2.1.2.6发酵来源的多糖颜色一般较浅，色素含量较少，一般可不除色素。
2.1.2.7对于动物，微生物等提取得到的多糖也可根据不同情况按上述方法处理。
2.1.3 除低聚糖等小分子杂质
2.1.3.1采用逆向流水透析法。即准备好一桶蒸馏水，用一根导管将水通入透析袋的烧杯底部，另用一根导管将水引出，根据水量控制流速，使水缓慢流动48小时。这样得到的就是多糖的半精品。
2.1.3.2利用溶液浓度扩散效应，将分子量小的物质如无机盐、低聚糖等从透析袋渗透到袋外的蒸馏水中，不断换水即可保持浓度差，从而除尽小分子杂质。具体的做法是根据多糖溶液的体积截取相应长度的透析袋，用透析夹夹住一端，灌入多糖液，离液面2－3cm处夹紧透析袋，置于一大烧杯中，注入蒸馏水至完全浸没透析袋后，用磁力搅拌器慢速搅拌，每12小时换一次水，重复3－4次。
2.2 多糖的纯化方法 纯化是将多糖混合物分离为单一多糖的过程，纯化的方法主要有以下几种：
2.2.1 分部沉淀法 根据各种多糖在不同浓度的低级醇或丙酮中具有不同溶解度的性质，逐次按比例由小到大加入甲醇或乙醇或丙酮，收集不同浓度下析出的沉淀，经反复溶解与沉淀后，直到测得的物理常数恒定（最常用的是比旋光度测定或电泳检查）。这种方法适合于分离各种溶解度相差较大的多糖。为了多糖的稳定，常在pH7进行，唯酸性多糖在pH7时－COOH是以－COO` 离子形式存在的，需在pH2－4进行分离，为了防止苷键水解，操作宜迅速。此外也可将多糖制成各种衍生物如甲醚化物、乙酰化物等，然后将多糖衍生物溶于醇中，最后加入乙醚等极性更小的溶剂进行分级沉淀分离。
2.2.2 盐析法 在天然产物的水提液中，加入无机盐，使其达到一定浓度或饱和，促使有效成分在水中溶解度降低沉淀析出，与其它水溶性较大的杂质分离。常做盐析的无机盐的有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。
2.2.3 季铵盐沉淀法 季铵盐及其氢氧化物是一类乳化剂，可与酸性糖形成不溶性沉淀，常用于酸性多糖的分离。通常季胺盐及其氢氧化物并不与中性多糖产生沉淀，但当溶液的PH增高或加入硼砂缓冲液使糖的酸度增高时，也会与中性多糖形成沉淀。常用的季铵盐有十六烷基三甲胺的溴化物（CTAB）及其氢氧化物（cetyl trimethyl ammonium hydroxide，CTA－OH）和十六烷基吡啶（cetylpyridinm hydroride，CP－OH）。CTAB或CP－OH的浓度一般为1％－10％（W/V）的多糖溶液中，酸性多糖可从中性多糖中沉淀出来，所以控制季铵盐的浓度也能分离各种不同的酸性多糖。值得注意的是酸性多糖混合物溶液的PH要小于9，而且不能有硼砂存在，否则中性多糖将会被沉淀出来。
2.2.4 柱层析：包括纤维素柱层析、纤维素阴离子交换柱层析、凝胶柱层析、亲和层析、高压液相层析和其它柱层析。如用活性炭及硅胶做载体的柱层来分离多糖；或用硼砂型的离子交换树脂分离中性多糖。
纤维素柱层析 纤维素柱层析对多糖的分离既有吸附色谱的性质，又具有分配色谱的性质，所用的洗脱剂是水和不同浓度乙醇的水溶液，流出柱的先后顺序通常是水溶性大的先出柱，水溶性差的最后出柱，与分级沉淀法正好相反。
纤维素阴离子交换柱层析 最常见的交换剂为DEAE－纤维素（硼酸型或碱型），洗脱剂可用不同浓度的碱溶液、硼砂溶液、盐溶液等。此方法目前最为常用。它一方面可纯化多糖，另一方面还适于分离各种酸性多糖、中性多糖和粘多糖。
凝胶柱层析 凝胶柱层析可将多糖按分子大小和形状不同分离开来，常用的凝胶有葡聚糖凝胶（sephadex G）、琼脂糖凝胶（sepharose bio－gel A）、聚丙烯酰胺凝胶（bio－gel P）等，常用的洗脱剂是各种浓度的盐溶液及缓冲液，但它们的离子强度最好不低于0.02。出柱的顺序是大分子的先出柱，小分子的后出柱。由于糖分子与凝胶间的相互作用，洗脱液的体积与蛋白质的分离有很大的差别。在多糖分离时，通常是用孔隙小的凝胶如sephadex G－25、G－50等先脱去多糖中的无机盐及小分子化合物，然后再用孔隙大的凝胶sephadex G－200等进行分离。凝胶柱层析法不适合于粘多糖的分离。
亲和层析 用凝聚素（一般是蛋白质和糖蛋白）做亲和色谱来分离多糖。
高压液相层析
2.2.5 制备性区域电泳 分子大小、形状及所负电荷不同的多糖其在电场的作用下迁移速率是不同的，故可用电泳的方法将不同的多糖分开，电泳常用的载体是玻璃粉。具体操作是用水将玻璃粉拌成胶状、柱状，用电泳缓冲液（如0.05mol/L硼砂水溶液，PH9.3）平衡3天，将多糖加于柱上端，接通电源，上端为正极（多糖的电泳方向是向负极的），下端为负极，其单位厘米的电压为1.2－2V，电流30－35MA，电泳时间为5－12小时。电泳完毕后将玻璃粉载体推出柱外，分割后分别洗脱、检测。该方法分离效果较好，但只适合于实验室小规模使用，且电泳柱中必须有冷却夹层。
2.2.6 金属络合物法 常用的络合剂有费林溶液、氯化铜、氢氧化钡和醋酸铅等。
2.2.7 其它方法：纯化除采用上述方法外，还有超过滤法（多糖溶液通过各种已知的超过滤膜就能达到分离）、活性炭柱色谱。另据报道，国外多采用的LKB柱色谱系统，用比旋度、示差折射及紫外检测多糖，各组分的峰位自动记录，分离效果好且方便。
2.3 多糖纯度的鉴定
2.3.1超离心法 由于微粒在离心力场中移动的速度与微粒的密度、大小和形状有关，故当将多糖溶液进行密度梯度超离心时，如果是组分均一的多糖，则应呈现单峰。具体的做法是将多糖样品用0.1molNaCl或0.1molTris盐缓冲溶液配制成1％－5％的溶液，然后进行密度超离心，待转速达到恒定后（通常是60000r/min），采用间隔照明的方法检测其是否为单峰。
2.3.2高压电泳法 由于中性多糖导电性差、分子量大、在电场中的移动速度慢，故常将其制成硼酸络合物进行高压电泳。多糖的组成不同、分子量不同，其与硼酸形成的络合物就不同，在电场作用下的相对迁移率也会不同，故可用高压电泳的方法测定多糖的纯度。通常高压电泳所用的支持体是玻璃纤维纸、纯丝绸布、聚丙酰铵凝胶、纤维素醋酸酯薄膜等。缓冲液是PH9.3－12的0.03－0.1mol的硼砂溶液，电压强度约为30－50V/cm，时间是30－120min。由于电泳时会产生大量的热，所以要有冷却系统，将温度维持在0℃左右，否则会烧掉支持体。一般单糖、低聚糖因醛基而发生的颜色反应在多糖上不明显，电泳后常用的显色剂是p－茴香胺硫酸溶液（p－anisidine）和过碘酸希夫试剂等。
2.3.3凝胶柱层析 常用的凝胶是Sephadex、Sepharose、Sephacryl，展开剂为0.02－0.2molNaCl溶液或0.04mol吡啶与0.02醋酸1：1的缓冲溶液，柱高和柱直径之比大于40。
2.3.4旋光测定法 在多糖水溶液中加入乙醇使其浓度为10％左右，离心得沉淀。上清液再加入乙醇使其浓度为20％－25％，离心所得二次沉淀，比较二次沉淀的比旋度。如果比旋度相同则为纯品，否则为混合物。
