cl4b凝胶过滤

① 什么是葡萄糖残基

葡萄糖残基，即糖残基，糖类物质水解之后得到的水解基团，一般由双糖或多糖类物质水解得到。糖苷一般由残基（糖残基）和配基（非糖部分）组成，糖的残基和配基之间的键称为苷键。多糖类物质由多个单糖残基以糖苷键连接形成的多聚物，例如直链淀粉和支链淀粉等。

糖原为无定形粉末，不溶于冷水，易溶于热水，其水溶液遇碘显棕红色。糖原能被α一淀粉酶水解。与支链淀粉类似，糖原也是由α-D-葡萄糖通过α-1，4-苷键和α-1，6-苷键连接成的多糖。糖原分支程度更高，支链更多、更短，每隔8～10葡萄糖残基就有一个支链，相对分子质量高达1×108。

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糖原存在于如肝脏和骨髂肌这些组织内的微小颗粒中；这些颗粒也含有紧密结合的糖原磷酸化酶和糖原合成酶。肝糖原的葡萄糖残基进行经常的非常快的转换，因为大量的葡萄糖和其它己糖从小肠到达肝脏，在经过暂时地以糖原贮存后，又再以血糖的形式离开肝脏。

并非糖原的高度分支结构的所有部分都以同样的速率转换。大多数葡萄糖残基的转换发生在外周分支，而糖原的内核结构代谢较为稳定，其转换速率很低。

② RNA反转录合成cDNA第一链后是以什么状态存在的

RNA反转录合成cDNA第一链后是以双链的稳定形式存在的。

cDNA构建分为六个阶段：

阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链

阶段2：cDNA第二链的合成

阶段3：cDNA的甲基化

阶段4：接头或衔接子的连接

阶段5：Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA

阶段6：cDNA与λ噬菌体臂的连接

cDNA 第一链的合成：

用亲和层析法得到 mRNA 后，根据 mRNA 分子的 3' 端有 poly (A) 尾结构的原理，用 12~20 个核苷酸长的 oligo （ dT ）与纯化的 mRNA 混合， oligo （ dT ）会与 poly (A) 结合作为反转录酶的引物，反转录反应的产物是一条 RNA-DNA 的杂交链。 oligo （ dT ）结合在 mRNA 的 3' 端，因此合成全长的 cDNA 需要反转录酶从 mRNA 分子的一端移动到另一端，有时这种全合成难以达到，尤其是 mRNA 链很长时，为此建立了一种随机引物法合成 cDNA 。随机引物是一种长度为 6~10 个核苷酸，由 4 种碱基随机组成的 DNA 片段。与 oligo （ dT ）仅与 mRNA 3' 端结合不同，它们可以在 mRNA 的不同位点结合。随机引物法合成的产物也是 RNA-DNA 的杂交体。把 cDNA 克隆到载体中之前，必须把这种杂交体中的 RNA 转变成 DNA 链，即形成双链DNA 分子。

③ 凝胶渗透柱层析

凝胶渗透层析就是按照溶质分子的大小不同而进行分离的一种层析技术。当溶质分子大小不同的样品溶液通过凝胶柱时，由于凝胶颗粒内部的网络结构具有分子筛效应，分子大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用。分子量大的因不易渗入网络，被排阻在颗粒之外，因而所受到的阻滞作用小，1.凝胶颗粒2.中分子3.小分子4.大分子先流出层析床，分子量小的因能渗透到网络图1、凝胶渗透层析原理示意图内部洗脱流程长，因而所受到的阻滞作用大，后流出层析床，这样就可以达到分离的目的。

凝胶层析的关键在于建立液固相平衡，然后以合适的洗脱速度将不同物质分离流出。温度高有利于快速建立液固相平衡。但是，温度高也造成溶质在液体中会扩散太快，导致分离效率降低。
目的是分离混合物，获得一定数量的纯净组分，这包括对有机合成产物的纯化、天然产物的分离纯化

④ 糖残基是什么

多糖类化合物
多糖类化合物是灵芝所含化学成分之一，现已证明，灵芝多糖类具有抗肿瘤作用、免疫调节作用、降血糖作用、降血脂作用、抗氧化作用和抗衰老作用，故灵芝多糖类是灵芝的主要有效成分。临床试验也证实，灵芝多糖可作为肿瘤化学治疗和放射治疗的有效辅助治疗药。有关灵芝多糖类的分离、纯化、结构确证的研究方兴未艾，迄今仍为国内外瞩目的重要课题。

一、灵芝多糖类的分离、纯化及鉴定

灵芝多糖类的分离、纯化及结构确证的方法及步骤可概括如下：多采用热水提取、分部沉淀的方式分离灵芝的多糖组分；进一步经各种层析如DEAE纤维素柱色谱、Sephadex G75柱色谱，凝胶过滤如Sepharose CL—4B凝胶过滤，高压电泳和聚丙酰胺凝胶电泳等处理可获纯化的多糖；后者经酸水解、纸色谱、气相色谱分析可确定其单糖组分，经酶水解可检测殊碳糖（anomeric）结构；经甲基化技术及Smith降解、气相色谱、气质联用、紫外及红外光谱分析、核磁共振等可确定多糖的连接方式和基本化学结构。多糖的分子量可通过凝胶柱色谱如SephadeaxG—100柱色谱、超离心测沉降系数等方法测定，一般在测得分子量范围后，求出平均分子量。