2.3.5其它方法：官能团摩尔比恒定法，即如为纯品两次分离所得产物的官能团如－COOH、－NH2、－SO3H、－CHO等摩尔比应该恒定。类似的方法还有示查折射法、HPLC法等。此外德国常用高压液相法来检测多糖纯度，结果可靠。
必须注意的是：纯度检查一般要求有上述两种方法以上的结果才能肯定。
⑶ 提取基因组的方法
提取基因组DNA和细胞核DNA是不同的方法
提取细胞核要先把细胞破碎分离出细胞核，要在甘油或其他保护剂中进行
SDS十二烷基磺酸钠：可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离
CATB是一种抽提液，破坏细胞膜的~具体忘了~
DNA不溶于异丙醇，异丙醇可以析出DNA，产生白色絮状沉淀，用枪头挑出就可以了
以下是一些具体方法，希望有用
基因组DNA提取方法
制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。主要是CTAB方法，其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法,超声波法,研磨法,冻融法。2化学方式：异硫氰酸胍法,碱裂解法3生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等
试验步骤：
1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。
2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。试验步骤2再重新作一边。
3、加入5mlDNA提取缓冲液，(10mmol/LTris-cl,0.1mol/LEDTA,o.5%SDS),混匀。
4、加入25ul蛋白酶K,使终浓度达到100ug/ml,混匀，50℃水浴3h,
5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相
6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的LiCL,混匀，冰浴，10min.。
7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温10min。
2500rpm,离心10min。弃上清。
8、加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠(PH5.2)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。-20℃20min。
9、12000r/min,室温离心5min。弃上清。将DNA溶于适量TE中。
外周血DNA提取技术
分离外周血白细胞提取方法：
试验步骤：
1、取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10min。
2、小心吸取上层血浆，分装到3个0.5ml离心管中。
3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。
4、2500rpm离心10min，弃上清。
5、加入10ml溶血液，摇匀，冰浴15min。
6、3000rpm离心10min，弃上清。
7、倒置离心管，去掉残液。
8、得白细胞，－80?C冻存。
试验要求：
血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h，4℃放置不超过5h，以防白细胞自溶。
氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA：
试验试剂：
Ligsisbuffer：
133mMNH4ClNHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0.1mMEDTA0.5mMEDTA0.2ml；最后加灭菌去离子水至1000ml，高压灭菌。
ACD抗凝剂：柠檬酸1.68g柠檬酸钠4.62g葡萄糖5.15g；最后加灭菌去离子水至350ml，高压灭菌。
提取缓冲液（Extractionbuffer）：
10mMTrisCl(PH=8.0)1MTris.Cl(PH=8.0)1ml0.1mMEDTA(PH=8.0)0.5mMEDTA(PH=8.0)20ml0.5%SDS10%SDS0.5ml；最后加灭菌去离子水至100ml，高压灭菌
试验步骤：
1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分颠混至清亮。以4000rpm，离心5min。弃上清液。
2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl，充分匀浆。以6000rpm，离心5min。
3、彻底弃去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解细胞），混匀置于37℃，水溶1h。
4、加入8μl的蛋白酶K，颠混，37℃过夜（或55℃，3h，但是37℃效果要好些）。
5、每管加入450μl饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃10min，以5500rpm，离心15min。
6、取上清，每管加入250μl饱和酚和250μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。
7、取上清，每管加入500μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。
8、取上清，每管加50μl的3M的NaAC＋，适量无水乙醇（预冷）至满，摇匀放入-20℃保存2h以上。
9、以12000rpm，离心20min。去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，离心5min，去上清，50－60℃干燥。
10、加入50μl灭菌去离子水，转弹，混匀。
NaI提取法提取外周血白细胞基因组：
实验步骤：
1、取外周抗凝血（全血）100ul于eppendorf管中，12000rpm离心12min。
2、弃上清，加双蒸水200ul溶解，摇匀20s。
3、混匀后加6MNaI溶液200ul，摇匀20s。
4、加入氯仿/异戊醇（24：1）400ul，边加边摇，摇匀20s，12000rpm离心12min。
5、取上层液350ul，加入另一新eppendorf管中，加0.6倍体积异丙醇，摇匀20s，室温放置15min，静置后的反应体系15000rpm离心12min，使沉淀紧贴eppendorf管壁。
6、弃异丙醇，加70％乙醇1ml（不振动），以15000rpm离心12min。
7、弃乙醇，敞开eppendorf管盖，烘干（37℃恒温箱）后，加1xTE溶液30ul，溶解DNA＞12h以上，制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。
常用的外周血白细胞基因提取方法：
试验原理：
苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在1/103mol/LNaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。
试验步骤：
1、将1mlEDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5ml离心管中，加入1ml磷酸缓冲盐溶液（PBS），混匀，3500rpm离心15min,倾去含裂解红细胞的上清。重复一次。用0.7mlDNA提取液混悬白细胞沉淀，37℃水浴温育1h。
2、将上述DNA提取液混悬白细胞，37℃水浴温育1h后，加入1mg/ml蛋白酶K0.2ml,至终浓度为100-200ug/ml,上下转动混匀，液体变粘稠。50℃水浴保温3h，裂解细胞，消化蛋白。保温过程中，应不时上下转动几次，混匀反应液。
3、反应液冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管5-10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复酚抽提一次。加等体积的氯仿：异戊醇（24：1），上下转动混匀，5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复一次。
4、加入1/5体积的3mol/LNaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，即有乳白色云絮状DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA，转入另一1.5ml离心管中，加70%乙醇0.2ml，以5000rpm离心5min。洗涤DNA，弃上清，去除残留的盐。重复一次。室温挥发残留的乙醇，但不要让DNA完全干燥。加TE液20ul溶解DNA,置于摇床平台缓慢摇动，DNA完全溶解通常需12-24h。制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。
真核细胞DNA的制备
一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。
根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：
1、防止和抑制DNase对DNA的降解。
2、尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。
试剂准备：
1、TE:10mMTris-HCl(pH7.8);1mMEDTA(pH8.0)。
2、TBS:25mMTris-HCl(pH7.4);200mMNaCl;5mMKCl。
3、裂解缓冲液：250mMSDS;使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。
4、20%SDS
5、2mg/ml蛋白酶K
6、Tris饱和酚（pH8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿
7、无水乙醇、75%乙醇
试验步骤：
材料处理：
1、新鲜或冰冻组织处理：
1)取组织块0.3-0.5cm3,剪碎，加TE0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。
2)将匀浆液转移到1.5ml离心管中。
3)加20%SDS25ml，蛋白酶K(2mg/ml)25ml，混匀。
4)60°C水浴1-3hr。
2、培养细胞处理：
1)将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。
2)离心4000g×5min，去除上清液。
3)加10倍体积的裂解缓冲液。
4)50-55°C水浴1-2hr。
DNA提取：
1、加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。
2、离心5000g×10min，取上层水相到另一1.5ml离心管中。
3、加等体积饱和酚，混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。
4、加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。
5、加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。
6、加1/10体积的3M醋酸钠（pH5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。
7、待絮状物出现后，离心5000g×5min，弃上清液。
8、沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g×3min，弃上清液。
9、室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100mlTE溶解过夜。
植物组织中DNA的提取
试验原理：
脱氧核糖核酸（deoxribonucleicacid，DNA）是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中，盐溶法是提取DNA的常规技术之一。从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。DNA不溶于0.14mol/L的NaCl溶液中，而RNA则能溶于0.14mol/L的NaCl溶液之中，利用这一性质就可以将二者从破碎细胞浆液中分开。制备过程中，细胞破碎的同时就有Dnase释放到提取液中，使DNA因被降解而影响得率，在提取缓冲液中加入适量的柠檬酸盐和EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白质变性而与核酸分离，再加入阴离子去垢剂0.15％的SDS，经过2h搅拌，或用氯仿－异醇除去蛋白，通过离心使蛋白质沉淀而除去，得到的是含有核酸的上清液。然后用95％的预冷乙醇即可把DNA从除去蛋白质的提取液中沉淀出来。
植物DNA的SDS提取法：
试验试剂：
1、研磨缓冲液：称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L的NaOH调至pH7.0，并定容至1000ml。