二、灵芝多糖类的理化特性

由于灵芝的种类、产地、分离提取方法各异，所获灵芝多糖的理化特性、分子量、单糖组分和连接方式不同，生物活性亦有差异。如Hiroshi等（1985）报道，赤芝子实体热水提取物经浓缩、透析及系列色谱后获得两种多糖ganoderan A和B。ganoderan A的分子量9 300，旋光度[α]D+58.8°，ganoderan B分子量3 600，旋光度[α]+33.3°，二者对小鼠均具降血糖作用。随后，他们又从赤芝子实体中分离出两个降血糖有效成分ganoderan B和C，均为糖肽，分子量分别为7 400和5 800。物理化学和化学研究证明，ganoderan B含吡喃葡萄糖酰基β-1→3主链和β-1→6侧链，ganoderan C则含D-吡喃葡萄糖酰基β-1→3和β-1→6连接和D-吡喃半乳糖酰基α-1→6连接。Mizuno等（1986）报告，赤芝子实体经85%乙醇（80℃），热水（100℃），3%草酸铵（100℃）和5%氢氧化钠（30℃）提取后，残渣再用5%氢氧化钠（含0.1%硼氢化钠，80℃），20%氢氧化钠（含0.1%硼氢化钠，30℃）和5%氯化锂（溶于二甲醋酸铵中，70℃）提取，获多糖组分A、B、C。A和B经乙醇分离，醋酸沉淀，Sepharose CL-4B凝胶过滤，得4个β-葡聚糖，其中I和II来自A，III和IV来自B。从C分离出脱乙酰壳多糖（chitosan）（V）。I—V经80%甲酸（85℃）处理可获相应的甲酰化多糖和低分子量多糖。I—IV主要由葡萄糖和少量的糖醛酸、木糖、甘露糖组成，并具β-（1→3）-D-葡聚糖主链和β-（1→6）葡萄糖基侧链，其分子量分别为330 000、60 000、160 000和110 000。不同之处是IV不含木糖，但含1.2%蛋白质。V经酸水解后，主要含葡萄糖胺，并含少量葡萄糖，经红外光谱和X射线分析证明为脱乙酰壳多糖。给小鼠腹腔注射II、III以及III的甲酸酯和I～IV的低分子量多糖均具有宿主中介性的抗肿瘤活性，半数抑瘤量（ID50）分别为42.5mg/kg、34.1mg/kg、70.2mg/kg、22.4mg/kg、17.0mg/kg、32.1mg/kg和25.8mg/kg。Mizuno等（1985）报告，赤芝子实体经水提取后，其残渣经3%草酸铵溶液（100℃）和5%氢氧化钠溶液（30℃）提取后，得2个水不溶多糖A和B。A经真空浓缩、透析、冻干，Shepharose CL-48凝胶过滤，获主要组分C。B用醋酸中和至pH5～6，得酸性异多糖D，加乙醇沉淀得糖蛋白E和另一种异多糖。C由酸性β-D-葡聚糖构成，含葡萄糖77%、葡萄糖醛酸10.3%以及少量的果糖、木糖、甘露糖和半乳糖，分子量10 000～30 000。D的分离程序同A，它含两个主要成分G和H，G和H均为酸性异多糖，分别含葡萄糖92%和95%，葡糖醛酸9.7%和13.0%以及少量果糖、木糖、甘露糖、乳糖，分子量70 000～100 000。给小鼠腹腔注射A—H对S180均具有抗肿瘤活性，50%抑瘤量为（6.3～26.3)mg/kg，但口服无效。1989～1994李荣芷、何云庆等先后报告，赤芝子实体经热水提取，乙醇分部沉淀、透析、除蛋白等步骤得灵芝多糖BN3A、BN3B、BN3C和GL-A、GL-B、GL-C。进一步经DEAE纤维素柱色谱分离，酶解，酸水解，过碘酸氧化，甲酸生成，Smith降解、气相色谱、高压液相色谱分析和光谱分析等从BN3B、BN3C、GL-A、GL-B和GL-C中共分离鉴定了18个灵芝多糖均一体，其中5个肽多糖、4个葡聚糖，其余为杂多糖，其化学结构及分子量见表6-4。