2、10×SSC溶液：称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。
3、1×SSC溶液：用10×SSC溶液稀释10倍。
4、0.1×SSC溶液：用1×SSC溶液稀释10倍。
5、Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。
6、氯仿－异戊醇：按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。
7、5mol/L高氯酸钠溶液：称取NaClO4．H2O70.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。
8、SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。
9、1mol／LHCl。
10、0.2mol/LNaOH。
11、二苯胺乙醛试剂：1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml乙醛液〔浓乙醛：H2O＝1：50（V／V）〕。
12、1.0mol/L高酸溶液（HClO4）。
13、0.05mol/LNaOH。
14、DNA标准液：取标准DNA25mg溶于少量0.05mol.L-1NaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷却后用0.5mol/LHClO4定容至刻度，则得100μg/ml的标准溶液。
实验步骤：
1、称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中，加10ml预冷研磨缓冲液并加入0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。
2、将匀浆无损转入25ml刻度试管中加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，加上塞子，剧烈振荡30s，转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。以4000rpm离心5min。
3、离心形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。
4、将试管置72℃水浴中保温3min（不超过4min），以灭活组织的DNA酶，然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，加5mol/L高氯酸钠溶液〔提取液：高氯酸钠溶液＝4：1（V／V）〕，使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。
5、再次加入等体积氯仿－异戊醇混合液至大试管中，振荡1min，静置后在室温下离心（4000rpm）5min，取上清液置小烧杯中。
6、用滴管吸95％的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。
7、然后加入0.5ml左右的10×SSC，使最终浓度为1×SSC。
8、重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。
9、加入已处理的Rnase溶液，使其最后的作用浓度为50～70μg/ml，并在37℃水浴中保温30min，以除去RNA。
10、加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，在三角瓶中振荡1min，再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白，室温下以4000rpm离心5min，收集上层水溶液。
11、再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。
植物DNA的CTAB提取法：
试验步骤：
1、称取新鲜叶片2-3g，剪碎放入研钵中，在液氮中研磨成粉末。
2、将粉末转移到加有7ml经预热的15×CTAB提取缓冲液15ml离心管中，迅速混匀后置于65℃水浴中，温育30min。
3、取出离心管,冷却至室温，加入氯仿/异戊醇(24:1)，充分混匀，室温下2300转离心20min。
4、将上清转移至另一新的15ml离心管中，加入1/10体积10%的CTAB和等体积的氯仿/异戊醇。充分混匀，2300rpm离心20min。
5、转移上清至另一新的15ml离心管中，加入等体积1%的CTAB沉淀缓冲液，轻轻摇晃至形成DNA絮状沉淀。1000rpm离心10min，使DNA沉淀于管底。
6、加入1.5-2ml的1mol/LNaCl及5μlRNase置于56℃水浴中过夜。
7、待DNA完全溶解后，加2-3ml4℃预冷的95%的冰乙醇使DNA沉淀，挑出DNA，置于15ml离心管中，用70%乙醇清洗30min。
8、离心机甩5s，倒出70%乙醇，再用95%乙醇浸泡5min，倒出95%乙醇，在超净工作台上吹干。
9、将风干的DNA直接在4℃保存备用或溶于100μlTE溶液中于-20℃保存。
细菌DNA的提取方法
针对一些不易于提取的细菌的方法:
试验试剂：
抽提缓冲液：2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)（去色素）100mMTris-HCl(pH8.0)
25mMEDTA(pH8.0)2.0MNaCl
10MLiCl
2MLiCl
DEPC-water（抑制RNA酶活性）
3MNaAc(pH5.2)
96%乙醇
70%乙醇
试验步骤：
1、抽提缓冲液65℃预热。
2、加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65℃，10min。
3、加酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡，以12,000rpm，离心10min。
4、取上清，加氯仿/异戊醇（24：1）振荡，以12,000rpm，离心10min。
5、重复再作一次步骤4。
6、加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），－20C下沉淀。
7、以2,000rpm，离心10min。
8、弃上清，以70％乙醇条洗沉淀，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml水中。
较为常用的细菌DNA提取方法：
实验步骤：
1、将菌株接种于液体LB培养基，37℃震荡培养过夜。
2、取1.5ml培养物12000rpm离心2min。
3、沉淀中加入567ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h.
4、加入100ul5mol/LNaCl,充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min。
5、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min,将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。
6、沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇．
真菌DNA提取总结的两种方法：
第一种方法：
试验步骤：
1、取真菌菌丝0.5g,在液氮中迅速研磨成粉。
2、加入4mL提取液，快速振荡混匀。
3、加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋3～5min（此处是粗提没有加酚）。
4、以4℃，1000rpm，离心5min。
5、上清再用等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次。以4℃，10,000rpm，离心5min。
6、取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷的异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀,混匀,静置约30min。
7、用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500ulTE中。
8、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃下处理1h。
9、用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，离心5min。
10、取上清，加入1/10倍体积的3MNaAc,2.5倍体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上。
11、沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20℃保存备用。
DNA提取液：0.2MTris-HCl（pH7.5），0.5MNaCl，0.01MEDTA，1％SDS，3MNaAc。
第二种方法：
试验步骤：
1、真菌菌丝0.5-1g,在液氮中迅速研磨成粉。
2、加入3mL65℃预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65℃水浴30min,期间混匀2-3次。
3、加入1mL5MKAc，冰浴20min。
4、等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次（10,000rpm，4℃离心5min）。
5、取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇,混匀,静置约30min。
6、用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500ulTE中。
7、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃处理1h。
8、用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，离心5min。
9、取上清，1/10V3MNaAc,2.5V体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上。
10、沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20℃保存备用。
植物基因组提取(CATB法)
作者： 时间：2008-05-13 14:26:27 来源: 生物谷 浏览评论
一、实验目的
掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。
二、实验原理
通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。
十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。
三、实验材料
水稻幼叶
四、主要配方
2% CTAB抽提缓冲溶液: CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH8.0) 0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌, 冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇 （400ul） 氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。
五、实验步骤
1. DNA的提取
（1） 2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。
（2）取少量叶片（约1g）置于研钵中，用液氮磨至粉状；
（3） 加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；
（4） 将磨碎液分倒入1.5 ml的灭菌中，磨碎液的高度约占管的三分之二；
（5）置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，40 min后取出；
（6）冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇（24：1）至满管，剧烈振荡2~3 min，使两者混合均匀；
（7）放入离心机中10 000 rpm离心10 min，与此同时，将600 µl的异丙醇加入另一新的灭菌中；
（8） 10 000 rpm离心1 min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的内，将离心管慢慢上下摇动30 sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；
（9）10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上； （10）60 sec后，直立离心管，加入720 µl的75%乙醇及80 µl 5 M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；
（11）放置30 min，使DNA块状物的不纯物溶解；
（12）10000 rpm离心1 min后，倒掉液体，再加入800 µl 75%的乙醇，将DNA再洗 30 min；
（13）10000 rpm离心30 sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）；
（14）加入50 µl 0.5 × TE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱约15 h，使RNA消解；
（15）置于-20℃保存、备用。
2. DNA质量检测
琼脂糖电泳检测，原理和方法见实验二。
六、 注意事项
（1）叶片磨得越细越好。
（2）移液器的使用。
（3）由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。
⑷ 弱酸性阳离子交换树脂在何种水质条件下可以去除钠离子
在什么条件下也不能去除钠离子啊
这种树脂一般是用来去除碳酸根 碳酸氢根及其他碱性盐类或用作胰凝蛋白酶、细胞色素C、庆大霉素、激素(垂体)、胰岛素、溶菌霉、新链霉素等生化药物的分离提纯。。
⑸ 杂合超过5% 可以按照两套基因组处理吗
提取基因组DNA和细胞核DNA是不同的方法
提取细胞核要先把细胞破碎分离出细胞核,要在甘油或其他保护剂中进行
SDS十二烷基磺酸钠：可破坏细胞膜、核膜,并使组织蛋白与DNA分离
CATB是一种抽提液,破坏细胞膜的~具体忘了~
DNA不溶于异丙醇,异丙醇可以析出DNA,产生白色絮状沉淀,用枪头挑出就可以了
以下是一些具体方法,希望有用
基因组DNA提取方法
制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤,通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb.在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素,以保证DNA的完整性,为后续的实验打下基础.主要是CTAB方法,其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法,超声波法,研磨法,冻融法.2化学方式：异硫氰酸胍法,碱裂解法3生物方式:酶法.根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等
试验步骤：
1、贴壁细胞用胰酶消化,离心收集.
2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次,离心收集.试验步骤2再重新作一边.
3、加入5mlDNA提取缓冲液,(10mmol/LTris-cl,0.1mol/LEDTA,o.5%SDS),混匀.
4、加入25ul蛋白酶K,使终浓度达到100ug/ml,混匀,50℃水浴3h,
5、用等体积的酚抽提一次,2500rpm离心收集水相,用等体积的（酚,氯仿,异戊醇）混合物抽提一次,2500r/min离心收集水相
6、用等体积的氯仿,异戊醇抽提一次.加入等体积的5mol/L的LiCL,混匀,冰浴,10min..
7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管中.加入等体积的异丙醇.室温10min.
2500rpm,离心10min.弃上清.
8、加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠(PH5.2)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇.-20℃20min.
9、12000r/min,室温离心5min.弃上清.将DNA溶于适量TE中.
外周血DNA提取技术
分离外周血白细胞提取方法：
试验步骤：
1、取人肘静脉血5ml,EDTA抗凝,2500rpm离心10min.
2、小心吸取上层血浆,分装到3个0.5ml离心管中.
3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液,摇匀,冰浴15min.
4、2500rpm离心10min,弃上清.
5、加入10ml溶血液,摇匀,冰浴15min.
6、3000rpm离心10min,弃上清.
7、倒置离心管,去掉残液.
8、得白细胞,－80?C冻存.
试验要求：
血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h,4℃放置不超过5h,以防白细胞自溶.
氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA：
试验试剂：
Ligsisbuffer：
133mMNH4ClNHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0.1mMEDTA0.5mMEDTA0.2ml；最后加灭菌去离子水至1000ml,高压灭菌.
ACD抗凝剂：柠檬酸1.68g柠檬酸钠4.62g葡萄糖5.15g；最后加灭菌去离子水至350ml,高压灭菌.