表6-4 灵芝多糖的化学结构和分子量

均一体
化学结构

分子量

BN3B
BN3B1
β（1→6）β（1→3）
葡聚糖
3.50×104

BN3B2
β（1→6）β（1→3）
阿拉伯半乳聚糖
4.00×104

BN3C
BN3C1
β（1→6）β（1→3）
葡聚糖
1.62×104

BN3C2
β（1→6）β（1→3）
肽多糖
2.45×104

GLA
GLA2

肽多糖
0.93×104

GLA4
均以β（1→3）为主
杂多糖
1.33×104

GLA6
含少量β（1→6）及β（1→4）
肽多糖
1.28×104

GLA7
以半乳糖、葡萄糖为主
杂多糖
1.20×104

GLA8

肽多糖
1.48×104

GLB
GLB2
β（1→4）为主，尚有β（1→6）
葡聚糖
0.71×104

GLB3
β（1→4）为主，极少β（1→6）
甘露葡聚糖
0.77×104

GLB4
β（1→4）
杂多糖
0.90×104

GLB6
β（1→4）含乙酰基
杂多糖
0.88×104

GLB7
β（1→4）为主，尚有β（1→6）
杂多糖
0.90×104

GLB9
β（1→4）为主
半乳葡聚糖
0.93×104

GLB10
β（1→4）β（1→6）含乙酰基
杂多糖
0.68×104

GLC
GLC1
β（1→4）少量β（1→6）
肽多糖
0.57×104

GLC2
β（1→4）少量β（1→6）含乙酰基
葡聚糖
0.60×104

Mizuno等（1982）经热水提取，乙醇分部沉淀，并经离子交换色谱，pH依赖的Cetavlon处理、凝胶过滤以及Con A-Sepharose GL-4B亲和色谱等纯化，从人工培养的平盖灵芝菌丝体中得到一个多糖组分。进一步通过甲基化、核磁共振、过碘酸氧化、Smith降解和β-D-葡聚糖酶（β-D-glucanase）分解等技术研究多糖的化学结构。α-葡聚糖组分具有α（1→4）葡萄糖苷主链，主链上每9～12个残基连接α（1→6）支链，该组分仅有微弱抗肿瘤活性。β-葡聚糖组分具有β（1→3）葡萄糖苷主链，主链上每12个残基通过β（1→6）连接一个单糖苷支链。其中之一显示显著的抗小鼠S180活性，50%抑瘤剂量为0.74mg/kg。

Mizuno和Miyasaki等分别从赤芝、平盖灵芝和紫芝加哥提取出具有抗肿瘤活性的多糖。并确证其基本化学结构。

就抗肿瘤活性而言，灵芝多糖并无种间差异，它们和从其他真菌中所获多糖一样，具有以下三个特性：

1.初级结构的分子量在3×105以上。

2.多聚物的连接方式均有β-1-3-D-残基的主链和β-1-6-D-葡萄糖侧链残基。但从不同真菌提取的多糖的β-1-6-D-葡萄糖的分支程度不等，灵芝多糖的主链残基与侧链残基的比例为5∶2，即每个主链残基环绕2个β-1-6-D-葡萄糖残基。无1-6β侧链的1-3-β葡聚糖未见抗肿瘤活性。

3.多糖的三维螺旋结构参与其抗肿瘤活性，此结构遭破坏则影响其活性。 |

⑤ 生物实验方法除了对照实验以外有哪些

cDNA文库

[原理]：

cDNA文库不同于基因组文库，被克隆DNA是从mRNA反转录来源的DNA。CDNA组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列。从而做cDNA克隆时应是先从获得mRNA开始，在此基础上，通过反转录酶作用产生一条与mRNA相互补的DNA链，然后除掉mRNA，以第一条DNA链为模板复制出第二条DNA链（双链）；再进一步把此双链插入原核或真核载体。

cDNA文库的构建

分为六个阶段：

阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链

阶段2：cDNA第二链的合成

阶段3：cDNA的甲基化

阶段4：接头或衔接子的连接

阶段5：Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA

阶段6：cDNA与λ噬菌体臂的连接

[阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链]

1．在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行cDNA第一链的合成：

poly(A)+RNA (1μg/μl) 10μl

寡核苷酸引物(1μg/μl) 1μl

1mol/L Tris-HCl (pH8.0, 37℃) 2.5μl

1mol/L KCl 3.5μl

250 mmol/L MgCl2 2μl

dNTP溶液（含4种dNTP，每种5mmol/L） 10μl

0.1 mol/L DTT 2μl

RNase抑制剂（选用） 25单位

加H2O至 48μl

2．当所有反应组在0℃混合后，取出2.5μl反应液转移到另一个0.5ml微量离心管内。在这个小规模反应管中加入0.1μl [α-32P] dCTP（400 Ci/mmol, 10mCi/ml）。

3．大规模和小规模反应管都在37℃温育1h。

4．温育接近结束时，在含有同位素的小规模反应管中加入1μl 0.25mol/L EDTA，然后将反应管转移到冰上。大规模反应管则在70℃温育10 min，然后转移至冰上。

5．参考《分子克隆实验指南》第三版附录8所述方法，测定0.5μl小规模反应物中放射性总活度和可被三氯乙酸（TCA）沉淀的放射性活度。此外，用合适的DNA分子质量参照物通过碱性琼脂糖凝胶电泳对小规模反应产物进行分析是值得的。

6．按下述方法计算cDNA第一链的合成量（推算方法略）：

[掺入的活度值(cpm)/总活度值]×66(μg)=合成的cDNA第一链(μg)

7．尽可能快地进行cDNA合成的下一步骤。

[阶段2：cDNA第二链的合成]

1．将下列试剂直接加入大规模第一链反应混合物中：