提取缓冲液（Extractionbuffer）：
10mMTrisCl(PH=8.0)1MTris.Cl(PH=8.0)1ml0.1mMEDTA(PH=8.0)0.5mMEDTA(PH=8.0)20ml0.5%SDS10%SDS0.5ml；最后加灭菌去离子水至100ml,高压灭菌
试验步骤：
1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl,充分颠混至清亮.以4000rpm,离心5min.弃上清液.
2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl,充分匀浆.以6000rpm,离心5min.
3、彻底弃去上清,加入extractionbuffer500μl（裂解细胞）,混匀置于37℃,水溶1h.
4、加入8μl的蛋白酶K,颠混,37℃过夜（或55℃,3h,但是37℃效果要好些）.
5、每管加入450μl饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃10min,以5500rpm,离心15min.
6、取上清,每管加入250μl饱和酚和250μl氯仿－异戊醇,摇匀10min,以5500rpm,离心15min.
7、取上清,每管加入500μl氯仿－异戊醇,摇匀10min,以5500rpm,离心15min.
8、取上清,每管加50μl的3M的NaAC＋,适量无水乙醇（预冷）至满,摇匀放入-20℃保存2h以上.
9、以12000rpm,离心20min.去上清,加入70％乙醇500μl,以12000rpm,离心5min,去上清,50－60℃干燥.
10、加入50μl灭菌去离子水,转弹,混匀.
NaI提取法提取外周血白细胞基因组：
实验步骤：
1、取外周抗凝血（全血）100ul于eppendorf管中,12000rpm离心12min.
⑹ 氨基酸序列分析问题：已知一个七肽的组成为:gly,phe（2），tyr，met，asp，用胰凝乳蛋白酶水解
（2）是啥意思？
⑺ 细菌基因组的提取原理
一、实验原理
真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因组 DNA。真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。
蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离，EDTA则抑制细胞中Dnase的 活性；而蛋白酶K可将 蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。
二、仪器及试剂
1. 仪器：
恒温水浴锅、台式离心机、紫外分光光度计（GeneQuant）、移液器、玻璃匀浆器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌）
2. 试剂：
（1）细胞裂解缓冲液：
Tris (pH8.0) 100 mmol/L
EDTA (pH 8.0) 500 mmol/L
NaCL 20 mmol/L
SDS 10%
胰RNA酶 20ug/ml
（2） 蛋白酶K： 称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中，?C20℃备用。
（3）TE缓冲液（pH 8.0）：高压灭菌，室温贮存。
（4）酚?氯仿?异戊醇（25:24:1）、
（5）异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。
三、操作步骤
1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml 离心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20μl，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。
2.加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul 吸头挑出，凉干，用200ul TE 重新溶解。（可进行PCR反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行）
3.加等量的酚?氯仿?异戊醇振荡混匀，离心12000 rpm，5min。
4.取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿?异戊醇，振荡混匀，离心12000 rpm，5min。
5. 取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/L乙酸氨加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min ，离心12000 rpm ,10min。
6.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。
7.用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ， 5min。
8.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。
9.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存备用。
10.吸取适量样品于GeneQuant上检测浓度和纯度。
四、常见问题
1.选择的实验材料要新鲜，处理时间不易过长。
2.在加入细胞裂解缓冲液前，细胞必须均匀分散，以减少DNA团块形成。
3. 提取的DNA不易溶解：不纯，含杂质较多；加溶解液太少使浓度过大。沉淀物太干燥，也将使溶解变得很困难。
4. 电泳检测时DNA成涂布状：操作不慎；污染核酸酶等。
5.分光光度分析DNA的A280/A260小于1.8；不纯，含有蛋白质等杂质。在这种情况下，应加入SDS至终浓度为0.5%，并重复步骤2～8。
6.酚/氯仿/异戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸取：含高浓度的DNA，可加大抽提前缓冲液的量或减少所取组织的量。
基因组DNA提取方法2008-10-23 18:43制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。主要是CTAB方法，其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法超声波法研磨法冻融法。2化学方式：异硫氰酸胍法碱裂解法3生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等
试验步骤：
1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。
2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。试验步骤2再重新作一边。
3、加入5mlDNA提取缓冲液，(10mmol/LTris-cl0.1mol/LEDTAo.5%SDS)混匀。
4、加入25ul蛋白酶K使终浓度达到100ug/ml混匀，50℃水浴3h
5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相
6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的LiCL混匀，冰浴，10min.。
7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温10min。
2500rpm离心10min。弃上清。
8、加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠(PH5.2)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。-20℃20min。
9、12000r/min室温离心5min。弃上清。将DNA溶于适量TE中。
外周血DNA提取技术
分离外周血白细胞提取方法：
试验步骤：
1、取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10min。
2、小心吸取上层血浆，分装到3个0.5ml离心管中。
3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。
4、2500rpm离心10min，弃上清。
5、加入10ml溶血液，摇匀，冰浴15min。
6、3000rpm离心10min，弃上清。
7、倒置离心管，去掉残液。
8、得白细胞，－80?C冻存。
试验要求：
血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h，4℃放置不超过5h，以防白细胞自溶。
⑻ 用洗脱曲线说明ASP和lys的出峰次数并解释
应该是出峰顺序吧，先是Asp再Lys。阳离子交换树脂，Asp在pH5.3中带负电被排斥先洗出，Lys带正电与树脂交换。
⑼ 要测胰蛋白酶活，可是植物胰蛋白酶怎么制备啊
反胶束萃取制备胰蛋白酶
胰蛋白酶（EC 3 . 4 . 4 . 4 ）是从猪、牛等哺乳动物胰脏提取的一种以丝氨酸为活性中心的蛋白水解酶，可提高组织、血管的通透性、液化血块、血脓纤维及坏死组织等，用于治疗炎症、溃疡、创伤等引起的脓肿及支气管炎、肺气肿等。
( 1 ）工艺流程
( 2 ）主要步骤
① 制备粗酶液 称取定量粗胰酶，其胰蛋白酶活性为25 . 7U /mg，胰淀粉酶活性为18.4U/mg，胰脂肪酶活性为63.7U/mg。将其用pH 值为5 . 25 、浓度为0．2mol / L 的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解，然后进行真空过滤，收集滤液并用磷酸缓冲液进行稀释，使胰蛋白酶活性为3-10U / mg ，备用。
② 制备反胶束 将AOT置于100 ℃ 烘箱中干燥至恒重，放入干燥器中冷却至室温。然后称取44.4369 置于配制罐中，加入10L异辛烷，在搅拌下使其形成均匀的分散液，再加入定量蒸馏水，在200r/min的转速下处理2h ，获得浓度为0 .lmol / L 的透明AOT-异辛烷反胶束溶液。使用时用异辛烷稀释10 倍。
③ 萃取 将稀释10 倍的AOT-异辛烷反胶束置于萃取器中，按照AOT 异辛烷反胶束：粗酶溶液体积比为（2 -3 ) : 1 的比例加入粗酶溶液萃取3 - 4 次，，在300 - 400r / min 的转速下萃取5 -10min 。如此每次萃取完成后，均进行离心分离，离心机转速为4000 - 6000r / min ，时间10 -15min 收集、合并离心上层清液，进行反萃取，下层萃余液用于制备胰脂肪酶。
④ 反萃取 将荷载胰蛋白酶的AOT -异辛烷反胶束置于萃取器中，在搅拌下加入等体积的反萃取液进行反萃取15 -20min 萃取液为0．02 -0.05mol / L 的NaCI 溶液。如此反萃取3 次，每次萃取完成后，均进行离心分离，离心机转速为4000 -6000r / min,时间为15 -20min 。分别收集、合并离心上层清液和下层反萃取液，前者再生后可再次萃取胰蛋白酶，后者进行超滤浓缩。
⑤ 脱盐、浓缩 将反萃取液置于截留分子量2 万的超滤膜中，在0 . 1 ～0.2MPa 的压力下进行脱盐及浓缩处理，直至处理液体积降低至原液体积的1 / 5 左右时停止，获得脱盐浓缩液。
⑥ 干燥 将浓缩液置于冻干瓶中，在-60～-50 ℃ 、真空度为25～5OMPa 的条件下干燥24h ，获得纯化胰蛋白酶冻干粉。
( 3 ）主要指标
浅黄色粉末，胰蛋白酶的总萃取率为74 . 2 % ，胰蛋白酶活性为3145 . 3U/ mg ，纯化45 . 16 倍；胰淀粉酶活性为0 . 58U / mg ，降低4 . 66 倍；无脂肪酶活性。
实例234 猪胰中分离核糖核酸酶A、胰蛋白酶、凝乳蛋白酶和激肚释放酶
采用提取、盐析、反胶束、离子交换、凝胶分子筛层析等技术，可从猪胰脏中同时获得核糖核酸酶A 、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和激肤释放酶，有显著的经济效益。
( 1 ）用该方法同时制备上述四种酶的工艺流程
( 2 ）主要步骤
① 提取、盐析 取0.5kg 猪胰，除脂肪及结缔组织后绞碎，加入其3 倍质量的乙酸提取液搅拌提取24h 。提取液温度为4 ℃ ，pH 值为4 . 0 ，硫酸浓度为0．125mol / L 。提取完成后用4 层纱布过滤，收集滤过液约1250-1300mL ，在搅拌下加入约750g 固体硫酸钱溶解，使溶液达到75 ％饱和度。4000r / min 转速离心15min , 分别收集上层清液（约1500mL ）和盐析沉淀物（约40 -45g ）。
② 制备核糖核酸酶A 取收集的上层清液，在搅拌下加入固体硫酸铵溶解，使溶液达到85 ％饱和度。4 000r / min 转速离心15min ，弃清液。将沉淀溶于等体积蒸馏水，用10 ％乙酸钠调节pH 值为6 . 0 ，上用浓度为0 .0lmol / L 、pH6 .0磷酸缓冲液（PBS ) 平衡过的CM - SepharoseFF 柱，CM - SepharoseFF 用量与上柱液体积之比为1 : 5 ( g / mL ）。接着用2 倍树脂床体积的上述平衡缓冲液洗涤荷载核糖核酸酶A 的CM -SepharoseFF 色谱柱后，分别用0．01mol / L 、pH6 ．0和0．lmol / L 、pH7 . 5 磷酸缓冲液进行梯度洗脱，收集活性峰液，调节其pH 值为8 . 0 ，上用0．05mol / L 、pH 8 . 0 磷酸缓冲液平衡的Sephacryls -200 柱，Sephacryls -200 用量与上柱液体积之比为1 : 5 （g/mL ）。然后用同样的缓冲液梯度洗脱，收集活性峰液，进行透析、脱盐、冻干，获得核糖核酸酶A 冻干粉。
③ 制备胰蛋白酶取75 ％饱和度的硫酸钱盐析沉淀，用10 倍蒸馏水溶解，加入盐析沉淀质量30 ％的CaCI ：粉末，调节pH 值为8 . 0 ，再加入5 ～ 10mg 粗胰蛋白酶，于4 ℃ 下激活24h 。过滤除去硫酸钙沉淀，调节滤液pH 值为7 . 8 ，加入定量对氨基苯甲脒－sepharose6B ，搅拌下吸附lh ，纱布过滤，收集滤液用于分离其他酶。将吸附胰蛋白酶的对氨基苯甲眯一S 叩harose6B 树脂用pH 值为7 . 8 、浓度为0 . lmol / L Tris 一0 .05mol / L HCI 的缓冲液（含0 . lmol / L CaC12 ）抽滤洗涤，缓冲液用量为树脂体积的2 倍。洗涤完成后将树脂装柱，用其1 倍体积的相同缓冲液平衡。再用20 倍树脂体积的0 . lmol / L 甲酸-0 . 05mol / L KCI 缓冲液洗脱，洗脱液pH 值为2 . 2 ，洗脱流速为2 ～3 倍树脂体积／h 。收集洗脱活性峰进行透析，冻干，获得胰蛋白酶。
④ 弹性蛋白酶制备取未被对氨基苯甲脒-Sepharose6B 吸附的滤液，对水透析至透析管内产生沉淀时止。用400Or / min 的转速离心15min ，收集上层清液用于制备弹性蛋白酶。沉淀用5 ～ 6 倍体积的Tris-HCI 缓冲液溶解，该缓冲液浓度为0．02mol / L 、pH 值为8 . 8 。将溶解液用稀NaOH 调节pH 值为10 . 4 ，上用上述缓冲液平衡好的DEAE －纤维素柱，溶解液与DEAE -纤维素的比为（5 ～6 ) ： 1 ( mL / g ）。上柱完成后再用同样的缓冲液以2 ～3 倍树脂体积／h 的流速洗涤，缓冲液用量为1 倍树脂体积。弹性蛋白酶在此条件下不被交换，收集洗涤活性峰，对水透析，冻干，即得弹性蛋白酶。比活力2010U / mg ，活力回收10 ％。
⑤ α-糜蛋白酶制备 将制备弹性蛋白酶时的离心清液用乙酸钠调节pH 值为5 ．0，上用0 . lmol / L 、pH 5 . 0 柠檬酸缓冲液平衡的S- SepharoseFF 柱。用2 倍柱体积的、同样缓冲液以3mL / min 洗涤树脂，收集洗涤液待制备激肤释放酶。用300mL 0 . 01～0.05mol / L 、pH5.0柠檬酸缓冲液梯度洗脱，收集活性峰组分( 160 ～200mL ) ，透析，冻干，即得α-糜蛋白酶。
⑥ 胰糜蛋白酶制备 取制备弹性蛋白酶时的离心上层清液，用乙酸钠调节pH 值为3 . 5～ 4 . 0 ，加入等体积0.lmol / L AOT 反胶束，在200r /min 搅拌下萃取5min , 4000r / min 离心5min 。收集上层有机相，萃余液再用等体积0.lmol / L AOT 反胶束重复萃取2 次。合并有机相，加入等体积、含lmol / L KCI 、pH8.0的0.02mol / L 碳酸盐缓冲液，在200r /min 搅拌下反萃取5min , 60 00r/min 离心5min ，收集下层水相，萃余液同法反萃取2 次。合并反萃取液，对水透析脱盐，冻干，得胰糜蛋白酶。
⑦ 激肽释放酶制备 取用0.01mol/ L 、pH 5.0柠檬酸缓冲液洗涤S-SepharoseFF 柱的洗涤液，用柠檬酸调节pH 值为4 . 5 ，按洗涤液：丙酮=1：0.35 的比例加入丙酮，于-4 ℃ 冰箱中放置2h , 过滤。滤液中加入乙酸钠和NaCI ，使其浓度分别达到0.O65mol / L 和0.035mol / L 。继续加入丙酮，使体积比达到65 ％。抽滤，滤饼用少量蒸馏水溶解，用稀乙酸调节pH 值为4 . 2 ，再次产生沉淀。抽滤，滤饼用少量蒸馏水溶解后用稀乙酸钠调节pH 值为6 . 8 ，对水透析脱盐后上用浓度为0.1mol / L 、pH6 . 8 磷酸缓冲液平衡的轻基磷灰石柱，上柱液与经基磷灰石的比为（5 ～ 6 )：l ( mL / g ）。用0 . 01 ～0.2mol/L 、pH6 . 8 磷酸缓冲液以1～ 1 . 5 倍树脂柱体积／h 进行梯度洗脱，洗脱液用量约为上柱液体积的1～1 . 5 倍。收集活性峰组分，对水透析脱盐后加到经过重新平衡的另一羟基磷灰石柱上，改用0.05 ～0.2mol / L 、pH6 . 8 磷酸缓冲液进行梯度洗脱。收集活性峰组分，再次对水透析脱盐后，冻干，获得激肽释放酶。
( 3 ）主要指标
核糖核酸酶A 的活力回收≥75 。％，比活力为71000U/mg；胰蛋白酶的活力回收≥60 % ，比活力为23750U / mg ；弹性蛋白酶的活力回收≥10 % ，比活力为2010 U / mg ；胰糜蛋白酶活力回收≥70 % ，比活力为150U / mg ；胰激肤释放酶活力回收≥6 % ，比活力为130U / mg 。